一种启动子探针载体的构建及低温诱导启动子的研究

摘要

启动子是基因表达调控的重要元件，也是基因工程表达载体的一个重要元件。启动子克隆技术包括启动子探针质粒载体筛选启动子和利用PCR技术克隆启动子。
　　 绿色荧光蛋白是从多管水母体内发现的，它可以在蓝光或紫外光激发下发射绿光。由于它稳定的结构和光物理性质，又易于在细胞内表达，近些年作为标记物已经被广泛地应用于生命科学领域。本文以质粒pAcGFP为骨架，构建以绿色荧光蛋白为报告基因的启动子探针载体。用一段约700bp的基因片段插入pAcGFP中取代其上的lac启动子，获得中间载体pEH+GFP。人工合成一段特异核糖体结合位点(RBS)序列插入到pEH+GFP中得到载体pEH+GFP+RBS。最终构建成以绿色荧光蛋白为报告基因的启动子探针载体pGFP+RBS，并用它从铜绿假单胞菌的总DNA中成功钓出一段具有启动表达GFP的功能的基因片段，初步分析该片段为组成型启动子。
　　 CspA是大肠杆菌中一种主要的冷激蛋白，近来研究人员对其结构、功能和在转录、翻译水平的调控以及mRNA稳定性等方面作了大量研究。本文用PCR技术克隆CspA启动子构建包含CspA冷激启动子的低温表达载体，用以在低温条件下诱导表达目的蛋白。以大肠杆菌DNA为模板，用人工合成引物经PCR扩增获得大肠杆菌冷激蛋白CspA的低温诱导启动子(cold启动子)片段，插入到表达型质粒pET30a(+)的T7启动子片段中，以取代pET30a(+)原有启动子，构建低温诱导表达型载体pET30a/cold。通过克隆表达精氨酸脱亚胺基酶(ADI)来验证pET30a/cold的低温诱导启动子的功能和启动子强度。报告基因ADI蛋白的SDS-PAGE分析，表明pET30a/cold-ADI在低温下的表达效率与pET30a-ADI在37℃IPTG诱导表达效率相近。克隆的Cold启动子片段包含了冷激蛋白cspA的完整的中心启动子，具有在低温下诱导表达目标蛋白的功能。并且，可以达到很高的表达效率，构建的低温诱导表达载体pET30a/cold可以作为一种工程工具为以后科研工作打下基础。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：符号与缩略语说明

声明

1前言

1.1原核生物启动子的结构模型

1.2启动子的分类

1.3启动子克隆的意义

1.4启动子克隆的方法

1.4.1利用启动子探针质粒载体筛选启动子

1.4.2利用PCR技术克隆启动子

1.5大肠杆菌冷激蛋白启动子的研究

1.5.1大肠杆菌的冷激蛋白CspA及其家族成员

1.5.2冷激蛋白CspA核心启动子

1.5.3冷激蛋白cspA mRNA的5'-UTR

1.5.4冷激启动子应用研究的意义

2以绿色荧光蛋白为报告基因的启动子探针载体构建和应用

2.1材料与试剂

2.1.1主要仪器

2.1.2主要试剂

2.1.3实验用菌株和质粒

2.1.4培养基及主要溶液的配制

2.2实验方法

2.2.1大肠杆菌DH5a感受态细胞的制备

2.2.2连接产物转化DH5a感受态细胞

2.2.3质粒的提取

2.2.4基因片段琼脂糖凝胶电泳切胶回收

2.2.5以绿色荧光蛋白基因为报告基因的启动子探针载体的构建

2.2.6启动子探针载体pGFP+RBS探针特性的证实

2.2.7筛选出的启动子性质测定

2.3实验结果

2.3.1以绿色荧光蛋白基因为报告基因的启动子探针载体的构建

2.3.2 pGFP+RBS启动子探针特性的证实

2.3.3未知启动子promoter1性质的初步研究

2.4讨论

2.4.1启动子探针载体pGFP+RBS的优点

2.4.2使用启动子探针载体pGFP+RBS筛选启动子的注意点

3 cold启动子的克隆和低温诱导表达载体的构建

3.1材料与试剂

3.1.1菌株和质粒

3.1.2主要试剂

3.1.3主要溶液的配制

3.2实验方法

3.2.1低温诱导表达载体构建及性质鉴定策略

3.2.2 cold启动子基因的PCR扩增

3.2.3 PCR产物的TA克隆

3.2.4低温诱导表达载体的构建

3.2.5低温诱导表达载体pET30a/cold的性质鉴定

3.3实验结果

3.3.1 E.coli cspA基因上游启动子序列的扩增

3.3.2 cold启动子TA克隆鉴定

3.3.3 cold启动子序列测序鉴定

3.3.4低温诱导表达载体pET30a/cold的构建

3.3.5低温诱导表达载体pET30a/cold的应用

3.3.6 cold启动子介导的低温诱导ADI表达研究

3.4讨论

3.4.1 cold启动子结构分析

3.4.2低温诱导表达载体应用意义

3.4.3 cold启动子构建的低温诱导表达载体存在的问题

4结论与展望

4.1结论

4.2展望

致谢

参考文献