一种六出花的组织培养方法

摘要

一种六出花的组织培养方法，包括将外植体进行离体芽诱导、继代培养、生根培养以及炼苗移栽的过程，所述离体芽诱导、继代培养的培养基为MS培养基，并且含有6‑BA和NAA；所述外植体为六出花鲜切花花茎部位。本申请对于外植体的部位进行了特殊选择，并不是选择常规的地下根茎等部位，这是六出花组织培养成功的基础，另外一个发明点则是培养基，特别是离体芽诱导培养基以及继代培养培养基的选择，都是以MS培养基为基础，复合具有浓度梯度配合的6‑BA以及NAA，实现六出花的快速组织培养。

说明书

技术领域

本申请涉及一种六出花的组织培养方法。

背景技术

六出花又名秘鲁百合，属石蒜科。六出花属多年生草本花卉，因其花色丰富、花型奇异、盛开时典雅富丽，成为切花新秀，近年来已经跻身于世界十大切花之列。近年来，已开始应用于盆栽观赏。由于国外少数大公司品种垄断，目前六出花在我国还处于引种阶段，在切花市场还不多见，仅在北京、上海等少数大城市高档切花市场有一定量应市销售。随着人民生活水平提高，全国花卉消费额以年均10％以上的速度在递增，而六出花作为切花新贵，市场前景广阔。

在生产上大多采用成本较低的种子播种进行实生繁殖，但存在明显的繁殖后代分化变异大的问题，无法进行规模化生产。分株繁殖是常见的一种繁殖方式，分株繁殖就是利用根茎上未萌发的隐芽，当根茎分段切开后，刺激隐芽萌发即可成新的植株。但是由于国外少数大公司品种垄断，国内难以购买到优良六出花品种的地下根芽，进一步限制了六出花商业化生产。

组织培养技术是在人为创造无菌条件下将植物离体器官(如根、茎、叶等)置于培养基内，并放在适宜的环境中，进行连续培养以获得细胞、组织或个体的技术，是一种生物学的现代科学技术。目前，经文献及专利检索，丁超，杨萍，王计平以及任志强的论文“六出花的再生繁殖技术研究”(中国农学通报，2016，32(25)：75-78)涉及到盆栽六出花的组织培养，但是实验结果是组织培养失败，无法出苗并形成整体植株。其他相关六出花的文献专利，都是针对分株繁殖及鲜切花保鲜技术方面的文章及专利。经文献及专利检索，尚无六出花组织培养成功的技术路线。

发明内容

为了解决上述问题，本申请提出了一种六出花的组织培养方法，包括将外植体进行离体芽诱导、继代培养、生根培养以及炼苗移栽的过程，所述离体芽诱导、继代培养的培养基为MS培养基，并且含有6-BA和NAA；所述外植体为六出花鲜切花花茎部位。本申请对于外植体的部位进行了特殊选择，并不是选择常规的地下根茎等部位，这是六出花组织培养成功的基础，另外一个发明点则是培养基，特别是离体芽诱导培养基以及继代培养培养基的选择，都是以MS培养基为基础，复合具有浓度梯度配合的6-BA以及NAA，实现六出花的快速组织培养。

优选的，还包括外植体的处理过程：将外植体流水冲洗，冲洗干净后用洗涤剂进行洗涤，叶片与茎交叉处用毛刷洗涤，然后再用清水冲洗，冲洗干净后移至超净工作台进行外植体灭菌。

优选的，外植体灭菌采用酒精处理10-15s，然后升汞处理3-5min，最后用无菌水冲洗5-10次。

优选的，所述离体芽诱导包括如下步骤：将外植体接种到离体芽诱导培养基上进行培养，所述离体芽诱导培养基中6-BA的浓度为0.1-1mg/L；NAA的浓度为0.2-2mg/L。

优选的，所述离体芽诱导培养基的pH为5.8-6.0，培养温度为23-25℃，光照时间为10-14h/天，光照强度为2000-2500Lx，培养25-30天。

优选的，所述继代培养包括如下步骤：将经过离体芽诱导之后成活的组培苗，从底部切下，进行继代培养，转移到继代培养培养基中，所述继代培养培养基中6-BA的浓度为1-2mg/L；NAA的浓度为0.1-0.5mg/L。

优选的，所述继代培养培养基中的琼脂浓度为5.5-6g/l，蔗糖浓度25-35g/l，培养条件为温度为23-27℃，光照时间为10-14h，光照强度为2000-2500lx。

优选的，所述生根培养包括如下步骤：对于继代培养后的组培苗，选择3cm以上的组培苗单棵切下，转移至生根培养基中，生根培养基为1/2MS培养基，所述生根培养基中还包括0.1-1mg/L的IBA；1-2mg/L的NAA。

优选的，所述生根培养的培养条件温度为23-27℃，光照时间为10-14h，光照强度为2000-2500lx，所述生根培养基中的蔗糖浓度为20-30g/L。

优选的，待生根培养之后选择植株5cm以上时进行炼苗移栽，将生根后的组培苗的容器的瓶盖打开后放置7-10天，再取出生根苗，用清水洗净基部附着的培养基，然后移栽至基质中，所述的基质为珍珠岩、蛭石和草炭的混合物，珍珠岩、蛭石和草炭的质量比为1：1：1-3。

本申请能够带来如下有益效果：现在的六出花多是通过种子及分株来繁殖，但是种子繁育存在明显的繁殖后代分化变异大的问题；而分株繁殖为了避免种子繁殖的劣势，一般是利用根茎上未萌发的隐芽处理，当根茎分段切开后，刺激隐芽萌发，分株繁殖对环境要求较高且分株系数低，成活率低，无法进行规模化生产，而且现在还存在国外技术封锁的问题，无法取得六出花地下根茎，使六出花在国内一直处于引种阶段。本发明在无法得到六出花地下根茎情况下，针对六出花种子繁育和分株繁殖技术存在的不足，采取六出花鲜切花为外植体，通过不同培养基、不同激素配比、不同移栽基质的筛选，建立了六出花组培快繁技术体系。与其他繁殖方法相比，本发明需要的母本材料宜得，增殖系数可达到4以上，生根率可达到90％以上，且基本上能完全保持母本的优良性状，将本发明得到的幼苗移栽室外，成活率能达到90％以上，整体的繁殖速度快，苗木质量好，出苗率高。

具体实施方式

为能清楚说明本方案的技术特点，下面通过具体实施方式，对本申请进行详细阐述。

本申请的培育过程包括如下几个步骤：

S1.外植体处理：

本发明中的外植体为六出花鲜切花花茎部位；先将外植体流水冲洗，约需要冲洗30min，冲洗干净后用洗涤剂进行洗涤，洗涤剂一般用洗洁精即可，叶片与茎交叉处用毛刷洗涤，然后再用清水冲洗，约需要1h，冲洗干净后移至超净工作台进行外植体灭菌；外植体灭菌采用酒精处理10-15s，然后升汞处理3-5min，最后用无菌水冲洗5-10次；

S2.离体芽诱导；

将外植体接种到离体芽诱导培养基上进行培养，所述离体芽诱导培养基中6-BA的浓度为0.1-1mg/L；NAA的浓度为0.2-2mg/L；所述离体芽诱导培养基的pH为5.8-6.0，培养温度为23-25℃，光照时间为10-14h/天，光照强度为2000-2500Lx，培养25-30天；

S3.继代培养

包括如下步骤：将经过离体芽诱导之后成活的组培苗，从底部切下，进行继代培养，转移到继代培养培养基中，所述继代培养培养基中6-BA的浓度为1-2mg/L；NAA的浓度为0.1-0.5mg/L；所述继代培养培养基中的琼脂浓度为5.5-6g/l，蔗糖浓度25-35g/l，培养条件为温度为23-27℃，光照时间为10-14h，光照强度为2000-2500lx；

S4.生根培养

对于继代培养后的组培苗，选择3cm以上的组培苗单棵切下，转移至生根培养基中，生根培养基为1/2MS培养基，所述生根培养基中还包括0.1-1mg/L的IBA；1-2mg/L的NAA；所述生根培养的培养条件温度为23-27℃，光照时间为10-14h，光照强度为2000-2500lx，所述生根培养基中的蔗糖浓度为20-30g/L；

S5.炼苗移栽

待生根培养之后选择植株5cm以上时进行炼苗移栽，将生根后的组培苗的容器的瓶盖打开后放置7-10天，再取出生根苗，用清水洗净基部附着的培养基，然后移栽至基质中，所述的基质为珍珠岩、蛭石和草炭的混合物，珍珠岩、蛭石和草炭的质量比为1：1：3。

具体的实验过程如下：

所有试验所采用的基本培养基均为MS(表1)。通过植物外植体预培养、表面消毒、接种获得无菌体系，进行分化、增殖、生根、驯化等各类试验，得到实验数据，重复试验进行验证，最后达到六出花快繁目的及应用推广等一系列步骤和研究方法。所有操作采用常规试验方法。

一、组培所用的培养基：

基本培养基为MS培养基，配方如表1：

表1基本培养基配方

二、正交试验设计和调查指标标准：

试验按照L9(3

表2表头设计

表3L9(3

表4形质指标标准

本项目所选用的六出花材料为切花品种Lovely，也是公司生产上主推广应用的优良品种，近年来迫切需要大量均匀一致的繁殖材料。本项目针对六出花切花Lovely品种无菌繁殖系建立中的困难问题进行研究，主要探索提高外植体分化率及生根率的方法，筛选合适的培养基和培养条件,为六出花品种的组织培养快速繁育打好基础,以利于优良品种的推广。

三、六出花组培无菌体系的建立

无菌体系的建立涉及到外殖体的预培养、灭菌和无菌瓶苗的选择，对无菌体系的建立有重要的影响，尤其在六出花切花Lovely的无菌体系建立过程中最为突出。外植体的预培养条件不同，即使采用同一种灭菌方式，成活情况相差几十倍；同样，外植体的预培养条件一样，不同的灭菌试剂、不同的灭菌时间，成活情况也相差几十倍。为此我们以Lovely为基础，设计了多种无菌体系建立方法，从中找出最佳的途径和方法。

1、六出花Lovely无菌体系的建立

2018年1月开始以六出花花茎顶端隐芽部位为外植体，流水冲洗30min，干净后用洗洁净进行洗涤，叶片与茎交叉处，用毛刷洗涤，再用清水冲洗1h后，移至超净工作台进行外殖体灭菌，灭菌方式采用75％酒精处理+0.1％升汞处理的组合方式，灭完菌后全部用无菌水冲洗8-10次，试验中所用的培养基灭菌都采用高压灭菌的方式。置于25℃，光照12h，光强2000lx，每两天抽查并记录一次材料污染情况，统计材料的灭菌效果和污染率，筛选出效果较好的灭菌措施。经过2周培养统计材料的灭菌效果和污染率如下：

表5六出花外殖体灭菌试验

注：污染率/％＝污染个数/接种个数*100，褐化死亡率/％＝褐化死亡个数/接种个数*100，存活率/％＝(接种个数-污染个数-褐化死亡数)/接种个数*100。

试验表明，经过不同消毒时间的外植体灭菌效果差异明显。其中灭菌效果最好的是第二组，外植体无菌率达78.1％，其方法是先将材料在75％酒精中浸泡12s，再将其在0.1％升汞中浸泡4min，无菌水冲洗10次后接种基本培养基中。其次是第三组，外植体无菌率达63.9％，但褐化、死亡率较高，其方法是先将材料在75％酒精中浸泡15s，再将其在0.1％升汞中浸泡6min，无菌水冲洗10次后接种。而第一组和第四组灭菌效果最差，第一组时间太短，材料污染较多，第四组无菌率达72.6％，但灭菌时间过长对材料有伤害，抑制外植体的萌芽生长，很多褐化死亡。所以认定组合2是较好的组合，成功率49.6％。利用这个试验结果，在2018年1月至3月期间把六出花Lovely的无菌体系建立起来，共得到无菌成活苗50瓶。

2、六出花Cleo、Pink Floyd品种的无菌体系的建立

六出花Cleo、Pink Floyd品种的无菌体系的建立是在2018年3月中下旬，外植体灭菌试剂与方式完全采用六出花Lovely的最佳灭菌方式，即在75％酒精中浸泡12s，再将其在0.1％升汞中浸泡4min，无菌水冲洗10次；定植在空白培养基里，置于25℃，光照12h，光强2000lx，存活率达到约60％，高于Lovely，由此看出六出花品种之间在无菌体系建立过程中存在一定差异性。

四、六出花继代培养配方研究

1、六出花Lovely继代配方研究

将在空白培养基上成活的无菌外植体，分别转移到以下MS培养基中附加不同的激素配比。琼脂浓度为5.8g/l，蔗糖浓度30g/l。每处理10瓶，每瓶3株。置于25℃，光照12h，光强2000lx进行培养，观察生长发育情况。

表6六出花Lovely继代配方初步设计试验

通过观察对比发现M4组合即MS+6-BA1.0+NAA0.7芽大部分维持现状，只有极为个别几个稍微分化，并且每个组合都存在微玻璃化现象，经分析需要根据此结果重新设计配方。

2、促进六出花Lovely继代分化配方研究

从第一次继代培养结果看，细胞分裂素6-BA浓度越高，生长素NAA越低越促进分化，只有两者合理搭配才能达到理想的分化效果。本试验对激素进行了调整，同时增加琼脂的浓度为6.0g/l，基本培养基为MS，每组合各20瓶，每瓶3株，置于25℃，光照12h，光强2000lx进行培养。试验设计与结果如下：

表7六出花Lovely继代配方激素调整试验

试验结果显示，四周之后发现Lovely在2组MS+NAA0.5+6-BA2.0中大部分开始出现分化，而且比其他各组分化稍明显，这时芽的增殖数基本稳定在4.34，达到分化系数指标，生长迅速，芽苗深绿色。3组合中显示芽在诱导或增殖后在同一培养基上培养时间过长会使植株干枯，最终逐渐死亡，因此适时对植株进行转接培养是十分必要的，转接太早不但会影响增殖系数而且影响后代的生长，28-30天进行转接继代是比较合适的，此时转接的苗增殖系数高切后代生长健壮。同时ck同上一试验M4进行对比发现，增加琼脂浓度为6.0g/l时，玻璃化明显降低，在2组NAA0.5、6-BA2.0组合中玻璃化率降为1.3％，达到技术指标要求。

3、六出花Cleo、Pink Floyd品种的继代配方研究

六出花Cleo、Pink Floyd品种在继代培养基的选择上参考Lovely的实验方法及配方，采用MS基本培养基(附加琼脂6.0g/l，蔗糖30g/l)，具体设计如下：

表8六出花Cleo、Pink Floyd继代配方试验

试验结果表明：组合1即MS+6-BA2.0+NAA0.5分化系数较高，均达到4以上，从玻璃化来看，六出花Cleo、Pink Floyd品种中的所有实验组合均没有出现玻璃化。因此可以初步推定激素BA2.0mg/L、NAA0.5mg/L组合是适用于六出花的继代培养。

五、六出花生根配方研究

1、六出花Lovely生根配方设计

根据国外资料报道，六出花生根方面效果较明显的激素及其浓度范围如下：IBA(IAA)0-0.5mg/L+NAA0.1-1.5mg/L，蔗糖浓度在15-30g/L，据此针对六出花Lovely设计了两个正交试验，以1/2MS为基本培养基，分别以IBA、NAA、蔗糖和IAA、NAA、蔗糖作为正交实验的三个因子，根据经验设计了IBA和IAA两种不同激素和NAA搭配的两个正交试验方法，具体实验设计与结果如表9、表10，选择生长状态一致的苗子，每个处理做20瓶，每瓶放3棵，两周后观察并统计生根率与生根质量。

表9六出花Lovely生根配方设计正交试验1

表10六出花Lovely生根配方设计正交试验2

六出花Lovely的生根配方设计，一从两个正交实验结果看，表9中的组合9，表10中的组合3生根率和均根数相对来说都较高；二通过两个正交试验最佳组合的对比结果来看，IBA效果要好于IAA，而且成本低于IAA，尤其是表9中的组合9：1/2MS+NAA2mg/L+IBA0.1的生根率达到了91.68％，已达到生根技术要求指标。因此通过实验结果分析可得出如下结论：NAA的使用浓度为2mg/L，蔗糖浓度在25g/L，IBA的浓度为0.1mg/L较为合适。

2、六出花Cleo、Pink Floyd品种的生根配方研究

为了进一步证明以上试验中生根配方的正确性以及适用性，同样的培养条件，温度25℃，光照12h，光强2000lx，完全采用六出花Lovely的最佳生根配方，即1/2MS+IBA0.1+NAA2.0，蔗糖25g/L，针对于六出花Cleo、Pink Floyd品种进行生根试验研究，结果显示，生根率均达到90％以上。

六、六出花组培苗驯化基质的筛选及配比试验

驯化基质的选择：为使六出花组培苗适应环境的转变，移栽基质应以疏松通透性好、保水失水系统优良，不易发霉长菌的原料为主，保肥的原料为辅才能获得最佳成活率。组培苗驯化中常用基质主要有珍珠岩、蛭石、草炭，根据不同组培苗所需基质的透气性和持水量的不同，利用基质的不同配比进行调节。每个基质组合定植10株，其驯化条件过程如上所述。正交实验设计及结果如下(表中水平为体积比)：

表11六出花驯化苗的基质配比正交试验结果

结果分析：通过极差分析法对此次正交实验结果进行分析得出，组合7结果显示驯化成活率为92.26％，整齐度达到3，为95％以上，达到驯化技术要求指标，可以达到六出花组培快繁生产需求，为六出花优良品种的应用推广做好了基础。因此，最佳基质配方的理论组合配比为珍珠岩：蛭石：草炭＝0.5：0.5：1.5＝1：1：3，对六出花的驯化成活率影响最大因素的是珍珠岩在基质中所占的比例，增加驯化环境的通透性，同时保湿性较好，成活率较高，可达到90％以上。

本说明书中的各个实施例均采用递进的方式描述，各个实施例之间相同相似的部分互相参见即可，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处。尤其，对于系统实施例而言，由于其基本相似于方法实施例，所以描述的比较简单，相关之处参见方法实施例的部分说明即可。

以上仅为本申请的实施例而已，并不用于限制本申请。对于本领域技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的权利要求范围之内。