提高MSC分化为神经前体细胞产量的悬浮摇动培养方法

摘要

本发明涉及一种提高MSC分化为神经前体细胞产量的悬浮摇动培养方法，该方法在第二次传代培养时使用细胞培养摇床进行摇动培养，所述细胞培养摇床的摇动频率为10～20次/分钟、摇动角度为10～20°，第二次传代培养使用未经过“促进细胞贴壁”处理的细胞培养器皿，能够进一步提高神经前体细胞的产量。使用所述的悬浮摇动培养方法对间充质干细胞(MSC)进行培养，可以提高间充质干细胞分化成神经前体细胞的效率，提高神经前体细胞的产量。

说明书

技术领域

本发明涉及细胞生物学技术领域，特别涉及一种提高MSC分化为神经前体细胞产量的悬浮摇动培养方法。

背景技术

中枢神经系统损伤或发育不良会引起神经细胞凋亡、神经组织缺损、运动及思维等能力缺陷，最终导致终身残疾甚至寿命缩短。中枢神经系统自我修复能力极低，治疗此类疾病需要使用细胞替代疗法，对凋亡缺损的神经细胞和组织进行补充，进而恢复神经系统的功能。

神经前体细胞(Neural progenitor cells，NPC)在神经系统发育和神经损伤修复过程中起重要作用，成体神经损伤修复困难与NPC缺乏或沉默有关。既往的研究表明，移植同种异体NPC能缓解帕金森、多发性硬化、脑胶质瘤等疾病，能促进神经退行性疾病、外伤等轴突损伤髓鞘新生和修复，缓解临床症状，但NPC来源极为有限，限制了其临床应用。成体NPC的分离依赖于组织学部位，一般成年人体内很难取材，而流产胎儿脑组织分离NPC又受到伦理学限制，样本资源成为限制NPC研究和应用的瓶颈。近些年来，对干细胞分化机制的研究取得了很大进展，发现胚胎干细胞和多种成体干细胞有神经前体细胞分化潜能，为神经前体细胞制备提供了新的思路。间充质干细胞(Mesenchymal stem cell，MSC)是样本资源最丰富的成体干细胞，是基于干细胞再生医学的最有前景的种子细胞。脂肪、脐带、骨髓等多种组织来源的间充质干细胞能分化成Netstin阳性神经前体细胞，具有神经元、神经胶质细胞等的分化潜能。

目前的研究发现，使用EGF、bFGF等细胞因子可以诱导MSCs向神经组织细胞分化。但如果要得到均一性高的Nestin+神经前体细胞则需要经过神经球培养阶段。神经球培养是将MSC接种至疏水培养容器中培养，形成多细胞聚集的细胞球，属于半悬浮培养体系，其培养容量小、操作复杂、难于传代扩增，导致细胞收率低，限制了基于神经前体细胞的神经组织修复医学的产业化转化。

发明内容

针对现有技术中的缺陷，本发明提出了一种提高MSC分化为神经前体细胞产量的悬浮摇动培养方法，该方法在第二次传代培养时使用细胞培养摇床进行摇动培养，所述细胞培养摇床的摇动频率为10～20次/分钟、摇动角度为10～20°，使用所述的悬浮摇动培养方法对间充质干细胞(MSC)进行培养，可以提高间充质干细胞分化成神经前体细胞的效率，提高神经前体细胞的产量。

本发明提供一种提高MSC分化为神经前体细胞产量的悬浮摇动培养方法，包括如下步骤：

(1)分离间充质干细胞，原代培养；

(2)将原代培养后的间充质干细胞传代接种于细胞培养器皿表面，添加细胞培养基，进行第一次传代培养；

(3)将第一次传代培养后的间充质干细胞再次传代接种于细胞培养器皿表面，添加无血清成分的细胞培养基，进行第二次传代培养；

(4)用细胞培养摇床进行摇动培养，收获神经前体细胞；

所述细胞培养摇床的摇动频率为10～20次/分钟、摇动角度为10～20°。

进一步的，所述细胞培养摇床的摇动频率为15次/分钟、摇动角度为15°。实验证明摇动频率15次/分钟、摇动角度15°的设置下神经前体细胞的产量最高。

进一步的，所述步骤(1)中所述的间充质干细胞来源于人类。来源于人类的间充质干细胞用于获得人神经前体细胞，可应用于人神经性疾病的治疗。

进一步的，所述间充质干细胞来源包括骨髓、脐血、脐带、胎盘和脂肪组织。所述组织都是人体容易获取间充质干细胞的组织。

进一步的，所述步骤(2)中第一次传代培养使用的所述细胞培养器皿经过“促进细胞贴壁”处理；所述步骤(3)中第二次传代培养使用的所述细胞培养器皿未经过“促进细胞贴壁”处理。第二次传代培养使用未经过“促进细胞贴壁”处理的细胞培养器皿，能够进一步提高神经前体细胞的产量。

本发明还提供所述的悬浮摇动培养方法在诱导神经前体细胞中的应用。

综上，与现有技术相比，本发明达到了以下技术效果：

1.使用本发明的悬浮摇动培养方法获得的神经前体细胞的阳性率更高，产量更高。

2.本发明的悬浮摇动培养方法具有较大的可扩展性，可以放大到培养面积更大的单一培养器皿，减少器皿总数同时提高产量，简化操作，降低成本。

3.本发明的悬浮摇动培养方法得到的神经前体细胞可以用于治疗各类神经损伤性疾病。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明实施例不同培养条件下神经前体细胞产量对比。

图2为本发明的悬浮摇动培养方法的示意图。

图3为表面处理和接种密度对神经前体细胞产量的影响。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

使用半悬浮培养体系，Nestin阳性的神经前体细胞比例较低，但本发明使用悬浮摇动培养方法，Nestin阳性神经前体细胞比例显著提升。Nestin是一种中间丝类型的蛋白，能够特异性的表达在神经上皮干细胞上一种分子标记物，可能对神经元的分化有作用。Nestin仅在胚胎发育早期的神经上皮表达，出生后表达就停止，一般被视为神经干细胞的特征性标志物。故使用悬浮摇动培养方法获得的神经前体细胞Nestin阳性率显著增加说明本发明的悬浮摇动培养方法通过改变培养方式，采用摇动频率10～20次/分钟、摇动角度10～20°，能够提高间充质干细胞分化成神经前体细胞的效率，提高神经前体细胞的产量。

常规细胞培养所使用的细胞培养器皿，往往经过“Gas Plasma”等方法处理(例如Corning的

本发明的悬浮摇动培养方法包括如下步骤：

(1)分离间充质干细胞，原代培养；

(2)将原代培养后的间充质干细胞传代接种于细胞培养器皿表面，添加细胞培养基，进行第一次传代培养；

(3)将第一次传代培养后的间充质干细胞再次传代接种于细胞培养器皿表面，添加细胞培养基，进行第二次传代培养；

(4)用细胞培养摇床进行摇动培养，收获神经前体细胞；

所述细胞培养摇床的摇动频率为10～20次/分钟、摇动角度为10～20°。

所述步骤(2)中第一次传代培养使用的所述细胞培养器皿经过“促进细胞贴壁”处理；所述步骤(3)中第二次传代培养使用的所述细胞培养器皿未经过“促进细胞贴壁”处理。第二次传代培养使用未经过“促进细胞贴壁”处理的细胞培养器皿，能够进一步提高神经前体细胞的产量。

以下述实施例为例说明本发明的悬浮摇动培养方法在诱导神经前体细胞中的应用。

实施例1本发明的悬浮摇动培养方法在诱导神经前体细胞中的应用

包括如下步骤：

(1)原代MSC培养

1mL健康成人骨髓原液以9mL MSC基础培养基稀释后，MSC也可以取自人的脐带或脂肪组织，在100mm直径圆形培养皿培养3天后，移除所有培养基，换入10mL新的MSC基础培养基。此阶段MSC定义为P0。P0MSC以MSC基础培养基再培养10天，每2天换液一次，每次10mL。MSC基础培养基成分为MEM-alpha+10％胎牛血清。

(2)第一次传代培养

P0MSC培养10天后，以TrypLE Express消化、收集，再以1:3比例传代至100mm直径圆形培养皿。这些MSC定义为P1，以10mL MSC基础培养基培养2天。

(3)第二次传代培养

P1MSC培养2天后，以TrypLE Express消化、收集，再以2×10

表1适用培养容器和培养基使用量

表2无血清培养基配方

表3无摇动对照组结果

使用摇动角度和摇动速度可调整的“细胞培养摇床”，例如Fisherbrand Open AirRocker，将细胞培养容器置于其上，如图2所示，采用不同的摇动频率和摇动角度进行摇动培养。摇动频率为10～20次/分钟，分别选择10次/分钟和15次/分钟的摇动频率进行数据统计；摇动角度为10～20°，分别选择10°、12.5°和15°的摇动角度进行数据统计。本实施例的参数变量为摇动频率和摇动角度，其他培养条件全部相同。

(4)Nestin阳性神经前体细胞分离

P2 MSC分别按步骤(3)中的摇动频率和摇动角度培养后，以TrypLE Express消化、收集，再以mRNA Flow Cytometry技术，提取Nestin阳性神经前体细胞。分别统计不同摇动频率和摇动角度组别的Nestin阳性细胞百分比和总细胞数量，从而计算出Nestin阳性细胞产量。表4所示为使用不同摇动频率和摇动角度的Nestin阳性细胞百分比。表5所示为使用不同摇动频率和摇动角度的总细胞数量。表6为使用不同摇动频率和摇动角度的Nestin阳性细胞产量，通过表4的Nestin阳性百分比×表5的细胞数量得出。

表4 Nestin阳性细胞百分比

表5培养结束细胞数量

表6培养结束Nestin阳性细胞产量

以上述表6中的Nestin阳性细胞产量结果绘图，结果为图1，图1中培养条件分别如下：

无摇动对照＝摇动频率0次/分钟+摇动角度0°；

摇动培养1＝摇动频率10次/分钟+摇动角度10°；

摇动培养2＝摇动频率15次/分钟+摇动角度10°；

摇动培养3＝摇动频率10次/分钟+摇动角度12.5°；

摇动培养4＝摇动频率15次/分钟+摇动角度12.5°；

摇动培养5＝摇动频率10次/分钟+摇动角度15°；

摇动培养6＝摇动频率15次/分钟+摇动角度15°。

如图1所示，所有摇动培养的Nestin阳性细胞产量，都显著高于无摇动对照(*：P≤0.05)。摇动培养6可在72小时内生产出最多的Nestin阳性神经前体细胞，数量为6.87±0.39×10

实施例2在摇动频率为15次/分钟，摇动角度为15°的设置下，第二次传代分别采用贴壁和不贴壁处理的阳性细胞产量的结果

包括如下步骤：

(1)原代MSC培养

1mL健康成人骨髓原液以9mL MSC基础培养基稀释后，MSC也可以取自人的脐带、脐血、胎盘或脂肪组织，在100mm直径圆形培养皿培养3天后，移除所有培养基，换入10mL新的MSC基础培养基。此阶段MSC定义为P0。P0MSC以MSC基础培养基再培养10天，每2天换液一次，每次10mL。MSC基础培养基成分为MEM-alpha+10％胎牛血清。

(2)第一次传代培养

P0MSC培养10天后，以TrypLE Express消化、收集，再以1:3比例传代至100mm直径圆形培养皿。这些MSC定义为P1，以10mL MSC基础培养基培养2天。

(3)第二次传代培养

P1MSC培养2天后，以TrypLE Express消化、收集，再以2×10

使用摇动角度和摇动速度可调整的“细胞培养摇床”，例如Fisherbrand Open AirRocker，将细胞培养容器置于其上，如图2所示，采用不同的摇动频率和摇动角度进行摇动培养。摇动频率为10～20次/分钟，本实施例选择15次/分钟进行数据统计；摇动角度为10～20°，本实施例选择15°的摇动角度进行数据统计。本实施例分别使用TCT和nTCT表面处理培养容器，见表7，其中TCT表示经促进细胞贴壁处理(Tc-Treated，简称TCT)，nTCT表示未经促进细胞贴壁处理(Non Tc-Treated，简称nTCT)，所有条件下均使用无血清培养基(同实施例1)。本实施例的参数变量为培养基质的表面处理和MSC接种密度，其他培养条件全部相同。

(4)Nestin阳性神经前体细胞分离

P2 MSC分别按步骤(3)中的摇动频率和摇动角度培养后，以TrypLE Express消化、收集，再以mRNA Flow Cytometry技术，提取Nestin阳性神经前体细胞。分别统计不同培养基质和接种密度组别的Nestin阳性细胞百分比和总细胞数量，从而计算出Nestin阳性细胞产量。表8为TCT组实验结果，表9为nTCT组实验结果。统计和对比结果如图3所示。

表7适用培养容器和培养基使用量

表8 TCT组结果(15次/分钟，15°，采用TCT处理表面培养72小时)

表9 nTCT组结果(15次/分钟，15°，采用nTCT处理表面培养72小时)

以上结果表明，在三种接种密度下，nTCT组的Nestin阳性率显著高于TCT组。接种密度逐步提高的情况下，nTCT的总细胞数显著高于TCT，说明nTCT组不但Nestin阳性率更高，其最大细胞产量也更高。可能原因在于：1)TCT促进细胞贴壁，而聚苯乙烯是硬度较高的基质，会减低MSC向神经的分化，所以Nestin阳性百分比较低，相对比nTCT表面的细胞贴壁较弱，加上摇动，MSC更不容易贴壁，减少了和聚苯乙烯的接触，Nestin阳性率显著较高；2)TCT表面培养的细胞贴壁强、呈2D单层生长，MSC一旦满布基质表面，会导致拥挤、缺乏进一步生长的空间，细胞总数量少，对比nTCT加上摇动使细胞达到完全悬浮(3D)培养，不受单层2D限制，生长可利用空间大大提升，总细胞数量显著较高。综上所述，nTCT加上摇动培养，可在Nestin阳性率和细胞总数量两方面达到突破，最终大大提高Nestin阳性细胞的总产量。

实施例3摇动培养体系的放大

包括如下步骤：

(1)原代MSC培养

1mL健康成人骨髓原液以9mL MSC基础培养基稀释后，MSC也可以取自人的脐带、脐血、胎盘或脂肪组织，在100mm直径圆形培养皿培养3天后，移除所有培养基，换入10mL新的MSC基础培养基。此阶段MSC定义为P0。P0MSC以MSC基础培养基再培养10天，每2天换液一次，每次10mL。MSC基础培养基成分为MEM-alpha+10％胎牛血清。

(2)第一次传代培养

P0MSC培养10天后，以TrypLE Express消化、收集，再以1:3比例传代至100mm直径圆形培养皿。这些MSC定义为P1，以10mL MSC基础培养基培养2天。

(3)第二次传代培养

P1 MSC培养2天后，以TrypLE Express消化、收集，再以2×10

使用摇动角度和摇动速度可调整的“细胞培养摇床”，例如Fisherbrand Open AirRocker，将细胞培养容器置于其上，如图2所示，采用不同的摇动频率和摇动角度进行摇动培养。摇动频率为10～20次/分钟，本实施例选择15次/分钟进行数据统计；摇动角度为10～20°，本实施例选择15°的摇动角度进行数据统计。本实施例使用两种不同面积不同的nTCT表面处理培养容器，见表10，其中TCT表示经促进细胞贴壁处理(Tc-Treated，简称TCT)，nTCT表示未经促进细胞贴壁处理(Non Tc-Treated，简称nTCT)，所有条件下均使用无血清培养基(同实施例1)。本实施例的参数变量为培养容器的培养表面面积，其他培养条件全部相同。

(4)Nestin阳性神经前体细胞分离

P2 MSC分别按步骤(3)中的摇动频率和摇动角度培养后，以TrypLE Express消化、收集，再以mRNA Flow Cytometry技术，提取Nestin阳性神经前体细胞。分别统计不同培养基质和接种密度组别的Nestin阳性细胞百分比和总细胞数量，从而计算出Nestin阳性细胞产量。表11为75cm

表10适用培养容器和培养基使用量

表11面积75cm

表12面积175cm

以上结果表明，在75cm

实施例4利用本发明的悬浮摇动培养方法制备的神经前体细胞可以应用于神经性疾病的治疗

一、针对脑白质营养不良

以脑白质营养不良小鼠为疾病模型，在左右脑的胼胝体分别微创注射Nestin阳性神经前体细胞，细胞移植数量为每侧5×10

二、针对脑卒中

以大脑中动脉闭塞法在SD大鼠造脑卒中疾病模型，在卒中区域附近进行微创注射Nestin阳性神经前体细胞，细胞移植数量为2×10

神经前体细胞由健康供体收集获得，神经前体细胞是一种具有泛用性的细胞，可针对多种疾病发挥疗效。故本发明的悬浮摇动培养方法制备的Nestin阳性神经前体细胞还可以用于治疗包括帕金森、多发性硬化、脑胶质瘤等多种神经性疾病。

综上，本发明的方法通过使用悬浮摇动培养方法，该方法在第二次传代培养时使用细胞培养摇床进行摇动培养，所述细胞培养摇床的摇动频率为10～20次/分钟、摇动角度为10～20°，上述悬浮摇动培养方法提升了MSC神经特性的展现，获得的神经前体细胞Nestin阳性率显著增加，说明本发明的悬浮摇动培养方法能够提高间充质干细胞分化成神经前体细胞的效率，提高神经前体细胞的产量，且细胞培养摇床的摇动频率和摇动角度也是最终神经前体细胞产量的影响因素。此外，第二次传代培养使用未经过“促进细胞贴壁”处理的细胞培养器皿，能够进一步提高神经前体细胞的产量。细胞培养皿的聚苯乙烯基质是硬度较高的材料，会降低MSC向神经的分化，nTCT一定程度上减少了MSC贴壁，减少了MSC和聚苯乙烯的接触，释放了MSC的神经分化潜力，摇动培养进一步防止MSC贴壁，使MSC达到完全悬浮培养，更大的释放MSC的神经分化潜力，进一步提升了Nestin阳性率。本发明的悬浮摇动培养方法具有较大的可扩展性，可以放大到培养面积更大的单一培养器皿，减少器皿总数同时提高产量，简化操作，降低成本。使用本发明的悬浮摇动培养方法得到的神经前体细胞可以用于治疗各类神经损伤性疾病。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。