鉴定NC297烤后品种的特异序列、试剂盒及使用方法

摘要

本发明涉及一种鉴定NC297烤后品种的特异序列、试剂盒及使用方法，属于生物分子鉴定领域，包括特异序列以及根据特异序列设计合成的引物和探针，还包括灵敏智能控制流路的多通道超低微流控核酸检测芯片、预装干粉检测试剂和阳性质控品；使用时，将不同样品加入微流控核酸检测芯片的加样孔中，盖好加样孔盖，放入微流控芯片检测仪中检测；进行PCR扩增并进行结果判定。本发明与普通荧光PCR法等相比，具有以下优势：特异性强：本发明的引物和探针针对NC297品种特异序列设计，特异性强；敏感性高；易于保存，本发明的在微流控芯片内预装干粉试剂，保存方便。

说明书

技术领域

本发明属于生物分子鉴定领域，具体的说，涉及鉴定NC297烤后品种的特异序列、试剂盒及使用方法。

背景技术

烟草作为重要经济作物之一，在已知的66个烟草种中以普通烟草和黄花烟草为人们所熟知，普通烟草中又以烤烟的种植面积分布最为广泛，目前烤烟已是我国乃至世界上栽培面积最大的烟草类型。NC297是1998年由美国金叶种子公司育成的杂交F1代品种，2000年通过美国北卡州官方品种试验的推广品种。该品种具有抗黑胫病、青枯病、TMV、南方根结线虫，易烘烤，香气质好等特点。云南中烟工业公司为提升品牌的竞争力，实行烟叶原料的差异化发展与供应，对品牌导向型烤烟新品种进行筛选和配套技术研究，NC297即为云南中烟工业公司从美国引进试种的新品种之一。

近年来，DNA分子标记逐渐成为作物遗传多样性分析的首选技术，主要应用于分子标记辅助选择、种质资源遗传多样性分析，遗传图谱构建、标记-性状关联分析等方面。在分子标记技术广泛应用之前有很多关于遗传多样性研究方法被报道过。其中主要包括形态学标记、细胞学标记以及同工酶标记等，但因其自身存在的局限性，在实际中的应用受到较大的限制。DNA分子标记之所以受到人们的持续关注，跟它自身显著的优越性是分不开的。DNA分子标记不受时间和空间的影响，能够利用较少的样品进行检测，并且烟草基因组约4.5G，在整个基因中分布着大量的遗传位点可进行分子标记，一般表现为中性，不影响目标性状的表达。专利5734141A和专利申请号201710557191.5都公开了一种鉴定烟草品种的方法，但是其操作复杂，且只针对新鲜烟叶进行鉴定，而烤后烟叶基因组DNA发生了较为严重的降解，因而上述两种专利不适用于烤后烟叶。

TaqMan低密度芯片本质是基于微流控技术的实时荧光定量PCR检测系统，将TaqMan技术的专一性、灵敏性及便捷性与实时定量PCR技术结合起来的一种技术，TaqMan低密度芯片科研根据用户在反应板中固话不同的探针和引物，可以同时检测I个标本的384个不同检测项目或8个标本的48个检测项目，节省试剂，操作简便。与普通芯片相比较，不仅方便与高通量性，同时可以提供荧光定量PCR的特性，具有高特异性、高灵敏度以及宽幅的检测范围。目前，尚未有报道基于TaqMan低密度芯片技术建立对NC297进行品种鉴定的报道。

因此，有必要构建一种基于Taqman探针的微流控芯片体系，对NC297烤后烟叶品种真实性进行鉴定。

发明内容

为了克服背景技术中存在的问题，本发明提供了一种鉴定NC297烤后品种的引物、探针、试剂盒及其使用方法，所用引物和探针在各种环境中快速准确的鉴定NC297烤后烟叶品种真实性，同时保证鉴定的时效性、特异性和灵敏度。

为实现上述目的，本发明是通过如下技术方案实现的：

一种鉴定NC297烤后品种的特异序列，其特征在于：所述的特异序列如SEQ ID NO:1-3所示。

一种鉴定NC297烤后品种的引物和探针，所述的引物和探针根据特异序列SEQ IDNO:1-3设计合成；引物序列为：第一组引物的序列如SEQ ID NO:4-5所示，第二组引物的序列如SEQ ID NO:7-8所示；第三组引物的序列如SEQ ID NO:10-11所示；探针序列为：第一组探针的序列如SEQ ID NO:6所示，第二组探针序列如SEQ ID NO:9所示；第三组探针的序列如SEQ ID NO:12所示。

一种鉴定NC297烤后品种的试剂盒包括灵敏智能控制流路的多通道超低微流控核酸检测芯片、预装干粉检测试剂和阳性质控品；所述的微流控核酸检测芯片中至少包括A、B、C三个类型的反应池，每个类型的反应池在其不同反应腔内分别装有第一组预装干粉检测试剂、第二组预装干粉检测试剂和第三组预装干粉检测试剂；第一组预装干粉检测试剂、第二组预装干粉检测试剂和第三组预装干粉检测试剂的成分分别包括如上述所述的第一组引物和探针、第二组引物和探针、第三组引物和探针；所述的阳性质控品包含NC297的基因组DNA。

进一步的，所述的第一组预装干粉检测试剂、第二组预装干粉检测试剂和第三组预装干粉检测试剂均还包括PCR缓冲液，海藻糖，脱氧核糖核酸混合物，MgCl

进一步的，各组引物在扩增体系的终浓度为0.25μM，各组探针在扩增体系中的浓度为0.2μM，所述的热启动Taq酶终浓度为0.5-1U，脱氧核糖核酸混合物、dATP、dUTP、dCTP、dGTP的终浓度为0.1mM-0.2mM，所述的MgCl

更进一步的，检测试剂经过干燥工艺制成干粉形态，即预装干粉检测试剂；干粉制备工艺为：将配制好的检测试剂溶液，放入-80℃条件下冻存8h以上；将冻好的检测试剂放入到真空冷冻干燥机中，干燥过程为：-50℃，1h，1大气压；-40℃，5h，＜10Pa；-10℃，2h，＜10Pa；0℃，2h，＜10Pa；30℃，5h，＜10Pa；干燥完成后，得到干粉试剂；将干粉试剂分装在微流控核酸检测芯片中的对应的反应腔内。

进一步的，所述的微流控核酸检测芯片具有毛细流道，包括一条出样主流道及若干条分样流道，各分样流道分体设置，每个分样流道对应单一原件反应腔体，等分各个反应腔试剂。

一种鉴定NC297烤后品种的试剂盒的使用方法，包括以下步骤：(1)将20ng待测烤后烟叶的DNA样品稀释，然后将其分别加入A类反应池且包含第一组预装干粉检测试剂、第二组预装干粉检测试剂和第三组预装干粉检测试剂的反应腔中，每个反应腔30μl；将20ngNC297标准样DNA样品稀释，然后将其分别加入B类反应池且包含第一组预装干粉检测试剂、第二组预装干粉检测试剂和第三组预装干粉检测试剂的反应腔中，每个反应腔30μl；将ddH

(2)加样完毕后立即将孔盖合上，放入芯片检测仪中进行检测；反应条件具体为：95℃3-5min预变性94℃10s，60℃退火10s，40-45个循环；

(3)有效性判断：阴性对照孔检测结果应为阴性，且阳性对照孔检测结果为阳性，实验有效，否则实验视为无效；阴性对照孔是未添加DNA模板的空白孔，即C类反应池且包含第一组预装干粉检测试剂、第二组预装干粉检测试剂和第三组预装干粉检测试剂的反应腔，阳性对照孔为A类和B类反应池且包含第一组预装干粉检测试剂、第二组预装干粉检测试剂和第三组预装干粉检测试剂的反应腔；

(4)结果判读：仪器根据对应的反应腔的检测信号，A类反应池且包含第一组预装干粉检测试剂、第二组预装干粉检测试剂和第三组预装干粉检测试剂的反应腔同时出现阳性结果时，直接判断待测烤后烟叶为NC297烤后品种，其他任何结果都判定待测烤后烟叶非NC297烤后品种。

本发明的有益效果：

本发明所使用的探针为荧光标记的Taqman探针，探针两端分别标记荧光报告集团(R)和荧光淬灭基团(Q)的寡核苷酸。TaqMan荧光探针是一种寡核苷酸探针，其5’末端携带荧光基团，如FAM、TET、VIC、HEX等，3’端携带淬灭基团，如TAMRA、BHQ等。PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'－3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。TaqMan方法优点是特异性高，重复性好，但价格高，只适合特定目标。本发明的引物和探针针对NC297品种特异序列设计，特异性强；敏感性高。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，下面将对本发明的优选实施例进行详细的说明，以方便技术人员理解。

实施例

1、待测烤后烟叶和NC297标准样的DNA提取

具体步骤如下：将待测烤后烟叶或者NC297标准样烟叶的叶片在液氮中快速充分研磨成粉末，称取50mg置于2.0mL的离心管中；加入600μL的Buffer PCB和12μLβ-巯基乙醇，震荡混匀，室温放置45min，间或混匀。然后加入20μL的RNase A(10mg/mL)，室温放置2～5min。加入600μL的氯仿，充分混匀，12,000rpm离心5min。吸取上层水相至一个新的2.0mL的离心管中。加入与上层水相等体积的酚:氯仿(1:1，pH 8.0)反复混匀，12,000rpm离心5min，小心吸取上清，反复抽提1～3次。然后加入与上层水相等体积Buffer BD，颠倒混匀3～5次，再加与上层水相等体积的无水乙醇，充分混匀后用移液器将其全部加入到吸附柱中，室温静置2min。10,000rpm离心1min，倒掉收集管中废液；将吸附柱放回收集管中，加入500μL PWSolution，10,000rpm离心1min，倒掉收集管中废液；将吸附柱放回收集管中，加入500μLWash Solution，10,000rpm，离心1min，倒掉收集管中废液。将吸附柱放回收集管中，12,000rpm离心3min。取出吸附柱，放入一个干净的2.0mL离心管中，在吸附膜中央加入50μL TEBuffer，静置5min，12,000rpm离心3min，获得的DNA溶液置于-20℃保存或直接用于后续试验。

2、鉴定NC297烤后品种的特异序列

鉴定NC297烤后品种的特异序列

NC297的特异序列为：

SEQ ID NO.1：

ACAACAACTACGTTAGTGTGAGAAAAAATATTTTCATCATTTAAATAAATATTTTATTTTATTTAATGTCAATATATATATATATATATATATATATATATATATATTGTCAACACTACATACGTGCAACGCACATATACTAAAACTAGTTATTTTCATGTGTGCCAAGCTCTTC

SEQ ID NO.2：

TCAAATCAAATCAACCCTCTCCTAAATTCCTAAATATATATATATATATATATAATAAATAAATATTAAATCTCATAAAAACAATACAGCAAAACACACTCAGTGCCTCAACAGAGCAGCAACGGAGAGTGGTTGGAGCTTCTCTCGTT

SEQ ID NO.3：

AAGCACACGCAAGTGACAAGTCAATACTTTCACTTGTTTTATTCAAAAAATAAATCTTATTATAAAATTAATTTTATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATTCATTACGTACTTTCCAAATGGGAATAGGACTAGTATTAATTTTCACAATATAAAAAGAAGGCTGAAAGAGGGATTGC

3、检测试剂预装

微流控核酸检测芯片中的A、B、C三个类型的反应池，每个类型的反应池在其三个反应腔内分别装有第一组预装干粉检测试剂、第二组预装干粉检测试剂和第三组预装干粉检测试剂。

第一组检测试剂包括第一组引物，第一组探针、PCR缓冲液，海藻糖，脱氧核糖核酸混合物，MgCl

第二组检测试剂包括第二组引物，第二组探针、PCR缓冲液，海藻糖，脱氧核糖核酸混合物，MgCl

第三组检测试剂包括第三组引物，第三组探针、PCR缓冲液，海藻糖，脱氧核糖核酸混合物，MgCl

各组引物在扩增体系的终浓度为0.25μM，各组探针在扩增体系中的浓度为0.2μM，所述的热启动Taq酶终浓度为0.5-1U，脱氧核糖核酸混合物、dATP、dUTP、dCTP、dGTP的终浓度为0.1mM-0.2mM，所述的MgCl

上述检测试剂经过干燥工艺制成干粉形态，预装于微流控芯片中对应的反应腔内。

根据特异序列SEQ ID NO:1-3设计合成的三组引物和探针序列如下：

SEQ ID NO.4:ACAACAACTACGTTAGTGTG(第一组正向引物)

SEQ ID NO.5:GAAGAGCTTGGCACACATGA(第一组反向引物)

SEQ ID NO.6:CATCATTTAAATAAATATTT(第一组Taqman探针)

SEQ ID NO.7:ATCAACCCTCTCCTAAATTCC(第二组正向引物)

SEQ ID NO.8:AACGAGAGAAGCTCCAA(第二组反向引物)

SEQ ID NO.9:CAGAGCAGCAACGGAGAGT(第二组Taqman探针)

SEQ ID NO.10:AAGCACACGCAAGTGACAAGT(第三组正向引物)

SEQ ID NO.11:GCAATCCCTCTTTCAGCCTTC(第三组反向引物)

SEQ ID NO.12:CATTACGTACTTTCCAAATGGG(第三组Taqman探针)

4、试剂盒的操作和结果判定

(1)将20ng步骤1获得的待测烤后烟叶的DNA进行稀释，然后将其分别加入A类反应池且包含第一组预装干粉检测试剂、第二组预装干粉检测试剂和第三组预装干粉检测试剂的反应腔中，每个反应腔30μl；将20ng NC297标准样DNA样品稀释，然后将其分别加入B类反应池且包含第一组预装干粉检测试剂、第二组预装干粉检测试剂和第三组预装干粉检测试剂的反应腔中，每个反应腔30μl；将ddH

(2)加样完毕后立即将孔盖合上，放入芯片检测仪中进行检测；反应条件具体为：95℃3-5min预变性94℃10s，60℃退火10s，40-45个循环；

(3)有效性判断：阴性对照孔是未添加DNA模板的空白孔，即C类反应池且包含第一组预装干粉检测试剂、第二组预装干粉检测试剂和第三组预装干粉检测试剂的反应腔，检测结果应为阴性；且阳性对照孔检测结果应为阳性，阳性对照孔为A类和B类反应池且包含第一组预装干粉检测试剂、第二组预装干粉检测试剂和第三组预装干粉检测试剂的反应腔，实验有效；

(4)结果判读：仪器根据对应的反应腔的检测信号，判读结果如表1。

表1判读结果

检测结果表明本试剂盒用在鉴定NC297烤后品种的真实性。

最后说明的是，以上优选实施例仅用于说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 红塔烟草（集团）有限责任公司

<120> 鉴定NC297烤后品种的特异序列、试剂盒及使用方法

<130> 20201225

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 175

<212> DNA

<213> Nicotiana tabacum

<400> 1

acaacaacta cgttagtgtg agaaaaaata ttttcatcat ttaaataaat attttatttt 60

atttaatgtc aatatatata tatatatata tatatatata tatatattgt caacactaca 120

tacgtgcaac gcacatatac taaaactagt tattttcatg tgtgccaagc tcttc 175

<210> 2

<211> 149

<212> DNA

<213> Nicotiana tabacum

<400> 2

tcaaatcaaa tcaaccctct cctaaattcc taaatatata tatatatata tataataaat 60

aaatattaaa tctcataaaa acaatacagc aaaacacact cagtgcctca acagagcagc 120

aacggagagt ggttggagct tctctcgtt 149

<210> 3

<211> 215

<212> DNA

<213> Nicotiana tabacum

<400> 3

aagcacacgc aagtgacaag tcaatacttt cacttgtttt attcaaaaaa taaatcttat 60

tataaaatta attttatata tatatatata tatatatata tatatatata tatatatata 120

tatatatata tatatattca ttacgtactt tccaaatggg aataggacta gtattaattt 180

tcacaatata aaaagaaggc tgaaagaggg attgc 215

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

acaacaacta cgttagtgtg 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

gaagagcttg gcacacatga 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

catcatttaa ataaatattt 20

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

atcaaccctc tcctaaattc c 21

<210> 8

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

aacgagagaa gctccaa 17

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 9

cagagcagca acggagagt 19

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 10

aagcacacgc aagtgacaag t 21

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 11

gcaatccctc tttcagcctt c 21

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 12

cattacgtac tttccaaatg gg 22