一种提取乳鼠肾原代细胞的方法

摘要

本发明涉及一种提取乳鼠肾原代细胞的方法，其包括如下步骤：(1)处理乳鼠获得乳鼠肾脏；(2)将肾脏剪成数块后再次用PBS溶液洗涤一次，吸除PBS溶液并将肾脏剪碎，先加入含胰酶的第一消化液，消化处理8‑12min,然后再加入含胶原酶的第二消化液，消化处理15‑20min,然后过滤得悬液；(3)将悬液进行离心处理，加入红细胞裂解液处理后终止消化，然后加入细胞完全培养基进行重悬，贴壁去除巨噬细胞；(4)细胞培养，长到需要的程度，即得。优点为，依次使用低浓度的含胰酶的第一消化液和适宜浓度的含胶原酶的第二消化液对乳鼠的肾脏剪碎组织进行消化处理，综合二者优点，处理效率高且保证对细胞的损伤小，可获得纯度较高且活性较好的乳鼠肾原代细胞。

说明书

技术领域

本发明属于原代细胞提取和培养的技术领域，具体涉及一种提取乳鼠肾原代细胞的方法。

背景技术

原代细胞因为更贴近活体动物状态而广泛用于核酸转染、药物暴露等实验。由于原代细胞提取方式存在繁琐及易污染的问题，另外组织块贴壁法提取原代细胞和热消化法分别存在生长周期长影响实验进度及对细胞损伤较大致使细胞存活率低等问题。因此如何便捷、有效地提取出高存活率、无污染的乳鼠肾原代细胞是相关实验研究的一大问题。

乳鼠体内的组织与器官均没有发育成熟，处于旺盛的分裂生长时期，因此是用作细胞提取及培养的良好材料。由于肾脏的细胞类型较为单一并且肾脏易于从乳鼠体内取出，将肾作为实验材料是较好的选择。现有技术中对肾原代细胞提取时，通常使用单一的胰蛋白酶或胶原酶对乳鼠肾脏组织进行处理，使其成为单细胞。前者因消化能力强，易使组织消化过度而造成细胞损伤，因此用胰蛋白酶消化处理时往往存在细胞存活率偏低的问题；后者虽然较温和，但其价格过高且消化速度过慢，存在提取时间过长、易污染的问题。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种提取乳鼠肾原代细胞的方法，旨在使用双酶消化处理的方式，克服现有技术存在的上述不足。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种提取乳鼠肾原代细胞的方法，其包括如下步骤：

(1)将乳鼠采用颈椎脱臼处死，在无菌间内用75％酒精浸泡消毒乳鼠体表3-5min,然后在细胞操作台中，将乳鼠背部皮肤剪出一工字型开口，然后皮肤拉开并固定使腰背部肌肉暴露出来，用75％酒精消毒乳鼠背部肌肉，在脊柱两侧各剪一切口，取出肾脏，置于盛有PBS溶液的平皿中，除去肾膜与脂肪；

(2)将肾脏剪成数块后再次用PBS溶液洗涤一次，吸除PBS溶液并将肾脏剪碎，先加入含胰酶的第一消化液，消化处理8-12min,然后再加入含胶原酶的第二消化液，消化处理15-20min,然后过滤去除未消化组织及肾小球，得悬液；

(3)将悬液进行离心处理，加入红细胞裂解液吹打混匀后静置5min,然后加入PBS终止红细胞裂解液的消化作用，然后再次离心处理，加入PBS进行洗涤，随后离心，去除上清后，加入细胞完全培养基进行重悬，将细胞悬液转移至1029Corning培养皿中，于细胞培养箱贴壁30-45min,使巨噬细胞贴壁去除；

(4)将1029Corning培养皿中的培养基吸入到3003Corning培养皿中培养，三天后进行第一次换液，期间勿动，之后隔天换液一次，直至长到需要的程度，即得乳鼠肾原代细胞。

在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下进一步的具体选择。

具体的，步骤(1)中乳鼠为三日龄乳鼠。

具体的，步骤(2)中第一消化液为0.05％胰酶-EDTA溶液，第二消化液为0.2％胶原酶IV溶液。

具体的，步骤(2)中第一次消化处理和第二次消化处理的环境温度均为37℃。

具体的，步骤(2)中第一消化液和第二消化液的用量均按照乳鼠2颗肾/0.5-1mL的量加入。

具体的，步骤(2)中第一次消化和第二次消化均每3min吹打一次使消化更均匀。

具体的，步骤(3)中肾脏首先剪成4-6块，PBS洗涤后再剪碎成大小为1mm

具体的，所述细胞完全培养基由以下各原理混配而成：DMEM(1X)培养基、2％双抗和15％灭活胎牛血清。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

依次使用低浓度的含胰酶的第一消化液和适宜浓度的含胶原酶的第二消化液对乳鼠的肾脏剪碎组织进行消化处理，综合利用了两种酶的优点，处理效率高且保证能够尽量减少组织消化时对细胞的损伤，可获得纯度较高且活性较好的乳鼠肾原代细胞。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明的作进一步的详细描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

以下实施例中，用到的方法若无特别说明则均为本领域的常规方法，用到的药品或设备若无特别说明则均为市售产品。

实施例1

一种提取乳鼠肾原代细胞的方法，其包括如下步骤：

(1)将3日龄乳鼠采用颈椎脱臼处死，在无菌间内用75％酒精浸泡消毒乳鼠体表3-5min,然后在细胞操作台中，将乳鼠背部皮肤剪出一工字型开口，然后皮肤拉开并固定使腰背部肌肉暴露出来，用75％酒精消毒乳鼠背部肌肉，在脊柱两侧各剪一切口，取出肾脏，置于盛有PBS溶液的平皿中，除去肾膜与脂肪；

(2)将两颗肾脏剪成4-6块后再次用PBS溶液洗涤一次，吸除PBS溶液并将肾脏剪碎，剪碎后的组织块大小在1mm

(3)将悬液进行离心处理，加入红细胞裂解液吹打混匀后静置5min,然后加入PBS终止红细胞裂解液的消化作用，然后再次离心处理，加入PBS进行洗涤，随后离心，去除上清后，加入细胞完全培养基(DMEM(1X)培养基、2％双抗和15％灭活胎牛血清)进行重悬，将细胞悬液转移至1029Corning培养皿中，于细胞培养箱贴壁30-45min,使巨噬细胞贴壁去除；

(4)将1029Corning培养皿中的培养基吸入到3003Corning培养皿中培养，三天后进行第一次换液，期间勿动，之后隔天换液一次，直至长到需要的程度，即得乳鼠肾原代细胞。

实施例2

一种提取乳鼠肾原代细胞的方法，其包括如下步骤：

(1)将3日龄乳鼠采用颈椎脱臼处死，在无菌间内用75％酒精浸泡消毒乳鼠体表3-5min,然后在细胞操作台中，将乳鼠背部皮肤剪出一工字型开口，然后皮肤拉开并固定使腰背部肌肉暴露出来，用75％酒精消毒乳鼠背部肌肉，在脊柱两侧各剪一切口，取出肾脏，置于盛有PBS溶液的平皿中，除去肾膜与脂肪；

(2)将两颗肾脏剪成4-6块后再次用PBS溶液洗涤一次，吸除PBS溶液并将肾脏剪碎，剪碎后的组织块大小在1mm

(3)将悬液进行离心处理，加入红细胞裂解液吹打混匀后静置5min,然后加入PBS终止红细胞裂解液的消化作用，然后再次离心处理，加入PBS进行洗涤，随后离心，去除上清后，加入细胞完全培养基(DMEM(1X)培养基、2％双抗和15％灭活胎牛血清)进行重悬，将细胞悬液转移至1029Corning培养皿中，于细胞培养箱贴壁30-45min,使巨噬细胞贴壁去除；

(4)将1029Corning培养皿中的培养基吸入到3003Corning培养皿中培养，三天后进行第一次换液，期间勿动，之后隔天换液一次，直至长到需要的程度，即得乳鼠肾原代细胞。

实施例3

一种提取乳鼠肾原代细胞的方法，其包括如下步骤：

(1)将3日龄乳鼠采用颈椎脱臼处死，在无菌间内用75％酒精浸泡消毒乳鼠体表3-5min,然后在细胞操作台中，将乳鼠背部皮肤剪出一工字型开口，然后皮肤拉开并固定使腰背部肌肉暴露出来，用75％酒精消毒乳鼠背部肌肉，在脊柱两侧各剪一切口，取出肾脏，置于盛有PBS溶液的平皿中，除去肾膜与脂肪；

(2)将两颗肾脏剪成4-6块后再次用PBS溶液洗涤一次，吸除PBS溶液并将肾脏剪碎，剪碎后的组织块大小在1mm

(3)将悬液进行离心处理，加入红细胞裂解液吹打混匀后静置5min,然后加入PBS终止红细胞裂解液的消化作用，然后再次离心处理，加入PBS进行洗涤，随后离心，去除上清后，加入细胞完全培养基(DMEM(1X)培养基、2％双抗和15％灭活胎牛血清)进行重悬，将细胞悬液转移至1029Corning培养皿中，于细胞培养箱贴壁30-45min,使巨噬细胞贴壁去除；

(4)将1029Corning培养皿中的培养基吸入到3003Corning培养皿中培养，三天后进行第一次换液，期间勿动，之后隔天换液一次，直至长到需要的程度，即得乳鼠肾原代细胞。

对比例1

一种提取乳鼠肾原代细胞的方法，其包括如下步骤：

(1)将3日龄乳鼠采用颈椎脱臼处死，在无菌间内用75％酒精浸泡消毒乳鼠体表3-5min,然后在细胞操作台中，将乳鼠背部皮肤剪出一工字型开口，然后皮肤拉开并固定使腰背部肌肉暴露出来，用75％酒精消毒乳鼠背部肌肉，在脊柱两侧各剪一切口，取出肾脏，置于盛有PBS溶液的平皿中，除去肾膜与脂肪；

(2)将两颗肾脏剪成4-6块后再次用PBS溶液洗涤一次，吸除PBS溶液并将肾脏剪碎，剪碎后的组织块大小在1mm

(3)将悬液进行离心处理，加入红细胞裂解液吹打混匀后静置5min,然后加入PBS终止红细胞裂解液的消化作用，然后再次离心处理，加入PBS进行洗涤，随后离心，去除上清后，加入细胞完全培养基(DMEM(1X)培养基、2％双抗和15％灭活胎牛血清)进行重悬，将细胞悬液转移至1029Corning培养皿中，于细胞培养箱贴壁30-45min,使巨噬细胞贴壁去除；

(4)将1029Corning培养皿中的培养基吸入到3003Corning培养皿中培养，三天后进行第一次换液，期间勿动，之后隔天换液一次，直至长到需要的程度，即得乳鼠肾原代细胞。

对比例2

一种提取乳鼠肾原代细胞的方法，其包括如下步骤：

(1)将3日龄乳鼠采用颈椎脱臼处死，在无菌间内用75％酒精浸泡消毒乳鼠体表3-5min,然后在细胞操作台中，将乳鼠背部皮肤剪出一工字型开口，然后皮肤拉开并固定使腰背部肌肉暴露出来，用75％酒精消毒乳鼠背部肌肉，在脊柱两侧各剪一切口，取出肾脏，置于盛有PBS溶液的平皿中，除去肾膜与脂肪；

(2)将两颗肾脏剪成4-6块后再次用PBS溶液洗涤一次，吸除PBS溶液并将肾脏剪碎，剪碎后的组织块大小在1mm

(3)将悬液进行离心处理，加入红细胞裂解液吹打混匀后静置5min,然后加入PBS终止红细胞裂解液的消化作用，然后再次离心处理，加入PBS进行洗涤，随后离心，去除上清后，加入细胞完全培养基(DMEM(1X)培养基、2％双抗和15％灭活胎牛血清)进行重悬，将细胞悬液转移至1029Corning培养皿中，于细胞培养箱贴壁30-45min,使巨噬细胞贴壁去除；

(4)将1029Corning培养皿中的培养基吸入到3003Corning培养皿中培养，三天后进行第一次换液，期间勿动，之后隔天换液一次，直至长到需要的程度，即得乳鼠肾原代细胞。

经显微观察和相关检测，上述三个实施例最终得到的乳鼠肾原代细胞的存活率均明显高于采用单一酶消化处理的对比例1和2。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。