一种人造新冠病毒吞噬细胞的方法

摘要

一种人造新冠病毒吞噬细胞的方法，其特征在于，以DNA重组技术将各单位产前诊断后剩余的羊水间充质干细胞改造为能向新冠病毒感染部位迁移定居、能与宿主细胞竞争将新冠病毒吸入干细胞内、能沉默新冠病毒mRNA在干细胞内转录、能在体外无限传代的兼具干细胞天然治疗功能并获得吞噬细胞趋化、吞噬和杀毒功能的人造新冠病毒吞噬细胞，使之在新冠肺炎治疗中能集中到感染部位，然后分化为既是肺组织细胞又是吞噬细胞的多功能细胞，可应用于将每位新生儿的离体干细胞改造为新冠病毒吞噬细胞，直接用于COVID‑19的防治或用于制备以人造吞噬细胞为载体的能长期稳定表达中和抗体的新冠疫苗，作为出生宝宝奉献给社会的抗新冠礼物收藏于干细胞库备用。

说明书

技术领域

本发明涉及一种人造新冠病毒吞噬细胞的方法，属于生物医学领域的传染病防治技术。

背景技术

新型冠状病毒(SARS-CoV-2)已对全球公众健康构成严重威胁，尚无特效药物。

因干细胞具有定向分化、产生细胞因子、分泌miRNA外泌体、调节免疫、抗纤维化、抑制炎性因子风暴等作用而被试用于治疗COVID-19，已初步表明对重症新冠肺炎具有较好的安全性、有效性及应用前景，但干细胞植入后的存活、定居和效应等问题限制了广泛应用。

目前用于临床治疗的干细胞，国内外主要聚焦在间充质干细胞(MSCs)和自然杀伤细胞 (NK)，其中应用最多的是MSCs。通常间充质干细胞在体外传代至15-30代就会衰老或死亡，而经猿猴病毒40大T抗原基因(SV40LT)转染的细胞系可在体外培养350代以上，并能基本保留原始细胞的分化表型和生物学特性，已广泛应用于人源性肝细胞、血管纹边缘细胞、软骨干细胞等的永生化。说明用这种基因转染技术制备的永生化干细胞，能具备永久生存、无限扩增的性能，可解决干细胞的临床用量、植入存活及收藏备用等问题。

吞噬细胞在特异性和非特异性免疫中具有很大的作用，人体的吞噬细胞通过定向迁移、识别、吞噬和杀伤等环节发挥作用。吞噬细胞在某些病原体及其产物的作用下，分泌趋化因子，向病原体入侵部位聚集和迁移，通过其表面甘露糖受体和脂多糖受体识别病原体及其产物的相应配体，并与之结合，然后通过伪足将较大病原体吞噬入胞内或通过胞膜内陷将较小病原体胞饮入胞内，最后通过吞噬细胞内的溶酶体将病原体杀死。据此，我们可以将间充质干细胞改造为具有定向迁移、识别、吞噬和杀伤功能的吞噬细胞。

文献报道，血管紧张素II(AngII)能通过AngII受体(AT2R)促进表达AT2R的干细胞迁移，而且血管紧张素II(AngII)在损伤的肺组织中呈上调。因此，如果构建AT2R过表达慢病毒载体，通过慢病毒转染将AT2R整合到干细胞DNA，构建AT2R过表达干细胞，这种AT2R 过表达干细胞在新冠肺炎的治疗中，就易于向AngII上调的损伤肺组织迁移、定居。

新型冠状病毒含有刺突蛋白(S)、膜蛋白(M)、包膜蛋白(E)和核壳蛋白(N)，其中S蛋白包括N端的S1亚基和C端的S2亚基，S1亚基由N端的结构域(S1-NTD)和受体结合域 (S1-RBD)组成，S1-RBD负责识别并结合细胞表面受体血管紧张素转换酶2(ACE2)，S2亚基介导病毒包膜和宿主细胞膜融合，使病毒通过受体ACE2进入细胞从而引起感染。因此，如果构建慢病毒载体，通过慢病毒转染将ACE2整合到干细胞DNA上表达，则新冠病毒更易通过 ACE2进入这种过表达ACE2的干细胞，这种干细胞产生了吞噬细胞吞噬病毒的功能。

RNA干扰(RNAi)是指特异性沉默外源基因的抗病毒作用。当将外源靶基因整合到宿主细胞基因组时，外源靶基因能利用宿主细胞转录dsRNA，dsRNA被宿主细胞质中的核酸内切酶 (Dicer)切割成具有特定长度和结构的多个小片段siRNA(大约21～23bp)，siRNA在细胞内RNA解旋酶的作用下解链成正义链和反义链，由反义siRNA与体内的内切酶、外切酶和解旋酶结合，形成RNA诱导的基因沉默复合物(RISC)。当外源基因入侵宿主细胞时，RISC与外源基因表达的mRNA的同源序列特异性结合，在结合部位切割同源mRNA，被切割的断裂mRNA 随即降解，从而诱发宿主细胞针对外源mRNA的降解作用。因此，如果将新冠病毒靶向干扰基因(shRNA)整合到干细胞DNA上表达，则这种干细胞能抑制新冠病毒在胞内复制。

但未见将具有趋化功能的AT2R、具有吸入病毒功能的ACE2、具有RNA干扰功能的shRNA 整合到永生化干细胞DNA以制成具有向病毒感染部位迁移定居、吞噬吸入病毒、抑制胞内病毒复制功能的人造新冠病毒吞噬细胞的文献报道。

发明内容

鉴于目前治疗重症COVID-19的世界性难题，本发明人提出了本发明。

本发明的目的是要公开一种人造吞噬细胞及其方法，即将炎症趋化基因AT2R、新冠病毒受体基因ACE2和新冠病毒RNA干扰基因shRNA整合到永生化干细胞DNA上，构建既保留干细胞的天然功能又获得吞噬细胞的趋化、吞噬和杀毒功能的人造新冠病毒吞噬细胞。

本发明的目的通过以下技术方案实施：首先，采集产前诊断后剩余羊水细胞，分离羊水成纤维细胞，转染SV40LT基因，以G418筛选永生化羊水细胞系，经细胞系生物学特性鉴定和干细胞标志物检测，获得永生化羊水间充质干细胞系(MSC-SV40LT)。

进而，给MSC-SV40LT装配AT2R：根据人MSC cDNA扩增AT2R基因(NM_000686.4；1192bp)， PCR引物正义链为5’-GAGGATCCCCGGGTACCGGTCGCCACCATGAAGGGCAACTCCACCCTTG-3’，反义链为5’-TCCTTGTAGTCCATACCAGACACAAAGGTCTCCATTTC-3’，扩增产物经纯化和酶切，用T4 DNA 连接酶与载体GV358(Ubi-MCS-3FLAG-SV40-GFP-IRES-puromycin)连接，构建表达AT2R的重组慢病毒载体GV358-AT2R，经感受态大肠杆菌转化、PCR和测序鉴定后，与包装质粒共转染293T细胞，包装携带AT2R的重组慢病毒Lentiviral-AT2R，转染干细胞，使AT2R基因整合到干细胞DNA上，用嘌呤霉素筛选，获得过表达AT2R的干细胞(MSC-AT2R)。

进而，给MSC-AT2R装配新冠病毒易感基因：将血管紧张素转换酶II(ACE2)基因连接到慢病毒表达载体pHBLV-CMV-ACE2-EF1-ZsGreen-T2A-puro或pGC-FU中，分别构建重组质粒 pHBLV-OE-ACE2或pGC-FU-ACE2，将重组质粒pHBLV-OE-ACE2和包装质粒(psPAX2和pMD2G) 或将重组质粒pGC-FU-ACE2和包装质粒(pHelper1.0和pHelper2.0)分别共转染293FT细胞，包装携带ACE2的重组慢病毒Lentiviral-ACE2，将Lentiviral-ACE2转染干细胞，使ACE2 整合到干细胞DNA上，获得同时表达AT2R和ACE2的干细胞(MSC-AT2R/ACE2)。

进而，给MSC-AT2R/ACE2装配新冠病毒RNA干扰基因：设计和优选病毒靶向干扰序列 siRNA，合成模板shRNA，连接慢病毒载体pHBLV或LV3，构建重组质粒pHBLV-shRNA或LV3-shRNA，将pHBLV-shRNA和包装质粒(pHBLV、psPAX2载体和pMD2G载体)或将LV3-shRNA和包装质粒(pLV/helper-SL3、pLV/helper-SL4和pLV/helper-SL5)共转染293T细胞，分别包装携带shRNA的慢病毒Lentiviral-shRNA，将慢病毒转染干细胞，使shRNA整合到干细胞DNA上，获得同时表达AT2R、ACE2和shRNA的干细胞(MSC-AT2R/ACE2/shRNA)。

进而，验证基因改造人工吞噬细胞的功能，收藏于COVID-19防治干细胞库，用于COVID-19 的个体化治疗，或用于替代传统腺病毒载体、制备新冠病毒干细胞载体疫苗。

本发明的有益效果在于：

为干细胞来源开辟新的途径。临床使用的干细胞来源困难，而各级产前诊断中心每天有大量的诊断后剩余羊水细胞被废弃，这是一个被严重忽视的不可再生利用问题。本发明将废弃羊水细胞转化为人造新冠病毒吞噬细胞，收藏于干细胞库，临用时复苏细胞，扩增培养到所需要量时按自身或同型选用，进行个体化治疗。本发明能应用于脐带、脐带血、胎盘组织等样本，实现从源头采样、基因改造、备用于干细胞库，既是COVID-19防控预案，也是备送给出生宝宝的“抗新冠礼物”，或是出生宝宝奉献给社会的“抗新冠礼物”。

将产前诊断后废弃的羊水间充质干细胞改造为治疗COVID-19的人造吞噬细胞。在干细胞 DNA整合SV40LT基因，解决了干细胞永久生存、无限扩增和超低温收藏问题；在干细胞DNA 整合AT2R基因后获得MSC-AT2R，因新冠肺炎时炎症组织会产生大量的AngII，AngII与AT2R 能相互结合吸引，所以AngII能通过携带AT2R干细胞表达的AT2R将干细胞吸引到炎症肺组织，发挥吞噬细胞的趋化作用，使MSC-AT2R向炎症部位迁移、定居，并分化为肺组织细胞；在干细胞DNA整合ACE2基因后获得MSC-ACE2，因ACE2是新冠病毒的受体，所以MSC-ACE2 能与宿主细胞竞争将新冠病毒吸入干细胞内，发挥吞噬细胞的吞噬作用从而竞争抑制宿主细胞感染，且表达的ACE2能封闭RBD受体；在干细胞DNA整合shRNA基因后获得MSC-shRNA，因shRNA表达的siRNA能靶向干扰新冠病毒mRNA，所以MSC-shRNA能抑制病毒在干细胞内复制。总之，通过在干细胞DNA整合AT2R、ACE2和shRNA后获得的MSC-AT2R/ACE2/shRNA，在保持干细胞天然治疗功效的基础上，产生了更易向炎症部位迁移定居、更易吞噬病毒、更易杀灭胞内病毒的功效，即产生了吞噬细胞的功能。这种人造吞噬细胞移植炎症肺组织并定向分化后，既具有相应肺组织细胞的天然功能又具有吞噬细胞的杀灭新冠病毒功能。

附图说明

图1是本发明所述的以G418筛选得到的永生化干细胞(MSC-SV40LT)克隆图。

图2是MSC-SV40LT的传代培养图。

图3是MSC-AT2R/ACE2与分离的病毒共培养72小时的细胞生长状态。

图4是MSC-AT2R/ACE2/shRNA与分离的病毒共培养72小时的细胞生长状态。

在图1中，因被SV40LT转染的MSC-SV40LT不会被G418杀死而存活，存活的单个细胞生长后形成细胞克隆。

在图2中，被SV40LT转染的MSC-SV40LT在传代中呈梭形贴壁生长，生长旺盛。

在图3中，可见MSC-AT2R/ACE2呈圆形、漂浮、死亡状态，说明细胞内ACE2基因的表达有利于将病毒吸入胞内并在胞内繁殖、致细胞不易生长、易于死亡。

在图4中，可见MSC-AT2R/ACE2/shRNA仍呈梭形贴壁生长，说明shRNA的表达能干扰病毒在胞内复制，使携带ACE2和shRNA的干细胞能杀灭被吸入胞内的病毒。

具体实施方式

下面结合附图，对本发明的具体实施方法作详细的描述，但这些为启发公共投入研究的范例性描述并不对本发明的权利要求所限定的保护范围构成任何限制。

1.间充质干细胞(MSC)的采集

1.1.羊水间充质干细胞的采集

按产前诊断流程采集待检孕妇的羊水细胞，进行细胞培养和产前诊断，在倒置显微镜下从产前诊断后剩余的羊水细胞中筛选出贴壁生长的梭形间充质干细胞。

1.2.脐带间充质干细胞的采集

从液氮罐中取出冻存的脐带，置37℃水浴快速解冻，以无菌PBS清洗，去除残留的血迹，将脐带剪成大小约1mm

1.3.肺间充质干细胞的采集

无菌取流产胎儿肺脏组织，机械离散，0.25％胰蛋白酶消化后，用孔径为100μm的纱布过滤，1000r/min离心5min，弃上清液，添加DMEM培养液(0.1umolβ-巯基乙醇，100UI/mL青链霉素，10％胎牛血清)。在37℃、5％CO

2.间充质干细胞的永生化(构建MSC-SV40LT)

2.1.SV40LT/pLXSN的构建

以SV40 DNA(strain 766)为模板，上游引物为5’-GCCCAGGATCCTTAACAACAACAACAAT-3’，下游引物为5’-ACGCTGAATTCCCTCTGAGCTAT-3’，进行SV40 LT高保真长片段的PCR扩增；SV40 LT的PCR产物与pLXSN反转录病毒载体均经EcoR I/BamH I酶切、连接、转化、筛选和测序验证，获得含SV40LT/pLXSN重组反转录病毒载体。

2.2.将SV40LT转染间充质干细胞

将待转染的间充质细胞配成约8×10

2.3.MSC-SV40LT的鉴定

2.3.1.MSC-SV40LT的生物学特性鉴定

包括①细胞系为梭形、成纤维状。②Western检测可见分别在相对分子质量为120000和 93000处出现白色条带。③细胞系的生长曲线呈典型的“S”生长特征。④细胞系的染色体核型为二倍体。⑤细胞系不能在软琼脂中生长。⑥裸鼠致瘤试验呈阴性。

2.3.2.MSC-SV40LT的表面分子检测

用流式细胞仪检测细胞膜表面分子，阳性分子包括CD73-APC、CD90-FITC、CD44-PE、 CD105-Cy5.5；阴性分子包括CDllb-PE、CD19-PE、CD34-PE、CD45-PE、HLA-DR-PE。通过鉴定，获得能在体外永久传代的永生化间充质干细胞。图2为传至第35代的永生干细胞。

2.3.3.永生肺干细胞(肺MSC-SV40LT)的鉴定

人肺干细胞系需符合：①相差显微镜观察：呈梭形生长，排列成漩涡或栏栅状。②流式细胞仪检测：细胞表面标志物CD45、CDl 1a、CDl4、CD90、CD34、CD71、CD25、CDl05、CDll7、 CDl66和CD44为阳性。③共聚焦技术检测：角蛋白表达呈阴性，干性相关因子c-Myc、Oct4、 Nanog和Nestin呈阳性。④间接免疫荧光检测：波形蛋白、III型胶原、纤维连接蛋白表达呈阳性，而表面活性蛋白C前体、血管性血友病因子及α平滑肌肌动蛋白表达呈阴性。

3.永生化干细胞的AT2R基因装配(构建MSC-AT2R)

3.1.慢病毒表达载体(GV358-AT2R)的构建及慢病毒包装

设计PCR引物正义链5’-GAGGATCCCCGGGTACCGGTCGCCACCATGAAGGGCAACTCCACCCTTG-3’和反义链5’-TCCTTGTAGTCCATACCAGACACAAAGGTCTCCATTTC-3’，根据人MSC cDNA扩增AT2R基因 (NM_000686.4；1192bp)，PCR扩增产物经电泳纯化和酶切，用T4 DNA连接酶与线性化的载体GV358(Ubi-MCS-3FLAG-SV40-GFP-IRES-puromycin)连接，构建表达AT2R的重组慢病毒表达载体GV358-AT2R，经感受态大肠杆菌转化、PCR和测序鉴定后，与包装质粒共转染293T 细胞，转染后8h更换为完全培养基，继续培养48h后，收集富含慢病毒的细胞上清液，4℃， 4000g离心10min，再以0.45μm滤器过滤上清液，除去细胞碎片，离心，得到高滴度的慢病毒原液。将所得慢病毒原液感染293T细胞，4d后抽提RNA，Real-Time PCR测定慢病毒滴度，获得携带AT2R的重组慢病毒(Lentiviral-AT2R)。

3.2.Lentiviral-AT2R转染MSC-SV40LT

以每孔1×10

3.3.MSC-AT2R的AT2R基因检测

3.3.1.RT-PCR检测AT2R的mRNA转录水平

以1×10

3.3.2.Western-Blot检测AT2R的蛋白表达

抽提各组细胞裂解液的蛋白，BAC法蛋白定量，每组设置3个随机复孔。用10％SDS-PAGE 分离样品蛋白质，电转至硝酸纤维素膜上，以1∶400稀释的抗VDR抗体为一抗，用ECL化学发光试剂盒显像，用凝胶图像分析系统确定各蛋白条带的相对灰度值。观察MSC-AT2R的蛋白表达量是否比对照组增加，筛选AT2R高效表达的MSC-AT2R。

4.MSC-AT2R的ACE2基因装配(构建MSC-AT2R/ACE2)

4.1.慢病毒表达载体pHBLV-ACE2或pGC-FU-ACE2的构建和鉴定

PCR扩增质粒pc-DNA3.1-hygro(+)-mACE2中的ACE2(或从肺组织细胞中提取RNA，逆转录为cDNA，再PCR扩增ACE2)。根据GenBank的人ACE2 mRNA序列，设计PCR引物序列，人ACE2扩增的外端引物：F1(F out)5’-GAT GGA GTA CCG ACT GGA GTC-3’，R1(Rout)5’-CTAATA TCG ATG GAG GCA TAA-3’，产物547bp；内端引物：F2(F in)5’-GAG GAG GAT GTG CGAGTG GCT A-3’，R2(R in)5’-CCA ACC ACT ATC ACT CCC ATC A-3’，产物269bp。人β -actin的扩增引物序列：F 5’-GCT CGT CGT CGA CAA CGG CTC-3’，R 5’-CAA ACA TGA TCTGGGTCATCTTCT-3’，产物353bp。PCR条件：94℃5min，然后94℃变性30s、55℃退火30s、 68℃延伸5min，循环30次，最后于68℃延伸10min。

用BamHI和EcoRI分别酶切载体pHBLV-CMV-ACE2-EF1-ZsGreen-T2A-puro和上述PCR产物，或用AgeI和EcoRI分别酶切pGC-F和上述PCR产物，用琼脂糖电泳纯化，将线性化的载体DNA、酶切回收的PCR产物、T4噬菌体DNA连接酶及其缓冲液、ddH20置16℃连接过夜，将连接液转化感受态细胞，阳性克隆用PCR和测序鉴定。用LB培养液扩增转化菌，用质粒提取试剂盒提取pHBLV-ACE2-OE或pGC-FU-ACE2，采用Lipofectamine 2000转染293FT细胞，转染72h后用Western-Blot检测ACE2基因的表达。

4.2.携带ACE2慢病毒的包装及其滴度测定

将慢病毒表达载体(pHBLV-ACE2)、包装质粒(psPAX2载体和pMD2G)或将pGC-FU-ACE2、包装质粒(pHelper 1.0和pHelper 2.0)分别共转染293T细胞，获得携带ACE2基因的重组慢病毒(Lentiviral-ACE)。同时将pHBLV空载(含GFP基因)、包装质粒(psPAX2载体和pMD2G) 共转染另一组293T细胞，所获得的仅携带GFP基因的空载体(NC-GFP)作为对照。

转染后8h更换为完全培养基，培养48h后，收集富含慢病毒的细胞上清液，4℃，4000 g离心10min，再以0.45μm滤器过滤上清液，除去细胞碎片，离心，得到高滴度的慢病毒。以待鉴定的慢病毒原液感染293T细胞，4d后抽提RNA，Real-Time PCR测定慢病毒滴度。

4.3.Lentiviral-ACE转染MSC-AT2R

以每孔1×10

4.4.MSC-AT2R/ACE2的ACE2基因检测

4.4.1.RT-PCR检测ACE2基因的mRNA转录

以1×10

4.4.2.Western-Blot检测ACE2的蛋白表达

抽提各组细胞裂解液的蛋白，BAC法蛋白定量，每组设置3个随机复孔。用10％SDS-PAGE 分离样品蛋白质，电转至硝酸纤维素膜上，以1∶400稀释的抗VDR抗体为一抗，用ECL化学发光试剂盒显像，用凝胶图像分析系统确定各蛋白条带的相对灰度值。观察试验组和对照组的ACE2蛋白表达，筛选ACE2高效表达的MSC-AT2R/ACE2。

5.MSC-AT2R/ACE2的RNA干扰基因装配

5.1.设计新冠病毒的siRNA基因

以Ambion公司(

表1A NC_045512.2株新冠病毒S、E、M、N基因的siRNA候选序列表

5.2.合成shRNA模板

靶序列确定以后，根据慢病毒干扰载体pHBLV-U6-MCS-CMV-ZsGreen-PGK-PURO的多克隆酶切位点，设计shRNA模板，使每个模板由两条大部分互补的长度为52-60nt的单链DNA构成，寡核苷酸单链DNA的3’端有2-5个U字形突出，包括靶序列的正义序列、loop序列、靶序列的反义序列、转录终止信号以及酶切后的粘性末端序列，经退火互补后能形成带有BamH I和ECORI酶切位点粘性末端的DNA双链(如用pSilencer4.1.CMV.neo，则用BamH I和Hind III)。如表1B，“斜体”表示酶切位点，“加粗”表示茎环结构，“

表1B 以表1A中的siRNA合成S、E、M、N基因相对应的shRNA模板

5.3.慢病毒干扰载体的构建

以新冠病毒N基因的靶向干扰序列(nCoV-N-siRNA-1/2/3)作为实施例，以T4连接酶将合成的shRNA模板与线性化的慢病毒载体pHBLV-U6-MCS-CMV-ZsGreen-PGK-PURO连接，构建慢病毒干扰载体pHBLV-nCoV-N-shRNA1/2/3，转化感受态E.coli DH5α。

5.4.慢病毒干扰载体的鉴定

取慢病毒干扰载体转化的感受态E.coli DH5α10μL，涂布于含50μg.mL

5.5.携带shRNA慢病毒的包装

取对数生长期的293FT细胞，以5×10

5.6.慢病毒滴度的检测

①孔稀释法计数荧光细胞：取慢病毒原液10μL，用10％FBS的DMEM培养液10倍稀释为3-5个梯度，将293 FT细胞按每孔3×10

5.7.慢病毒转染MSC-AT2R/ACE2(构建MSC-AT2R/ACE2/shRNA)

以每孔1×10

5.8.筛选转染阳性的MSC-AT2R/ACE2/shRNA

上述细胞培养24h后更换10％FBS的DMEM液，并加入最佳筛选浓度的嘌呤霉素(2.00μ g·mL

5.9.验证MSC-AT2R/ACE2/shRNA的shRNA表达

5.9.1.RT-PCR检测shRNA的mRNA表达

用Trizol试剂分别提取MSC-AT2R/ACE2/shRNA的nCoV-N-shRNA1、nCoV-N-shRNA2和 nCoV-N-shRNA3组的总RNA，以GAPDH为内参照，设计表2所示的引物，定量分析 nCoV-N-shRNA1/2/3的mRNA，PCR条件为：95℃3min变性，95℃12s，62℃40s，72℃30s，共40个循环。每组均设3个随机复孔。反应结束后，仪器自动记录每个样品管中Ct值，以 GAPDH为内参照，计算目的基因的相对含量，用2

表2 新冠病毒S、E、M、N基因靶向干扰序列siRNA1～siRNA3扩增引物设计表

5.9.2.Western Blotting检测shRNA的蛋白表达

①抽提各组细胞裂解液的蛋白，BAC法蛋白定量，每组设置3个随机复孔。用10％SDS-PAGE 分离样品蛋白质，电转至硝酸纤维素膜上，以1∶400稀释的抗VDR抗体为一抗，用ECL化学发光试剂盒显像，用凝胶图像分析系统确定各蛋白条带的相对灰度值。②观察空白对照组、阴性对照组的pHBLV-nCoV-N蛋白表达量以及pHBLV-nCoV-N-shRNA1、pHBLV-nCoV-N-shRNA2 和pHBLV-nCoV-N-shRNA3组这3个干扰组中重组慢病毒pHBLV-nCoV-N蛋白的表达量，与阳性对照组和空白对照组间有无统计学差异。③结果为pHBLV-nCoV-N-shRNA2组能有效干扰 nCoV-N基因的蛋白表达。

本发明涉及的载体还包括过表达载体如pHBLV-CMV-IRES-ZsGreen、pHBLV-CMV-EF1-RFP、、 pHBLV-CMV-IRES-Puro、pHBLV-IRES-ZsGreen-PGK-puro、pHBLV-CMVIE-ZsGreen-T2A-Puro、pHBLV-CMVIE-RFP-T2A-Puro、pHBLV-CMVIE-Luc-T2A-Puro、pHBLV-CMVIE-ZsGreen-T2A-Luc、 pGC-FU，干扰载体如pHBLV-U6-ZSGreen、pHBLV-U6-ZSGreen-puro、pHBLV-U6-Puro、 pHBLV-U6-ZsGreen-T2A-Puro、pHBLV-U6-RFP-T2A-Puro、pHBLV-U6-Luc-T2A-Puro、 pHBLV-U6-RFP、pHBLV-U6-ZsGreen-T2A-Luc、pHBLV-U6-RFP-T2A-luc，干扰过表达双框架载体如pHBAd-U6-CMV(用于构建同时表达两种基因的重组载体，例如表达shRNA和ACE2的 pHBAd-U6/shRNA-CMV/ACE2、表达shRNA和RBD的pHBAd-U6/shRNA-CMV/RBD)。

5.9.3.验证MSC-AT2R/ACE2/shRNA的AT2R和ACE2基因表达

同上以RT-PCR和Western Blotting再次检测MSC-AT2R/ACE2/shRNA的AT2R和ACE2基因表达，以确认所有敲入基因表达水平，筛选均高效表达的MSC-AT2R/ACE2/shRNA。

6.MSC-AT2R/ACE2/shRNA的功能检测

6.1.MSC-AT2R/ACE2/shRNA体外抗病毒功能检测

6.1.1.样本采集

取COVID-19确诊患者的咽拭，按100∶1的比例加入双抗(10000IU的青霉素和10000μg 的链霉素)，使青霉素和链霉素的终浓度分别为100IU和100μg，置4℃过夜，备用。

6.1.2.病毒培养和分离

将Vero-E6接种至含(10％胎牛血清)DMEM培养液的12.5cm

6.1.3.MSC-AT2R/ACE2/shRNA与病毒共培养

设立MSC组、MSC-SV40LT组、MSC-AT2R/ACE2组、MSC-AT2R/ACE2/shRNA组，每组接种12孔板，使每孔含有2×10

6.1.4.实时荧光RT-PCR检测病毒RNA

核酸提取试剂盒(批号：2019004)、2019新型冠状病毒(ORF1ab/N)核酸检测试剂盒(批号：20200123)和DA3200核酸提取仪，购自中山大学达安基因股份有限公司，ABI 7500型PCR 仪器购自美国Thermo Fisher Scientific。按试剂盒说明书操作，扩增反应条件为：50℃15min； 95℃15min；94℃15s；55℃45s；共45个循环，在55℃采集荧光信号。

根据试剂盒说明，结果判断标准如下：①如果检测样本在ORF1ab和N基因通道无扩增曲线或Ct值＞38，判为SARS-CoV-2阴性；②如果检测样品在ORF1ab和N基因通道Ct值≤38，且有明显的扩增曲线，判为SARS-CoV-2阳性；③如果检测样品在ORF1ab或者N基因通道Ct值≤38，另一通道无扩增曲线，复检结果与原来结果一致，判为SARS-CoV-2阳性。

6.1.5.病毒RNA检测反映抗病毒效果

表3～8的RNA检测结果反映ACE2的吞噬病毒和shRNA的抑制病毒作用。在表3中，当干细胞和病毒混合培养1小时后，其培养液病毒RNA检测阳性的稀释度均为1∶4，被认为是外源加入到培养液中的病毒在基本未复制时的检测结果。在表4～5中，当干细胞和病毒混合培养6小时后，MSC-AT2R/ACE2/shRNA组培养液和细胞内RNA检测阳性的稀释度均为1∶4、MSC-AT2R/ACE2组培养液和细胞内RNA检测阳性的稀释度分别为1∶4和1∶36、另外两组均为1∶12，说明表达ACE2的干细胞能吸入(吞噬)病毒，使培养液中的病毒含量偏低而细胞内的病毒含量偏高，但因shRNA的抑制病毒作用而不增加胞内病毒含量。在表6～8中，当4 组干细胞培养24～72小时后，仍以MSC-AT2R/ACE2/shRNA组的RNA检测结果阳性滴度最低 (1∶12～36)，而以MSC-AT2R/ACE2组的胞内RNA检测阳性滴度最高(＞1∶8748)，而且因胞内病毒的释放而增加培养液的病毒含量，说明MSC-AT2R/ACE2中的ACE2能促进病毒进入干细胞内并在胞内复制，而MSC-AT2R/ACE2/shRNA中的shRNA能干扰胞内病毒复制。

表3 干细胞与分离的新冠病毒共培养1小时培养液中病毒RNA检测结果

表4 干细胞与分离的新冠病毒共培养6小时的培养液病毒RNA检测结果

表5 干细胞与分离的新冠病毒共培养6小时的细胞内病毒RNA检测结果

表6 干细胞与分离的新冠病毒共培养24小时培养液的病毒RNA检测结果

表7 干细胞与分离的新冠病毒共培养72小时培养液的病毒RNA检测结果

表8 干细胞与分离的新冠病毒共培养72小时的细胞内病毒RNA检测结果

6.1.6.MSC与病毒共培养结果反映其抗病毒效果

以MSC与病毒共培养检测其抗病毒效果。MSC-AT2R/ACE2组在培养72小时后细胞变圆、漂浮、死亡(图3)，说明细胞内ACE2基因的表达有利于将病毒吸入胞内并在胞内繁殖、致细胞较快死亡；而MSC-AT2R/ACE2/shRNA组在培养72小时后仍呈贴壁生长(图4)，说明其中ACE2和shRNA的表达能将病毒吸入胞内并在胞内杀灭。

6.2.MSC-AT2R/ACE2/shRNA的动物体内抗病毒检测

6.2.1.MSC-AT2R/ACE2/shRNA的准备

取MSC-AT2R/ACE2/shRNA接种于10％FBS的DMEM完全培养液中进行细胞培养，每隔两三天更换培养液1次；5d左右细胞铺满瓶底约90％，0.25％胰酶消化2～3min，800r/min，离心半径12cm，离心5min，按1∶2接种于75cm

6.2.2.实验动物的分组

选择6-8周龄、40克左右的SPF级雌性BALB/c小鼠，随机分为MSC-AT2R/ACE2/shRNA组(用于感染NC_045512.2株、接种MSC-AT2R/ACE2/shRNA)、MSC-AT2R/ACE2组(用于感染NC_045512.2株、接种MSC-AT2R/ACE2)、MSC-AT2R组(用于感染NC_045512.2株、接种 MSC-AT2R)，另设MSC-SV40LT组(用于感染NC_045512.2株、接种MSC-SV40LT)、阳性对照组(用于感染NC_045512.2株、接种生理盐水)和阴性对照组(仅接种生理盐水)。

6.2.3.实验动物的感染和接种

MSC-AT2R/ACE2/shRNA组、MSC-AT2R/ACE2组、MSC-AT2R组、MSC-SV40LT组和阳性对照组分别经鼻腔喷雾接种40μl的NC_045512.2株病毒液，滴度为10

6.2.4.试验结果的检测

①RT-PCR检测

按Trizol法取200μl DMEM制成的处死小鼠肺组织匀浆标本，加入800μl Trizol，室温放置5min使蛋白彻底的裂解，加入氯仿200μl，用手剧烈震荡15sec，室温放置3min，4℃， 12,000g离心15min，取上清至新的Eppendorf管，加入0.5ml异丙醇，室温放置10min， 4℃，12,000g离心10min，弃上清，加入75％乙醇1ml，4℃，7，500g离心5min，弃上清，再重复漂洗1次，以30μl DEPC处理过的水溶解沉淀。按试剂盒进行引物设计、PCR扩增和产物电泳，为了比较不同实验组病毒复制量的不同，可同时扩增宿主基因β-actin作为内参，将目的基因与内参基因表达水平灰度值的比值作为各样品病毒的半定量分析。

②细胞病变效应(CPE)观察

将-70℃冰冻的肺组织解冻后用DMEM制成10％匀浆，3,000rpm离心20min，取100pl上清接种于长成单层VeroE6细胞的24孔培养板上，每份标本接种2个孔，37℃吸附1h，然后吸出标本液，用PBS(加2％双抗)洗3遍后加DMEM补充至1.5ml，置37℃、5％CO

③间接免疫荧光检测

将出现病变效应(CPE)的VeroE6细胞用胰酶消化和PBS清洗，按每孔10μl(10

④细胞培养半数感染量(TCID

取每只处死小鼠(每组10只)肺组织匀浆上清100μl，以10倍递次稀释法稀释成不同的稀释度，分别接种经Hank氏液洗3次的组织培养单层VeroE6细胞96孔培养板，每孔细胞接种30μl，每个稀释度接种4个细胞孔，轻微振荡，使匀浆与细胞充分接触，放37℃吸附1min，以Hank氏液洗3次，加入细胞维持液，放37℃CO2培养箱培养，在普通倒置显微镜下观察记录细胞病变情况，连续观察10-14天，分别计算各组VeroE6细胞半数感染量(TCID

表9 MSC-AT2R/ACE2/shRNA组10只处死小鼠肺组织匀浆致VeroE6半数感染量的百分率

表10 MSC-AT2R/ACE2组10只处死小鼠肺组织匀浆致VeroE6半数感染量的百分率

表11 MSC-AT2R组10只处死小鼠肺组织匀浆致VeroE6半数感染量的百分率

表12 MSC-SV40LT组10只处死小鼠肺组织匀浆致VeroE6半数感染量的百分率

表13 阳性对照组10只处死小鼠肺组织匀浆致VeroE6半数感染量的百分率

表14 阴性对照组10只处死小鼠肺组织匀浆致VeroE6半数感染量的百分率

6.3.MSC-AT2R/ACE2/shRNA产生的ACE2-Ab的抗病毒作用

6.3.1.MSC-AT2R/ACE2/shRNA产生的ACE2-Ab的检测原理

应用双抗原夹心法测定人血管紧张素转化酶2抗体(ACE2-Ab)。以hACE2包被微孔板，然后加入ACE2-Ab，再加HRP标记的hACE2，形成抗原-抗体-酶标抗原复合物，经过洗涤、底物TMB显色，转化成蓝色，颜色的深浅和样品中的ACE2-Ab呈正相关，用酶标仪测定450nm吸光度(OD)，通过标准曲线计算ACE2-Ab的浓度。

6.3.2.MSC-AT2R/ACE2/shRNA产生的ACE2-Ab的检测方法

按说明书制备100U/L、50U/L、25U/L、12.5U/L、6.25U/L的标准品。分别设空白孔、标准孔、待测样品孔(设3复孔)和对照孔(设3复孔)，在标准孔中准确加各标准品 50μl，在待测样品孔中加样品稀释液40μl、再加待测样品(接种重组干细胞小鼠的肺组织匀浆上清液)10μl，在对照孔中加对照样品(接种干细胞小鼠的肺组织匀浆上清液)轻轻晃动混匀。用封板膜封板后置37℃温育30分钟。小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。每孔加入酶标试剂 50μl，空白孔除外。再用封板膜封板后重复上述操作，然后每孔先加入显色剂A 50μl，再加入显色剂B 50μl，轻轻混匀，37℃避光显色15分钟。终止反应，以空白调零， 450nm波长测量各孔的OD值。以标准品的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，绘制标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度。

6.3.3.MSC-AT2R/ACE2/shRNA产生的ACE2-Ab的检测结果

由表15可知，接种MSC-AT2R/ACE2/shRNA(携带ACE2基因)组小鼠的肺组织匀浆ACE2-Ab 显著高于接种干细胞(不携带ACE2基因)组小鼠的肺组织匀浆ACE2-Ab。说明接种MSC-AT2R/ACE2/shRNA后，其中的ACE2基因能表达蛋白，进而刺激小鼠产生ACE2-Ab。

表15 接种基因改造干细胞组小鼠和接种干细胞组小鼠的ACE2-Ab检测结果比较

6.3.4.ACE2-Ab的抗病毒检测

①将ACE2-Ab(兔抗ACE2抗体)和ACE1-Ab(兔抗ACE1抗体)分别配成0.05、0.5、5、50和100ug/ml，然后分别与1×10

②分别用2mL DMEM培养液(10％FBS)混悬细胞，移入12孔板，每孔加入20uL 10

③用台盼蓝染色法计数1000个细胞中的活细胞和死细胞数目，计算细胞成活率(成活率＝未染色的细胞数/观察的细胞总数，也可用RT-PCR检测培养液或细胞的病毒RNA含量)。

④结果发现，当试验组的ACE2-Ab浓度分别为0.05、0.5、5、50和100ug/ml时，相应的细胞成活率分别为50％、60％、70％、75％和85％；而当对照组的ACE1-Ab浓度分别为0.05、 0.5、5、50和100ug/ml时，相应的细胞成活率均为10～15％。

说明MSC-AT2R/ACE2/shRNA携带的ACE2能表达ACE2蛋白，进而刺激机体产生ACE2-Ab，而ACE2-Ab具有抗病毒作用。

6.4.MSC-AT2R/ACE2/shRNA产生的细胞因子的抗炎症作用

当机体受病毒或细菌感染时，会产生各种细胞因子，有些细胞因子具有抗炎作用，而有些细胞因子具有致炎作用。本实验以细菌内毒素(LPS)分别处理各试验组细胞8小时(表 16)，然后按酶联免疫吸附测定(ELISA))试剂盒说明，采用双抗体夹心法测定培养细胞上清液的人白细胞介素，结果发现，MSC-SV40LT组经LPS处理后，其IL-1β和IL-8均明显增加，而IL-10未见明显增加；MSC-AT2R/ACE2/shRNA组经LPS处理后，其IL-1β和IL-8均未见明显增减，而IL-10可见明显增加。

文献报道，IL-1β和IL-8均为致炎细胞因子。其中IL-1β广泛参与人体组织破坏、水肿形成等病理损伤过程，虽可促进β防御素-4的生成，但总体上破坏大于防御。而IL-8通过趋化中性粒细胞、激活中性粒细胞溶酶体酶活性和吞噬作用，达到杀菌和损伤细胞的目的，IL-8主要促进细胞毒、局部炎症和肿瘤细胞增殖。

IL-10的作用不同于IL-1β和IL-8。IL-10是一种重要的抗炎因子，主要通过抑制单核、巨噬细胞等产生致炎因子和趋化因子而发挥抗炎作用。MSC-AT2R/ACE2/shRNA能在LPS的作用下，通过增加IL-10的分泌而抑制炎症反应(表16)。

表16 MSC-AT2R/ACE2/shRNA的抗炎症细胞因子检测结果

6.5.MSC-AT2R/ACE2/shRNA的趋化功能检测方法

用荧光标记(GFP)载体构建的重组载体或慢病毒，转染MSC后，获得的MSC-SV40LT、MSC-AT2R、MSC-AT2R/ACE2、MSC-AT2R/ACE2/shRNA在特定条件下能发出荧光。所以，分别用上述基因改造干细胞进行肺移植并于1～2周处死的小鼠可以离体光学成像检测其肺脏或以荧光显微镜检测其肺组织中的荧光信号，根据荧光信号强度换算不同MSC在小鼠肺组织的迁移、定居或存活率，评估MSC的体内迁移趋化功能。

本发明对表达AT2R的MSC在AngII作用下的体外迁移作了初步检测。首先将MSC-SV40LT、 MSC-AT2R、MSC-AT2R/ACE2和MSC-AT2R/ACE2/shRNA分别配成2～3×10

7.MSC-AT2R/ACE2/shRNA的应用

人造新冠病毒吞噬细胞，如MSC-AT2R、MSC-AT2R/ACE2和MSC-AT2R/ACE2/shRNA，因表达AT2R、ACE2和/或shRNA而分别产生相应的迁移趋化、吸附吞噬和/或基因沉默的类吞噬细胞功能。可按姓名、ABO血型或HLA分型冻存于COVID-19防控干细胞库，当新冠病毒流行时，从干细胞库中取出进行培养扩增，然后按自身或同型使用原则进行COVID-19个体化治疗。

本发明还能用作核酸疫苗载体，例如，根据GenBank分析SARS-CoV-2的S蛋白氨基酸序列(RBD氨基酸为Gly319～Asn541)，采用氨基酸密码子同义置换，合成RBD肽段对应核酸的全基因，在RBD基因两端分别插入EcoR和IXhoI的酶切位点，将合成的RBD基因构建重组质粒pHBLV-RBD，或在RBD基因两端分别插入HindIII和Xho I的酶切位点，将合成的RBD 基因构建重组质粒pGC-FU-RBD，分别包装携带RBD的慢病毒，进行慢病毒转染，使RBD基因整合到MSC-SV40LT、MSC-AT2R、MSC-AT2R/ACE2和/或MSC-AT2R/ACE2/shRNA的DNA上，获得能通过表达RBD基因刺激宿主产生相应抗体的新冠病毒载体疫苗。相比之下，传统的腺病毒载体因不能与细胞DNA整合，所以易被宿主细胞清除，使疫苗作用的时效短，而且腺病毒本身是人体的异体微生物，而本发明将新冠病毒抗体产生基因通过慢病毒转染整合在人造吞噬细胞DNA上，使用后能长期稳定表达，而且具有干细胞和吞噬细胞的治疗功能。