CaMK4在制备防治银屑病的药物中的应用

摘要

本发明公开了CaMK4作为靶点在制备防治银屑病的药物中的应用，以及CaMK4抑制剂在制备防治银屑病的药物中的应用。本发明检测了CaMK4在银屑病患者皮损以及咪喹莫特(IMQ)诱导的小鼠银屑病皮损中的表达，结果发现CaMK4与银屑病发展呈正相关；CaMK4不仅在免疫细胞中表达，而且还在角质细胞中表达；并且通过体内给予小鼠IL‑10、CaMK4抑制剂，可以减轻IMQ诱导的小鼠银屑病样炎症；说明CaMK4可以作为制备防治银屑病的药物中的新的靶点。

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，特别是涉及CaMK4在制备防治银屑病的药物中的应用。

背景技术

银屑病是一种慢性炎症免疫性皮肤病，临床表现为红色丘疹和斑块，上覆银白色的厚层鳞屑。大量的免疫细胞，如T细胞、巨噬细胞、树突状细胞，以及角质形成细胞在其中起着重要作用，免疫细胞被激活后，会释放细胞因子刺激角质细胞，导致角质细胞异常增殖，形成皮肤角质化和鳞屑。

CAMK4基因编码钙/钙调素依赖性蛋白激酶IV，在多种细胞中表达，尤其在T细胞中表达尤为强烈。CaMK4主要在免疫应答中发挥重要作用，包括T细胞活化和发育，通过激活免疫细胞(包括T细胞和抗原呈递细胞)的转录因子CREB、CREMα、RORγt等来调节基因表达。

目前，CaMK4基因功能异常的研究主要集中在系统性红斑狼疮及狼疮肾炎，其导致自身抗体产生、免疫复合物形成和免疫失调，尤其是与Th17细胞紧密相关。有研究报道，CaMK4通过AKT/mTOR/S6K/RORγt和CREM/RORγt通路调控Th17细胞的分化和IL-17A的表达，表明CaMK4是

CaMK4可以影响Th17细胞的分化和IL-17A的产生，不仅表明CaMK4是Th17细胞分化与作用环节中重要且必需要的一环，也表明CaMK4可能成为自身免疫炎症疾病新的治疗靶点。由于Th17细胞为主的免疫细胞参与了众多自身免疫性疾病的发生发展，推测CaMK4可能在银屑病发病过程中发挥重要的作用，并且有可能成为银屑病新的治疗靶点。

发明内容

本发明的目的是提供CaMK4在制备防治银屑病的药物中的应用，以解决上述现有技术存在的问题，以CaMK4作为药物靶点实现银屑病的有效防治。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供CaMK4作为靶点在制备防治银屑病的药物中的应用。

优选的是，所述药物是在基因水平和/或蛋白水平上以CaMK4作为药物靶点。

优选的是，所述药物为阻碍CaMK4的蛋白表达或者mRNA表达的药物。

优选的是，所述药物为抑制CaMK4所导致的IL-10恢复的药物。

本发明还提供CaMK4抑制剂在制备防治银屑病的药物中的应用。

优选的是，所述抑制剂通过阻碍CaMK4的蛋白表达或者mRNA表达防治银屑病。

本发明公开了以下技术效果：

本发明采用免疫组化、实时定量PCR、Western blot等技术分析了CaMK4在银屑病患者皮损和咪喹莫特(IMQ)诱导的小鼠银屑病皮损中的表达情况，结果显示CaMK4与银屑病发展呈正相关。通过IMQ诱导构建Camk4缺陷型(Camk4-/-)小鼠银屑病模型，与野生型(Camk4+/+)小鼠相比，能明显减轻皮肤厚度、鳞屑和表皮厚度。并且小鼠体内实验中，通过骨髓来源的巨噬细胞(BMDM)转输、外源性给予IL-10和CaMK4抑制剂KN-93，发现抑制免疫细胞或者角质细胞中的CaMK4表达可以减轻皮肤厚度、鳞屑、表皮厚度以及降低促炎细胞因子的表达。因此，本发明提出在制备防治银屑病药物时新的作用靶点CaMK4。

附图说明

图1为CaMK4在银屑病患者皮损以及咪喹莫特(IMQ)诱导的小鼠银屑病皮损中的表达情况；A，免疫组化检测银屑病患者皮损和健康皮肤CaMK4的表达；比例尺：100μm；B，定量PCR检测健康对照(n＝24)和银屑病患者(n＝24)外周血CAMK4的mRNA水平；C，流式细胞术检测健康对照(n＝15)和银屑病患者(n＝12)外周血T细胞亚群(CD4

图2为Camk4-/-小鼠银屑病样与Camk4+/+小鼠比较表型、细胞因子以及表皮发育基因mRNA表达情况；A，小鼠背部皮肤的代表性图片；B，背部皮肤厚度、红斑和鳞屑的评分曲线；C，皮肤切片H&E染色；比例尺：200μm；D，表皮厚度统计分析；E，对IMQ诱导的Camk4+/+(n＝3)和Camk4-/-(n＝3)小鼠的整个皮肤进行RNA测序分析；F，定量PCR检测IMQ诱导小鼠皮肤致病因子mRNA水平；数据代表两次独立实验，每组7-8只小鼠，以平均值±标准差表示；*p<0.05，**p<0.01；

图3为Camk4-/-小鼠银屑病样与Camk4+/+小鼠相比特定的皮肤髓系细胞亚群变化情况；A，小鼠皮肤中LCs、CD11b

图4为小鼠皮肤和巨噬细胞中IL-10的表达情况；A，定量PCR检测小鼠皮肤中Il10的mRNA水平；B，免疫组化检测小鼠皮肤中IL-10的表达；比例尺：200μm；C，免疫荧光检测小鼠皮肤中F4/80(绿色)、IL-10(红色)和DAPI(蓝色)；实心箭头显示真皮F4/80

图5为巨噬细胞中细胞因子的测定结果；A，Western blot检测IMQ、KN-93、ST034307、cAMP处理的骨髓来源的巨噬细胞(BMDMs)中CaMK4、ADCY1、p-Erk1/2、Erk1/2、p-p38、p38的蛋白水平；B，定量PCR检测IMQ、KN-93、ST034307、cAMP、U0126、SB203580处理的BMDMs中Il10的mRNA水平；C，ELISA检测IMQ、KN-93、ST034307、cAMP、U0126、SB203580处理的BMDMs上清中IL-10的含量；D-E，用2μg/mL IMQ刺激Camk4+/+或Camk4-/-BMDMs 12h后提取RNA；定量PCR检测IMQ刺激的Camk4+/+和Camk4-/-BMDMs中巨噬细胞表型标记物(M1和M2)(D)和吞噬相关基因(E)的mRNA水平；F-I，用CaMK4抑制剂10μM KN-93或MEK1/2抑制剂20μMU0126或p38抑制剂20μM SB203580处理磁珠分选的银屑病患者(n＝3)外周血CD14

图6为实施例6实验结果；A-F为体内注射IL-10或PBS小鼠，A小鼠治疗模型示意图；B，小鼠背部皮肤的代表性图片；C，背部皮肤厚度、红斑和鳞屑的评分曲线；D，皮肤切片H&E染色结果，比例尺：200μm；E，表皮厚度统计分析；F，定量PCR检测IMQ诱导小鼠皮肤致病因子mRNA水平；G-K，是体内注射1×10

图7为应用TNF-α和IL-17A刺激HaCaT细胞模拟银屑病细胞环境的检测结果；A-B，流式细胞术检测HaCaT细胞凋亡早期和晚期的比例；C，流式细胞术检测HaCaT细胞周期G0/G1期、S期和M期的比例；D，定量PCR检测促炎基因表达；E，免疫共沉淀检测CaMK4和AKT的相互作用；F，Western blot检测CaMK4、p-AKT、AKT、p-IKKα/β、IKKα、p-NF-κB p65和NF-κB p65的蛋白水平；数据代表三次独立实验，以平均值±标准差表示；*p<0.05，**p<0.01；

图8为小鼠体内使用CaMK4抑制剂KN-93的治疗效果；A，小鼠治疗模型示意图；B，小鼠背部皮肤的代表性图片；C，背部皮肤厚度、红斑和鳞屑的评分曲线；D，皮肤切片H&E染色，比例尺：200μm；E，表皮厚度统计分析；F，定量PCR检测IMQ诱导小鼠皮肤致病因子mRNA水平，数据代表两次独立实验，每组5-7只小鼠，以平均值±标准差表示；*p<0.05，**p<0.01。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

以下实施例中所用试剂或材料如无特殊说明，均能通过商业渠道获取。

本发明发现CaMK4在银屑病患者皮损以及咪喹莫特(IMQ)诱导的小鼠银屑病皮损中显著增多，提示CAMK4与银屑病发展呈正相关，以下将以具体实施例进一步说明。

实施例1

实验材料与方法

1)银屑病患者皮损样本

选自安徽医科大学第一附属医院皮肤科门诊患者、临床表现典型的银屑病患者(33例)，其中9例常规方法取皮损部位和皮损边缘正常皮肤样本置于生理盐水中，样本当天处理，制备病理切片；24例常规方法取血液，与Trizol 1:3混匀后冻存于-80℃，抽提RNA。

2)银屑病小鼠模型建立

采用国际通用的银屑病小鼠模型：给6-8周龄C57BL/6小鼠，用5％IMQ涂抹小鼠剃光的背部皮肤，每天涂抹62.5mg，连续涂抹5天。以6-8周龄C57BL/6小鼠作为对照。

3)RNA抽提和实时定量PCR

采用Tritzol法抽提组织或者细胞总RNA，具体为：将1mL Trizol加入组织或者细胞中，组织用匀浆器匀浆，细胞多次吹打充分裂解；然后加入200μL氯仿，涡旋震荡15s，室温静置10min；12000g，4℃离心15min，小心吸取上清液约500μL置于EP管中，再加入等体积4℃预冷的异丙醇，轻轻颠倒混匀，室温静置10min；12000g，4℃离心15min后弃去上清液，加入1mL 75％乙醇洗涤2次，干燥后加入20μL DEPC处理的水，Nanodrop2000测定浓度和纯度待用。

应用逆转录试剂盒(TaKaRa)合成各样本的cDNA，然后以cDNA为模板，扩增基因片段，靶基因的相对表达量利用2

本发明所用的所有扩增引物如下：

小鼠引物序列

人引物序列

扩增体系：

扩增程序：

4)流式细胞术检测细胞中的CaMK4表达

取1mL抗凝血至15mL离心管中，加入5mL红细胞裂解液，混匀后冰上裂解5min(中间可适当混匀一次)；加满PBS终止反应，500g，4℃离心10min，收集细胞沉淀，用PBS洗1次，收集细胞；细胞计数后，取1×10

5)免疫组化检测皮肤中CaMK4的表达

石蜡切片脱蜡后，用0.01M(pH＝6.0)柠檬酸钠进行抗原修复；用3％H

如图1所示，CaMK4在银屑病患者和诱导的小鼠皮损中显著增多。与健康对照相比，银屑病患者外周血CAMK4的mRNA水平也升高，在CD14

实施例2

利用上述构建的小鼠模型，在第5天采集皮肤样本进行实验。

1)观察用IMQ涂抹小鼠剃光的背部皮肤后，第0-5天背部皮肤厚度、红斑、鳞屑发展状况，根据临床银屑病面积和严重程度指数，通过厚度、红斑、鳞屑来评估背部皮肤的严重程度。用游标卡尺测量背部皮肤厚度。鳞屑和红斑的评分范围为0-4：0，无；1，轻度；2，中度；3，显著；4，非常显著；

2)制备皮肤切片，用H&E染色，使用常规通用的H&E染色方法对皮肤切片进行染色；

3)表皮厚度统计分析，采用双盲方式对H&E染色的切片拍照后，进行表皮厚度的测量；

4)对IMQ诱导的Camk4+/+(n＝3)和Camk4-/-(n＝3)小鼠的整个皮肤进行RNA测序分析，分离小鼠背部皮肤，取黄豆粒大小冻存于-80℃，送杭州联川公司进行RNA测序；

5)定量PCR检测IMQ诱导小鼠皮肤致病因子mRNA水平，方法同实施例1。

如图2所示，Camk4-/-小鼠银屑病样表型较Camk4+/+小鼠减轻，包括皮肤厚度、鳞屑和表皮厚度。此外，Camk4-/-小鼠皮损中促炎细胞因子、趋化因子、抗菌肽(AMPs)、表皮发育基因mRNA水平较Camk4+/+小鼠减低，组织修复相关基因和吞噬相关基因mRNA水平较Camk4+/+小鼠升高。

实施例3

IMQ通过TLR7触发银屑病样炎症，TLR7在多种骨髓来源的天然免疫细胞上表达。另一方面，IMQ诱导小鼠皮肤的F4/80

在IMQ连续涂抹后的第5天分离小鼠背部皮肤，然后剪成小块，置于含有1mg/mL胶原酶IV、50μg/mL DNase I、10mM HEPES和10％FBS的RPMI 1640培养基中，在37℃消化90min。消化后的组织通过74μm尼龙网过滤去除组织碎片，悬浮液中添加额外的RPMI 1640以使酶活性失活。用30％和70％percoll在1260g下离心20分钟，吸取中间白色云雾状层，得到皮肤白细胞。用PBS清洗后，进行细胞计数；细胞计数后，取1×10

如图3所示，与Camk4+/+小鼠相比，IMQ诱导的Camk4-/-小鼠皮肤中朗格汉斯细胞(LCs)和CD11b

检测小鼠皮肤中CD4

实施例4

巨噬细胞主要通过产生IL-10发挥调节功能，IL-10是一种中枢抗炎介质，可减少过度和不受控制的炎症刺激引起的组织损伤，保护宿主免受过度炎症反应。为了确定巨噬细胞是否产生IL-10参与缓解CaMK4缺乏的银屑病症状，我们首先检测了皮肤和巨噬细胞中IL-10的表达。

1)定量PCR检测小鼠皮肤中IL-10的mRNA水平，方法同实施例1；

2)免疫组化检测小鼠皮肤中IL-10的表达，方法同实施例1；

3)免疫荧光检测小鼠皮肤中F4/80、IL-10和DAPI，石蜡切片脱蜡后，用0.01M(pH＝6.0)柠檬酸钠进行抗原修复；用封闭液封闭非特异性蛋白；一抗(F4/80和IL-10抗体)4℃孵育过夜，二抗37℃孵育30min，用DAPI染核，抗荧光淬灭封片液封片；

4)流式细胞术检测LCs、CD11b

如图4所示，定量PCR检测发现IMQ诱导的Camk4-/-小鼠皮肤中IL-10mRNA水平较Camk4+/+小鼠升高，免疫组化检测显示Camk4-/-小鼠皮肤中IL-10蛋白水平显著高于Camk4+/+小鼠，免疫荧光和流式细胞术结果显示IL-10主要来源于真皮巨噬细胞。

实施例5

巨噬细胞中细胞因子的测定

从小鼠的胫骨和股骨冲洗出骨髓细胞，在含有10％FBS、1％抗生素和10ng/mL M-CSF的RPMI 1640培养基中培养，培养基每2天更换一次，连续培养6天。即可得到骨髓来源的巨噬细胞(BMDMs)。用CaMK4抑制剂10μM KN-93或ADCY1抑制剂20μM ST034307或2μg/mLcAMP或MEK1/2抑制剂20μM U0126或p38抑制剂20μM SB203580处理BMDMs6h，然后用2μg/mLIMQ刺激12h以提取蛋白质和RNA，或刺激24h以测定细胞因子。

1)Western blot检测不同抑制剂处理的BMDMs中CaMK4、ADCY1、p-Erk1/2、Erk1/2、p-p38、p38的蛋白水平，用含PMSF，蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物的RIPA裂解液裂解细胞得到蛋白样本；对蛋白进行定量后，进行10％SDS-PAGE凝胶电泳；将凝胶中的蛋白质转移到硝化纤维素膜上；孵育一抗和二抗，用ECL溶液进行显色；

2)定量PCR检测不同抑制剂处理的BMDMs中IL-10的mRNA水平，方法同实施例1；

3)ELISA检测不同抑制剂处理的BMDMs上清中IL-10的含量，根据制造商说明书中的标准方法进行检测；

4)定量PCR检测IMQ刺激的Camk4+/+和Camk4-/-BMDMs中巨噬细胞表型标记物(M1和M2)和吞噬相关基因的mRNA水平，方法同实施例1；

5)采用上述方法测定银屑病患者(n＝3)外周血CD14

如图5所示，体外实验发现在BMDMs中抑制CaMK4恢复IL-10的生成，通过上调ADCY1-cAMP-Erk1/2和p38通路；抑制CaMK4上调M2基因和吞噬相关基因的表达；证明CaMK4下调ADCY1-cAMP-Erk1/2和p38通路抑制巨噬细胞产生IL-10且CaMK4抑制M2巨噬细胞极化和吞噬功能。同样地，在银屑病患者外周单核细胞中抑制CaMK4恢复IL-10的生成以及下调促炎细胞因子的表达。

实施例6

小鼠体内外源性补给IL-10和Camk4-/-BMDM过继转输实验

在野生型小鼠剃光的背部皮肤局部涂抹62.5mg IMQ，连续5天；在第0天和第2天IMQ涂抹前1h，将IL-10(每只小鼠1μg)或PBS尾静脉注射到小鼠体内。在第5天采集样本用于后续实验。

在野生型小鼠剃光的背部皮肤局部涂抹62.5mg IMQ，连续5天；在第0天IMQ涂抹前1h，将1×10

1)观察用IMQ涂抹小鼠剃光的背部皮肤后，第0-5天背部皮肤厚度、红斑、鳞屑发展状况，并进行评分，方法同实施例2；

2)表皮厚度统计分析，方法同实施例2；

3)定量PCR检测IMQ诱导小鼠皮肤致病因子mRNA水平，方法同实施例1。

如图6所示，体内外源性补给IL-10的小鼠银屑病样表型较对照小鼠减轻，包括皮肤厚度、鳞屑、红斑、表皮厚度和促炎细胞因子的降低；Camk4-/-BMDM过继转输的小鼠银屑病样表型较对照小鼠减轻，包括皮肤厚度、鳞屑、红斑、表皮厚度和促炎细胞因子的降低；说明缺乏CaMK4可以恢复巨噬细胞中IL-10的产生，IL-10从而减轻IMQ诱导的小鼠银屑病样炎症。

实施例7

应用TNF-α和IL-17A刺激HaCaT细胞模拟银屑病细胞环境的检测

用siCAMK4或对照转染HaCaT细胞24h，用TNF-α(50ng/mL)和IL-17A(50ng/mL)刺激细胞24h，用流式细胞术检测细胞凋亡早期和晚期的比例、以及细胞周期G0/G1期、S期和M期的比例。

1)定量PCR检测促炎基因表达，方法同实施例1；

2)免疫共沉淀检测CaMK4和AKT的相互作用，制备的细胞裂解液与CaMK4抗体或兔IgG在4℃旋转孵育过夜；与Protein A/G磁珠在4℃旋转孵育1h；将磁珠洗涤三次后悬浮于SDS-PAGE样品缓冲液中，室温下孵育10min以去掉磁珠，收集上清液，用AKT抗体进行Western blot分析；

3)Western blot检测不同细胞因子的蛋白水平，方法同实施例5。

如图7所示，在KCs中抑制CaMK4升高了TNF-α和IL-17A刺激的HaCaT细胞凋亡，降低了细胞增殖和促炎基因的表达；CaMK4通过与AKT相互作用影响了下游NF-κB通路；说明CaMK4通过AKT-NF-κB通路抑制KCs凋亡，促进KCs增殖和促炎基因表达。

实施例8

小鼠体内使用CaMK4抑制剂KN-93评估治疗效果

在野生型小鼠剃光的背部皮肤局部涂抹62.5mg IMQ，连续5天；在第0天和第2天IMQ涂抹前1h，将KN-93(每只小鼠0.24mg)或PBS尾静脉注射到小鼠体内。在第5天采集样本用于后续实验。

如图8所示，KN-93治疗小鼠银屑病样表型较对照小鼠减轻，包括皮肤厚度、鳞屑、表皮厚度和促炎细胞因子的降低。此外，KN-93治疗小鼠皮肤IL-10mRNA水平较对照小鼠升高。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。