一株产香气物质的克鲁维毕赤酵母Pichiakluyveri菌株HSP11及其应用

摘要

本发明“一株产香气物质的克鲁维毕赤酵母Pichia kluyveri菌株HSP11及其应用”属于微生物技术领域。所述一株克鲁维毕赤酵母Pichia kluyveri菌株HSP11的保藏号为CCTCC M2021087。该菌株发酵葡萄汁生成的乙酸戊酯产量高达2518.31μg/L，乙酸异丁酯的产量高达1417.05μg/L，丙酸乙酯的产量高达1551.25μg/L，3‑甲硫基丙醇乙酸酯的产量高达1364.91μg/L，1‑辛烯‑3‑醇的产量高达1538.96μg/L。

说明书

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株产香气物质的克鲁维毕赤酵母Pichiakluyveri菌株 HSP11及其应用。

背景技术

克鲁维毕赤酵母菌(Pichia kluyveri)，其生物学特征为：白色至奶油色的菌落，湿润，粘稠，易挑起，菌落正、反面及中央与边缘的颜色一致，有假菌丝，生长过程中带果香味；球形或卵圆形；能产淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶和纤维素酶，可用于发酵葡萄糖、蔗糖、棉子糖。同化葡萄糖、蔗糖、棉子糖、纤维二糖、麦芽糖、松三糖、木糖、乙醇、甘油；不同化半乳糖、乳糖、蜜二糖、山梨糖、可溶性淀粉。

目前已报道的克鲁维毕赤酵母菌的主要用途有：饲料发酵，餐厨垃圾发酵降解、果酸降解。例如：

发明专利申请202010561573.7公开了一种餐厨垃圾高温生物降解用的微生物菌剂，该微生物菌剂就包括一株保藏号为CCTCC NO：M 2019263的克鲁维毕赤酵母(Pichiakluyveri)ZJB-091。

发明专利申请202010525384.4提供了一株保藏号为CGMCC No.19722的克鲁维毕赤酵母 (Pichia kluyveri)WTB20042302。该菌株可利用柠檬酸和酒石酸，且对果酒中的柠檬酸、乳酸、甲酸、乙酸和琥珀酸都有降解能力。

发明专利申请202010852525.3披露了一株可降解L-苹果酸的保藏编号为CCTCCNO：M 2020372的克鲁维毕赤酵母(Pichia kluyveri)LI-27-1。

但本领域目前尚未报道过可产1-辛烯-3-醇、玫瑰醚、醋酸辛酯等香气物质的克鲁维毕赤酵母 (Pichia kluyveri)。

发明内容

基于本领域的上述空白，本发明筛选得到一株以葡萄汁为底物发酵高产1-辛烯-3-醇、玫瑰醚、醋酸辛酯等香气物质的克鲁维毕赤酵母Pichia kluyveri菌株HSP11。

本发明的技术方案如下：

一株克鲁维毕赤酵母Pichia kluyveri菌株HSP11，其保藏号为CCTCC M 2021087。

保藏号为CCTCC M 2021087的克鲁维毕赤酵母Pichia kluyveri菌株HSP11在生产香气物质方面的应用。

所述香气物质选自由异戊醇、正辛醇、正庚醇、辛酸乙酯、1-辛烯-3-醇、玫瑰醚、醋酸辛酯、苯乙醛、异戊酸、异丁酸、芳樟醇、3-甲硫基丙醇乙酸酯、乙酸香叶酯、环氧-α-萜烯基乙酸酯、乙酸叶醇酯、乙酸戊酯、乙酸异丁酯、乙酸丁酯、异丁酸乙酯、庚酸乙酯、丙酸乙酯组成的组。

所述香气物质选自由1-辛烯-3-醇、玫瑰醚、醋酸辛酯、苯乙醛、异戊酸、异丁酸、芳樟醇、 3-甲硫基丙醇乙酸酯、乙酸香叶酯、环氧-α-萜烯基乙酸酯、乙酸叶醇酯、乙酸戊酯、乙酸异丁酯、乙酸丁酯、异丁酸乙酯、庚酸乙酯、丙酸乙酯组成的组。

保藏号为CCTCC M 2021087的克鲁维毕赤酵母Pichia kluyveri菌株HSP11在酿酒方面的应用。

一种酿酒发酵剂，其特征在于，其发酵活性物质包括保藏号为CCTCC M 2021087的克鲁维毕赤酵母Pichia kluyveri菌株HSP11。

所述发酵活性物质还包括酿酒酵母。

所述酿酒发酵剂为菌剂；

优选地，所述酿酒发酵剂还包括菌剂可接受的辅料；

优选地，所述菌剂可接受的辅料包括菌的培养基物质；所述菌的培养基物质包括但不限于：淀粉、蔗糖、蛋白胨、水。

一种葡萄酒酿造方法，其特征在于，采用保藏号为CCTCC M 2021087的克鲁维毕赤酵母Pichia kluyveri菌株HSP11进行发酵酿造。

所述发酵指采用所述克鲁维毕赤酵母Pichia kluyveri菌株HSP11以葡萄或葡萄汁做为底物进行发酵。

优选地，所述克鲁维毕赤酵母Pichia kluyveri菌株HSP11在底物中的添加浓度为10

本发明筛选得到一株菌株，经香气物质成分鉴定实验测得其可高产1-辛烯-3-醇、玫瑰醚、醋酸辛酯等一系列香气物质，并且对比商业的酿酒酵母菌株F33，本发明的菌株还可产生F33 无法生成的香气物质，例如：1-辛烯-3-醇、玫瑰醚、醋酸辛酯、苯乙醛、异戊酸、异丁酸、芳樟醇、3-甲硫基丙醇乙酸酯、乙酸香叶酯、环氧-α-萜烯基乙酸酯、乙酸叶醇酯、乙酸戊酯、乙酸异丁酯、乙酸丁酯、异丁酸乙酯、庚酸乙酯、丙酸乙酯，其中乙酸戊酯产量高达2518.31μg/L，乙酸异丁酯的产量高达1417.05μg/L，丙酸乙酯的产量高达1551.25μg/L，3-甲硫基丙醇乙酸酯的产量高达1364.91μg/L，1-辛烯-3-醇的产量高达1538.96μg/L。经鉴定，该菌株为一株克鲁维毕赤酵母Pichia kluyveri菌株，申请人将其命名为HSP11，并将该菌株送保藏。

本发明的克鲁维毕赤酵母Pichia kluyveri菌株HSP11的保藏信息如下：

命名：HSP11

分类名称：克鲁维毕赤酵母

拉丁名称：Pichia kluyveri

保藏号：CCTCC M 2021087

保藏机构：中国典型培养物保藏中心

保藏地址：中国.武汉.武汉大学

保藏日期：2021年1月15日。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明的详细内容做进一步具体说明，但并不以此限制本发明的保护范围。

实验例1中使用的葡萄品种的来源和产地如下表1所示：

表1

上表1中的葡萄品种均为公知公用的葡萄品种，也可商购获得。

实验例2中使用的葡萄品种为威代尔冰葡萄，购自宁夏巴格斯醉美国际酒庄有限公司；

商业菌株-酿酒酵母F33购自法国拉氟德(Laffort)公司。

第1组实施例、本发明的菌株HSP11

本组实施例提供一株克鲁维毕赤酵母Pichia kluyveri菌株HSP11，其保藏号为CCTCC M 2021087。

第2组实施例、本发明菌株HSP11的应用

本组实施例提供保藏号为CCTCC M 2021087的克鲁维毕赤酵母Pichia kluyveri菌株HSP11 在生产香气物质方面的应用。

在一些实施例中，所述香气物质选自由异戊醇、正辛醇、正庚醇、辛酸乙酯、1-辛烯-3-醇、玫瑰醚、醋酸辛酯、苯乙醛、异戊酸、异丁酸、芳樟醇、3-甲硫基丙醇乙酸酯、乙酸香叶酯、环氧-α-萜烯基乙酸酯、乙酸叶醇酯、乙酸戊酯、乙酸异丁酯、乙酸丁酯、异丁酸乙酯、庚酸乙酯、丙酸乙酯组成的组。

在另一些实施例中，所述香气物质选自由1-辛烯-3-醇、玫瑰醚、醋酸辛酯、苯乙醛、异戊酸、异丁酸、芳樟醇、3-甲硫基丙醇乙酸酯、乙酸香叶酯、环氧-α-萜烯基乙酸酯、乙酸叶醇酯、乙酸戊酯、乙酸异丁酯、乙酸丁酯、异丁酸乙酯、庚酸乙酯、丙酸乙酯组成的组，这些香气物质中的任意一种在产量上HSP11菌株都比已知酿酒酵母F33的要高很多，具体对比数值可参考下面的表1。

第3组实施例、本发明菌株HSP11的酿酒应用

本组实施例提供保藏号为CCTCC M 2021087的克鲁维毕赤酵母Pichia kluyveri菌株HSP11 在酿酒方面的应用。

第4组实施例、本发明的酿酒发酵剂

本组实施例提供一种酿酒发酵剂。本组所有的实施例都具备如下共同特征：所述酿酒发酵剂的发酵活性物质包括保藏号为CCTCC M 2021087的克鲁维毕赤酵母Pichiakluyveri菌株 HSP11。

在进一步的实施例中，所述发酵活性物质还包括酿酒酵母。本领域技术人员可根据本发明的教导，将本发明的HSP11菌株与本领域现有常见的酿酒酵母联用，用于来发酵酿酒。

在具体的实施例中，所述酿酒发酵剂为菌剂；

在优选的实施例中，所述酿酒发酵剂还包括菌剂可接受的辅料；

在另一些优选的实施例中，所述菌剂可接受的辅料包括菌的培养基物质；所述菌的培养基物质包括但不限于：淀粉、蔗糖、蛋白胨、水。

第5组实施例、本发明的葡萄酒酿造方法

本组实施例提供一种葡萄酒酿造方法。本组所有的实施例都具备如下共同特征：采用保藏号为CCTCC M 2021087的克鲁维毕赤酵母Pichia kluyveri菌株HSP11进行发酵酿造。

在具体的实施例中，所述发酵指采用所述克鲁维毕赤酵母Pichia kluyveri菌株HSP11以葡萄或葡萄汁做为底物进行发酵。

在优选的实施例中，所述克鲁维毕赤酵母Pichia kluyveri菌株HSP11在底物中的添加浓度为10

实验例1、本发明克鲁维毕赤酵母Pichia kluyveri菌株HSP11的筛选过程

采集宁夏贺兰山东麓不同产地、不同品种酿酒葡萄(如表1所示)，剔除腐烂、发霉、破损的果粒及杂物，称取均匀完整葡萄果粒10.0g，加入90mL无菌的YPD液体培养基中，振荡10 min，制成菌悬液，采用梯度稀释的方法，将适宜稀释度菌悬液涂布在添加100mg/L氯霉素的YPD固体培养基上，28℃培养2d～3d，依据菌落形态，在YPD固体培养基上多次划线纯化，获得纯化菌株。纯化后的菌株于YPD培养基活化24h后，取1mL菌液按照接Biospin 真菌基因组DNA提取试剂盒说明书提取酵母基因组，以引物NL-1 (5'-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3')和NL-4(5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3') 进行PCR扩增，测序获得26S rDNA片段的基因序列，通过NCBI的BLAST比对，获得同源性较高的已知标准菌株信息，并对相似度超过99％以上的菌株做种属鉴定，最终获得菌株种属信息。

本实验例中一共获得35株Pichia kluyveri菌株。分别将35株Pichia kluyveri菌株按初始浓度10

命名：HSP11

分类名称：克鲁维毕赤酵母

拉丁名称：Pichia kluyveri

保藏号：CCTCC M 2021087

保藏机构：中国典型培养物保藏中心

保藏日期：2021年1月15日。

实验例2、本发明克鲁维毕赤酵母Pichia kluyveri菌株HSP11产香气物质的数据

葡萄品种：威代尔冰葡萄

葡萄汁生产过程：对采收后的冰葡萄通过气囊压榨机进行带冰压榨操作，同时添加二氧化硫 (50mg/L K

葡萄汁发酵条件：浸渍后的葡萄汁分别按初始浓度10

各香气物质的检测方法：采用顶空-固相微萃取法-气相质谱法(HS-SPME-GC/MS)。准确量取8mL葡萄酒样品加入含有1.5g NaCl顶空瓶中，同时394.08μg/L 4-甲基-1-戊醇(内标物)，加盖密封。插入CAR/DVB/PDMS萃取纤维，45℃下吸附30min后将萃取纤维在GC进样口 250℃下解吸3min，进行GC-MS分析。色谱柱：InertCap WAX极性色谱柱(60m×0.25mm，0.25μm)；升温程序为：40℃保持5min，以3℃/min升至120℃，再以8℃/min升至230℃，保持10min；载气(He)流速0.8mL/min，不分流。电子轰击离子源；电子能量70eV；传输线温度275℃；离子源温度230℃；激活电压1.5V；灯丝流量0.25mA；质量扫描范围m/z 33～450。采用外标定量法进行化合物定量分析。

以同一品种的葡萄生产的同一批葡萄汁为底物，在相同的发酵条件下，分别以商业菌株-酿酒酵母F33和本发明的克鲁维毕赤酵母Pichia kluyveri菌株HSP11对等量的葡萄汁进行发酵酿酒处理，再经通过顶空-固相微萃取法-气相质谱方法检测各香气物质的含量(单位：μg/L，含义：每升葡萄酒中该香气物质的含量)，得到下表2：

表2

上表1中的香气阈值指人类可以嗅闻到该物质的最低浓度下限值。

SEQUENCE LISTING

<110> 宁夏农产品质量标准与检测技术研究所

<120> 一株产香气物质的克鲁维毕赤酵母Pichia kluyveri菌株及其应用

<130> P201028/NNZ

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物NL-1

<400> 1

gcatatcaat aagcggagga aaag 24

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物NL-4

<400> 2

ggtccgtgtt tcaagacgg 19