一种启动子pCALM2及其应用

摘要

本发明公开了一种启动子pCALM2及其应用，所述启动子pCALM2的核苷酸序列如SEQID NO：1所示。所述启动子pCALM2能应用在重组腺相关病毒中，使外源基因得以在前脑中高效表达，在神经环路示踪领域和基因治疗领域具有广泛的应用前景。

说明书

技术领域

本发明属于神经工程技术领域，具体涉及一种启动子pCALM2及其应用。

背景技术

前脑属于脑的最高层部分，是哺乳类动物中最复杂、最重要的神经中枢。它主要由两个部分组成：端脑和间脑。端脑主要包括整个大脑皮层、边缘系统和基底神经节等，间脑主要包括丘脑和下丘脑等。它参与包括运动、感觉、感知、自主神经、内分泌、摄食、学习、记忆、认知等多种重要生理功能的调控。对前脑神经环路及其功能的解析，可以帮助我们更好地认识大脑的高级功能。对前脑的研究也能帮助我们更好的理解神经系统疾病的致病机理，进而寻找更有效的治疗方法。

近年来，随着新型神经环路示踪剂的应用，特别是嗜神经病毒示踪剂的应用，神经环路结构和功能解析相关研究得到了快速的发展。最为常用的是腺相关病毒和慢病毒，其中重组腺相关病毒(rAAV)是在非致病的野生型AAV基础上改造而成的基因载体，由于其种类多样、免疫原性极低、安全性高、宿主细胞范围广、扩散能力强、体内表达基因时间长等，rAAV被视为最有前途的基因研究和基因治疗载体之一。但是，近来发现，这类载体在应用上有许多明显的缺陷，包括某些细胞膜上病毒受体数量极少，rAAV载体位点特异性整合不足，AAV衣壳成分和转基因产物引起宿主的免疫反应等，限制了rAAV高效安全的应用于神经科学研究及临床基因治疗。因此，我们需要更好地对AAV载体进行改进，使新一代rAAV载体具备基因治疗所必需的安全性、高效性和靶向性，以期更广泛地应用于临床。

rAAV成功应用于神经科学研究及临床基因治疗的关键是提高基因表达的时空特异性和表达水平。其中一个重要的方法是选择不同血清型的rAAV病毒，不同血清型的病毒对不同组织具有不同的亲和性，表现出一定的器官靶向特异性。目前已报道的适用于神经系统的AAV血清型有：1型、2型、5型、6型、8型、9型、DJ、PHP.B、PHP.eB、PHP.S、Retro、rh10等十几种。我们可以根据不同的实验目的及治疗靶点选择不同的血清型。然而，由于中枢神经系统的复杂性，这些血清型远无法满足当前基因递送和基因操作特异性的需求。另一个方法是应用组织特异性的启动子在rAAV基因组中。启动子是基因表达调控过程中必要的顺式作用元件，病毒载体的启动子元件决定了病毒表达的特异性。为了靶向性研究或基因治疗，我们需要不断开发适合特异性细胞或组织的启动子。

发明内容

为了解决上述背景技术中所提出的问题，本发明的目的在于提供一种前脑高效表达的启动子pCALM2及其应用。所述启动pCALM2能应用在重组腺相关病毒中，使外源基因能够在前脑中高效表达，在神经环路示踪领域和基因治疗领域具有广泛的应用前景。

为了达到上述目的，本发明所采用的技术方案为：一方面，本发明提供了一种启动子pCALM2，所述启动子pCALM2的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

进一步地，启动子pCALM22是钙调蛋白2(CALM2)基因的部分序列，所述序列选取了CALM2基因的转录起始位点附近部分序列，以及第一外显子部分序列，共3020的序列。

进一步地，所述启动子pCALM2在前脑中高效表达。

另一方面，本发明提供了一种重组腺相关病毒载体，包括上述所述的启动子pCALM2。

进一步地，所述重组腺相关病毒载体包括pAAV-pCALM2-荧光蛋白、pAAV-pCALM2-功能性蛋白或pAAV-pCALM2-治疗性蛋白。

进一步地，所述荧光蛋白包括eYFP、tdTomato；

优选地，所述功能性蛋白包括光遗传相关蛋白或化学遗传相关蛋白。

pAAV-pCALM2-荧光蛋白(荧光蛋白包括eYFP、tdTomato)可以实现神经环路多颜色示踪。pAAV-pCALM2-功能性蛋白(所述功能性蛋白包括光遗传相关蛋白或化学遗传相关蛋白)可以制得激活或者抑制特定神经元的重组腺相关病毒。pAAV-pCALM2-治疗性蛋白可以应用于基因治疗。

进一步地，所述重组腺相关病毒载体pAAV-pCALM2-eYFP采用pAAV-hSyn-eYFP作为骨架载体，向该载体中替换hSyn为pCALM2启动子，得到重组腺相关病毒载体pAAV-pCALM2-eYFP。

进一步地，所述重组腺相关病毒载体pAAV-pCALM2-eYFP的制备方法包括以下步骤：将启动子pCALM2克隆于pUC-57载体得到pUC57-pCALM2载体；采用限制性内切酶MluI-HF和KpnI-HF处理pAAV-hSyn-eYFP载体，同时用限制性内切酶MluI-HF和KpnI-HF处理pUC57-pCALM2载体；对两种酶切产物进行回收、纯化、连接，得到重组腺相关病毒载体pAAV-pCALM2-eYFP。

另一方面，本发明提供了一种重组腺相关病毒，包括上述任一所述的重组腺相关病毒载体。

进一步地，所述重组腺相关病毒包括AAV-retro-pCALM2-荧光蛋白、AAV-retro-pCALM2-功能性蛋白或AAV-retro-pCALM2-治疗性蛋白；

优选地，所述荧光蛋白包括eYFP、tdTomato；

优选地，所述功能性蛋白包括光遗传相关蛋白或化学遗传相关蛋白。

重组腺相关病毒AAV-retro-pCALM2-eYFP、AAV-retro-pCALM2-tdTomato可以有效逆向标记皮层到纹状体神经环路，并表达高荧光强度的eYFP或tdTomato。

再一方面，本发明提供了一种试剂盒，包括上述所述的启动子pCALM2、上述任一所述的重组腺相关病毒载体或上述任一所述的重组腺相关病毒。

再一方面，本发明提供了一种上述所述的启动子pCALM2、上述任一所述的重组腺相关病毒载体、上述任一所述的重组腺相关病毒或上述所述的试剂盒在制备神经环路示踪和/或操控神经细胞和/或基因治疗试剂中的应用。

再一方面，本发明提供了一种神经网络示踪剂，包括pAAV-pCALM2-荧光蛋白和/或包括pAAV-pCALM2-荧光蛋白的重组腺相关病毒；

优选地，所述荧光蛋白包括eYFP、tdTomato；

优选地，所述重组腺相关病毒包括AAV-retro-pCALM2-eYFP、AAV-retro-pCALM2-tdTomato。

再一方面，本发明提供了一种上述所述的神经网络示踪剂在皮层-纹状体神经环路示踪中的应用。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明启动子pCALM2，在前脑具有高效表达效率，在前脑可以实现外源基因高效表达，提高病毒感染后的表达特异性，其在神经环路示踪，基因治疗领域具有广泛的应用前景；

(2)本发明启动子pCALM2在细菌和哺乳动物细胞中无细胞毒性；

(3)本发明重组腺相关病毒载体采用pCALM2作为启动子，在前脑具有高效表达效率；

(4)本发明重组腺相关病毒在大脑可以高效地逆向标记皮层到纹状体神经环路，标记效率高，感染能力强。

附图说明

图1是本发明pAAV-pCALM2-eYFP载体的构造流程图；

图2是本发明AAV-retro-pCALM2-eYFP在皮层及纹状体的表达效率图。

具体实施方式

为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。

实施例1构建pUC57-pCALM2载体

pCALM2启动子是钙调蛋白2(CALM2)基因的部分序列，所述序列选取了CALM2基因的转录起始位点附近部分序列，以及第一外显子部分序列，共3020的序列。所述启动子pCALM2的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

将所述启动子pCALM2经过人工合成后克隆于pUC-57载体得到pUC57-pCALM2载体。

实施例2构建重组腺相关病毒载体pAAV-pCALM2-eYFP

本实施例由于采用eYFP作为启动子的报告基因，因此在构造重组载体时，选用了含有eYFP基因的重组腺相关载体pAAV-hSyn-eYFP作为载体骨架来连接pCALM2启动子，步骤如下：

如图1所示，采用限制性内切酶MluI-HF和KpnI-HF处理pAAV-hSyn-eYFP载体，同时用限制性内切酶MluI-HF和KpnI-HF处理pUC57-pCALM2载体，37℃下酶切3h，酶切体系如表1和表2所示，回收酶切产物后采用链接预混液(2×ligation premix，TAKARA)在16℃下进行连接30min，体系如表3所示，得到连接成功的pAAV-hSyn-eYFP载体。

表1 pAAV-hSyn-eYFP载体酶切体系

表2 pUC57-pCALM2载体酶切体系

表3连接体系

实施例3重组腺相关病毒AAV-retro-pCALM2-eYFP的制备

本实例采用三质粒共转染法制备病毒。病毒制备前，需要将包装病毒所需质粒进行中提，包括重组腺相关病毒载体pAAV-pCALM2-eYFP、包装质粒AAV-retro-RCB和辅助质粒。具体步骤如下：

制备细胞：将293T细胞铺在含有全培养基(10％胎牛血清、1％双抗)培养皿中，于培养箱中培养。

制备转染试剂：吸取5.25mL的超纯水、75μg包装质粒、75μg重组质粒、75μg辅助质粒和800μL的氯化钙溶液，轻轻混匀。向前述试剂中，加入等体积2×HBS，涡旋后静置30min。

转染细胞：向每盘细胞加20μL氯奎，加入转染试剂后培养。

收取病毒：72h后将前述转染后的细胞收集于离心管以3000rpm离心30min。弃上清后加入细胞裂解液，随后用反复冻融法裂解细胞。得到含有病毒的细胞破碎液。

纯化病毒：将上述细胞破碎液以11500rpm离心30min，弃上清后加入200μL HBS混匀，加入200μL氯仿以12000rpm离心5min，取上清，加入100μL 2.5mM NaCl和100μL 40％PEG8000，涡旋混匀，4℃冰箱过夜。将前述过夜样品以12000rpm离心30min，弃上清，加入30μL的HBS、0.5μL核酸酶，静置30min。随后加入30μL氯仿，以12000rpm离心5min。纯化完成后于-80℃冰箱保存。

测定滴度：用AAV滴度测定染料法荧光定量试剂盒(TAKARA公司)对前述纯化病毒进行滴度测定，滴度结果为1.53×10

实施例4重组腺相关病毒标记小鼠皮层-纹状体神经环路

将纯化后的重组腺相关病毒，注射至小鼠右侧纹状体(AP:+0.62mm,ML:+1.75mm,D/V:-3.5mm)。所述重组腺相关病毒衣壳是AAV-retro，具有逆向感染能力，能够逆向示踪纹状体上游的皮层神经元。三周后，将小鼠灌流取脑，利用免疫组化方法切片染色，并观察脑片结果。实验结果如图2所示，eYFP在小鼠前脑均有很高的表达效率。

综上，本发明在小鼠上进行验证，证明启动子pCALM2在前脑具有高效表达水平。

以上所述仅为本发明的具体实施方式，不是全部的实施方式，本领域普通技术人员通过阅读本发明说明书而对本发明技术方案采取的任何等效的变换，均为本发明的权利要求所涵盖。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院深圳先进技术研究院

<120> 一种启动子pCALM2及其应用

<130> CP121010013C

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 3020

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gctcatgtgt ggcaggcatg gtattcaagg ctacactctt cagtgtggga cctttggagg 60

tgattggatc acgatggctc tgacttcatg aatagattga ttcctccgtg gcctcatgga 120

ttaatgagtt ggggaggtgg ggagaggctt ggttataaca ttaagttctc taagagcttt 180

gctctttccc ctgacgtttc caggatgctt tcctccacac aggcctggaa gtgacagaga 240

caagtgagtg tcagccccag ctgcagctgc catggtgctt tcttgaatcg aggtgtttcg 300

tcacagtgat ggaaagctaa ctgtcgcctc atcttagtcc tgctttgcct cattaaagga 360

aaaacagcgt aaccttctca gccagggcga cgagtctgaa ccgtggaaga agatggcttc 420

cgtcctacct ccccaattcc attctagatc atagaagaga aattgactca ttgcatagga 480

tcaatgccct ggaaaaagta ggacttaatt ttttcaattt gttcagaaac ccatagacta 540

tattcaagaa tggtgttatg tgatgttctg tttgcttgtt tcactgctaa ctagcaaaac 600

tgggtaaaag agagagaagc tccggaaagg aagctatcca gagataaggc ggtattatct 660

caattcagaa aatgaggaag aagcagcgat ggggaagaac ttgcttgttt tttttctttc 720

ccccaagatg gacaaaggta gagaactcta agatctcacc gtgggaacca gacagaagaa 780

aaaaaaagat atttccaagg ctctgataca cagtcttcgc tgactttgcg tttcactgac 840

aactgccagg gttaggcgga gatctctgtc atatttcgga agacaagtgc tctataaata 900

aattgacttg gaacagtctc aaatacacat aaaccgcaat ggctttaaat gtaacccttg 960

acttttcttt gtcttcttaa gaggtcaaca aggaagatta tgcaagaaag gcgttaccaa 1020

aacccaacct acgaaacctg gaagagcttt cctatattct ctatttaaaa aaaaaatata 1080

tttctatata cttgttagca agcactaccg cgtctctcta ggcacgagtc agtgcgtact 1140

tatcatacat tctgcaccaa tcctcttaaa aattccttcc cttgaagagg tgattattca 1200

ttttgtcatt caatttccca ccattaaaaa tttcatatgt aaaatcaccg catgctaatg 1260

gggtactgtg taaggagaga atatttttac tgagtcagcg gaaagacaaa aaaaaaaatt 1320

agtaggtctt ccatctgaag atctgaggag gagtcacaga caaatttctg aggtatatct 1380

tggaaaaact ttgaatttac cagaatgtag tgcactggaa cggaacggtg gcgtcagatt 1440

cttggctgga ggtgcccatt ttaaagtaat attcccaaat aatgatattt atctcatttg 1500

tggggtaagg ttaattagct ctcctccctt tcagtattat cagggcacca cattggcaag 1560

gataatagaa acagaaatct gaggtttggt ttggtttggt attcccatcg agtgggcatt 1620

cgttcgaaag ggtgtcagct ttgttagtgc taattagaag gccgcttaat gtctggtttc 1680

catgactgaa agagggccca gctctggctt cattaaaaga tatgtttaaa ggtgtgaggg 1740

atgtctaact taggtaaagg aggttaaaat ggactctccg agtgggtgca tatagctgtt 1800

agcaccgaaa tgttcttgct gaacggggaa actatcctga aggcaggctt ctttctgaag 1860

ttgaggtttc atcttgcctt gctttttaca aagtgattgc tctccacggt ttgagggttt 1920

gcatggtggt gctttttcaa ctgggaagtt ctttctgcct tcgccatctt cctaattctc 1980

tctgggccgt ggctgttcca tcaatcttct ctgggcactg tattttgagg atggaatcct 2040

tattttcctc tctaaccccc atcatccttt tctggttgtc tactttgggc ttctaatttc 2100

agaggggctc cttggggaga ccgacagcac acactctcgg atacagtggg tttgagtagc 2160

tttctgataa attactgcta ggaaagagaa gcgaagggta ggcataaacg gaagcccctt 2220

ttttgattag cttgtcagct gagctgcatg ggttcggcac cgtgtaatga aaaacgaccg 2280

gcctccctat gcagcaacgc tgagaagctg ggcgcgctgg gtgggtgttt actggggggg 2340

gggggtgtcc ttcagtttta tttatttttt gttttggccc gtgttgtttt tgtcagcagc 2400

acctccatac ggggcgggaa ggtgagtgtg tgcgtgtgtc tgtggcaggc aggacgggtg 2460

gaagaaggtc ctccagccga gcgcagagag agccacgctg ccgcctggcg cagttgccag 2520

gacagcgcgg cgcgagcaag caacggcaga agccgcaacc gcgttccggc tgcgagagaa 2580

agtgacgcat tgcaggtaca aatcagccaa tcagcagcaa gctcaacgag gttcgcctgg 2640

tcgaccgcca ccgcggtgct cctccgcgcc gcaaagtagc tcctgccagg cgcggttccc 2700

ccggcctttt aacggcttgc ctgggagtgg aacccactta cgtcatccgt ccccctgctc 2760

ccctttctct cttgcgtgtc tgcccagtga ctgcggagaa agggggtctc ccggagagtt 2820

gggggggggg agggggcggg ggctggccgg gactcgttcg ctaggttccg ttatctggat 2880

gaggcggagg gatctggcgg agggaggcgg agggaggtgt ttatgaggag ctgggggcgg 2940

aggaggagaa ttagtccgag tggagcgagc gagtcgagcg gttgtctggt cgcgtctcgg 3000

aaacccgtag cccttgcagc 3020