一种快速测定IL-2蛋白药物和抗CD25抗体药物的生物学活性方法

摘要

本发明公开了一种快速测定IL‑2蛋白药物和抗CD25抗体药物的生物学活性方法，所述方法通过构建慢病毒(pLV‑STAT5‑Luc‑PGK‑Zencin)转染的C8166效应细胞，经筛选后得到稳定表达STAT5报告基因的单克隆细胞株，用IL‑2蛋白药物刺激激活报告基因的表达，并用抗CD25抗体药物阻断IL‑2刺激激活的信号通路，根据测定的信号值拟合四参数曲线测定IL‑2蛋白药物及抗CD25抗体药物的生物学活性。本发明提供的检测方法可评价药物对细胞信号下游的相关指示、无需任何人原代组织来源的细胞或其他组分、显色稳定、实验周期短、操作简便、成本低。

说明书

技术领域

本发明属于生物药物的生物学活性检测领域，具体而言，涉及一种快速测定IL-2蛋白药物和抗CD25抗体药物的生物学活性方法。

背景技术

治疗性单克隆抗体(简称单抗)作为一种重要的生物技术产品，具有特异性高、靶向性强、疗效确切等优点，是由单一B细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体，目前，其在治疗肿瘤、自身免疫性疾病、感染性疾病及移植排斥反应中取得了显著的疗效。2018年，单抗药物的销售额占全球生物药市场的比重高达55.3％。此外，在2019年全球销售额前二十的药品中，13个生物药中单抗药物就占据9席，目前单抗药物是全球制药最重要的细分领域之一，也已经成为全球医药市场的重要组成部分。

面对抗体类药物的快速发展，迫切需要建立相应的抗体药物质量评价技术体系，而细胞水平上的生物学活性的测定是对药物的有效成分和含量以及药物效价测定的最有效的方式之一，也是确保抗体类药物有效性的重要质控指标，因此，其在抗体类药物的发现和开发中发挥着重要的作用。目前，生物学活性检测的方法多采用基于细胞的生物学活性测定方法，主要包括细胞增殖抑制法、细胞毒性法、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性法、补体依赖的细胞毒性法和细胞竞争ELISA法。

白细胞介素2(IL-2)是T细胞和NK细胞产生的15.5kD糖蛋白，主要由CD4

目前，中国药典上采用CTLL-2检测IL-2蛋白药物的生物学活性，该细胞为悬浮细胞，细胞复苏后约3周可用于分析。另外，细胞复苏时需在完全培养基中添加10％CTLL-2细胞上清，平时培养过程中需要预留上清备用。细胞培养液为RPMI 1640+10％FBS+1％青链霉素+100IU/mL IL-2，此方法周期约为3～4天，第一天将细胞铺板前洗涤3遍以上，铺板后加样，37℃，5％CO

抗CD25单克隆抗体作为新的免疫抑制剂的代表，特异性地作用于CD25，通过阻断T细胞的活化与增殖，能够有效降低急性排斥反应的发生率，显著提高移植物及移植受体的生存率，降低激素用量和缩短其使用时间。目前巴利昔单抗、达利珠单抗及相关的生物类似药的生物学活性的检测采用的方法有竞争ELISA法和流式细胞法，其中，竞争ELISA法检测抗CD25单克隆抗体的生物学活性时，无法反映下游信号通路，进而无法评估用于放行检验的稳定指示的适用性；流式细胞法检测抗CD25单克隆抗体的生物学活性时，需要相关的设备和大量的耗材，为企业增加了经济负担。

目前，针对IL-2蛋白药物和抗CD25单克隆抗体药物的生物学活性的测定，本领域仍然存在新型的测定方法的需要。鉴于此，本发明提供了一种根据下游细胞信号通路化学发光信号值评价生物学活性的方法，并对IL-2蛋白药物和抗CD25单克隆抗体药物进行了检测，当天即可获得活性结果，周期短，操作简便，成本低，无需任何人原代组织来源的细胞或其他组分，显色稳定。一方面避免了长时间孵育所带来的细胞污染可能性等客观因素，另一方面也可以评价药物对细胞信号下游的相关指示。

发明内容

针对目前测定IL-2蛋白药物和抗CD25单克隆抗体药物生物学活性中存在的技术问题，本发明的目的在于提供一种快速测定IL-2蛋白药物和抗CD25抗体药物的生物学活性方法。所述方法通过构建慢病毒(pLV-STAT5-PGK-Zencin)转染的C8166效应细胞，经两轮加压筛选后，得到稳定表达STAT5报告基因的单克隆细胞株，用IL-2刺激激活报告基因的表达，并用抗CD25抗体药物阻断IL-2刺激激活的信号通路，根据测定的信号值拟合四参数曲线测定IL-2蛋白药物及抗CD25抗体药物的生物学活性，采用本发明所述的方法检测IL-2蛋白药物及抗CD25抗体的生物学活性具有无需任何人原代组织来源的细胞或其他组分、显色稳定、实验周期短、操作简便、检测结果稳定可靠、成本低等优点。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

本发明的第一方面提供了一种快速测定IL-2蛋白药物和/或抗CD25抗体药物的生物学活性方法，所述方法包括：构建稳定表达STAT5报告基因的效应细胞，用IL-2刺激激活报告基因的表达，并用抗CD25抗体药物阻断IL-2刺激激活的信号通路，根据测定的报告基因的信号值拟合四参数曲线确定IL-2蛋白药物及抗CD25抗体药物的生物学活性。

本发明的第二方面提供了一种快速测定IL-2蛋白药物和/或抗CD25抗体药物的生物学活性方法。

进一步，所述方法包括如下步骤：

(1)构建得到稳定表达STAT5报告基因的效应细胞；

(2)将IL-2蛋白药物进行稀释，稀释后的IL-2蛋白药物加至步骤(1)所述的效应细胞中进行孵育；

(3)将抗CD25抗体药物样品进行稀释，稀释后的抗体药物及一定浓度的IL-2蛋白药物分别转移至步骤(1)所述的效应细胞中进行孵育；

(4)加入酶反应底物，根据测定的信号值拟合四参数曲线确定IL-2蛋白药物及抗CD25抗体药物的生物学活性；

优选地，步骤(2)中所述的稀释为5倍稀释；

优选地，步骤(3)中所述的稀释为5倍稀释。

进一步，所述稳定表达STAT5报告基因的效应细胞是通过慢病毒转染C8166细胞、HDLM-2细胞、Mo7e细胞、DS-1细胞、293细胞、NSO细胞、HeLa细胞、SP2细胞、COS细胞、549A细胞或人肝癌细胞，并加入相应的抗生素筛选得到的；

优选地，所述稳定表达STAT5报告基因的效应细胞是通过将含有STAT5报告基因的载体转染C8166细胞，并加入相应的抗生素筛选得到的；

更优选地，所述抗生素为Zencin。

C8166细胞属于人T淋巴细胞白血病细胞，其表面表达有IL-2Rα(CD25)，IL-2Rβ(CD122)，IL-2Rγ(CD132)受体，当受体与配体结合后，活化下游的信号通路，进入细胞核识别并结合序列，从而产生信号值。将合成构建好的pLV-STAT5-PGK-Zencin进行慢病毒包装，然后转导入C8166细胞内，配体与受体结合后激活JAK-STAT5信号通路，并启动与STAT5序列连接的荧光素酶报告基因的表达。抗CD25抗体与IL-2竞争性结合CD25，阻断信号通路，因此，抗CD25抗体的浓度与效应细胞中的荧光素酶的表达量成反比。

进一步，所述载体为pLV-STAT5-PGK-Zencin。

在本发明的实施例中，所述稳定表达STAT5报告基因的效应细胞的制备方法为，将含有STAT5-Luciferase序列的载体导入C8166细胞内，并加入相应的抗生素进行筛选；

优选地，所述含有STAT5-Luciferase序列的载体为构建的pLV-STAT5-PGK-Zencin。

进一步，所述抗CD25抗体药物包括巴利昔抗体药物、达利珠抗体药物；

优选地，所述抗CD25抗体药物为巴利昔抗体药物。

进一步，所述IL-2蛋白药物为重组IL-2蛋白药物。

进一步，本发明第一方面或第二方面是使用荧光素酶试剂盒检测化学发光值，根据得到的相对化学发光单位值拟合倒S型四参数曲线；

优选地，所述相对化学发光单位值是在酶标仪上使用化学发光读取得到的。

在本发明的实施例中，使用荧光素酶试剂盒检测化学发光值，所述荧光素酶试剂盒包括(但不限于)：Promega公司的Bright-Glo荧光素酶试剂盒、碧云天公司的荧光素酶报告基因检测试剂盒、Biovision公司的Luciferase荧光素酶报告基因检测试剂盒以及其他基于荧光素酶发光检测的试剂盒，按照说明书所述，进行所述报告基因的检测；

优选地，所述荧光素酶试剂盒为Promega公司的Bright-Glo荧光素酶试剂盒。

荧光素酶(Luciferase)来自于自然界能够发光的生物，是在生物体内能够催化荧光素(Luciferin)或脂肪醛氧化发光的一类酶的总称。根据来源生物种类的不同，可将荧光素酶分为萤火虫荧光素酶(FL)和细菌荧光素酶(BL)。目前，以北美萤火虫来源的荧光素酶基因的应用最为广泛，该基因可编码产生550个氨基酸的荧光素酶蛋白。FL基因来自萤火虫，在Mg

荧光素酶报告基因检测是现代分子生物学研究领域中分析结构基因旁侧区域潜在的顺式元件(如启动子、增强子和沉默子等)和反式作用因子相互作用关系的一种重要工具。荧光素酶报告基因系统是以荧光素(Luciferin)为底物，来检测萤火虫荧光素酶(Fireflyluciferase)活性的一种报告系统。荧光素酶可以催化Luciferin氧化成Oxyluciferin，在Luciferin氧化的过程中，会发出生物荧光(Bioluminescence)，然后通过化学发光仪或液闪测定仪测定。

在本发明的实施例中，在酶标仪上使用化学发光读取相对化学发光单位值(Relative light unit，RLU)，通过数据处理拟合倒S型四参数曲线。倒S型四参数曲线，可反映出上下渐近线、IC50值和斜率等指标；

优选地，使用Graphpad7.0进行数据处理拟合倒S型四参数曲线。

在本发明的实施例中，通过比较样品与参比品四参数曲线的半抑制浓度值(Halfmaximal inhibitory concentration，IC50)，得出样品的相对效价。计算公式为：相对效价＝参比品IC50/样品IC50×100％。

本发明的第三方面提供了一种稳定表达STAT5报告基因的C8166效应细胞。

进一步，所述效应细胞是采用本发明第二方面中所述的方法构建得到的。

在本发明的实施例中，所述稳定表达STAT5报告基因的C8166效应细胞的制备方法为，将含有STAT5-Luciferase序列的载体导入C8166细胞内，并加入相应的抗生素进行筛选；

优选地，所述含有STAT5-Luciferase序列的载体为构建的pLV-STAT5-PGK-Zencin。

本发明的第四方面提供了本发明第三方面所述的效应细胞在检测IL-2蛋白药物和/或抗CD25抗体药物中的应用。

进一步，所述抗CD25抗体药物包括巴利昔抗体药物、达利珠抗体药物；

优选地，所述抗CD25抗体药物为巴利昔抗体药物。

本发明的第五方面提供了本发明第一方面或第二方面所述的方法在IL-2蛋白药物和/或抗CD25抗体药物的质量控制中的应用。

除非另有定义，本发明上下文中所有的科技术语具有本领域普通技术人员所理解的相同含义。此外，对部分术语解释如下：

本申请上下文中使用的术语“效应细胞”，是指天然地或人工地(例如通过将含有目的蛋白编码的核酸序列的载体转染到宿主细胞内)表达STAT5-荧光素酶报告基因的细胞，本申请中的效应细胞起到JAK-STAT5信号通路中效应细胞的作用，或者模拟JAK-STAT5信号通路中的效应细胞的作用。

本申请上下文中使用的术语“IL-2蛋白药物”，是一种重组蛋白药物，本申请中所述的效应细胞中激活STAT5下游基因的表达，进而启动与STAT5序列连接的荧光素酶报告基因的表达，其主要生理作用是刺激和维持T细胞的分化增殖，有关肿瘤的生物学活性包括：刺激自然杀伤(NK)细胞的增殖和活化，并增强其活性；诱导细胞毒性淋巴细胞，增强其溶细胞活性；诱导淋巴因子活化杀伤(LAK)细胞，刺激肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的增生并增强其活性等。

本申请上下文中使用的术语“抗CD25抗体药物”，是指靶向CD25(IL-2Rα)的抗体药物，本申请中所述抗CD25抗体药物包括巴利昔抗体药物、达利珠抗体药物，在本发明的实施例中优选为巴利昔抗体药物。在本申请所述的效应细胞中，抗CD25抗体药物与IL-2蛋白药物竞争性地结合CD25，进而阻断STAT5的下游信号通路。

本申请上下文中使用的术语“JAK-STAT5信号通路”，是指Janus激酶(Januskinase，JAK)-信号转导子和转录活化子5(Signal transducer and activator oftranscription5，STAT5)信号通路，是细胞因子信号传导的下游通路，调控细胞的发育、分化、增殖、凋亡等，不仅参与调节正常的生理过程，在肿瘤的发生发展中也起着重要作用，尤其是在血液系统肿瘤中意义重大。主要由三个成分组成，即酪氨酸激酶相关受体、JAK和STAT5。

本申请上下文中使用的术语“生物学活性”，是指基于生物制品实现确定的生物学效应的特定能力或潜力，可采用特定细胞株(靶细胞)的生物学效应来评估生物制品相应的活性。

本申请上下文中使用的术语“四参数曲线”，是指按照四参数方程Y＝Bottom+(Top-Bottom)/(1+10^((LogEC50-X)*HillSlope))进行拟合的曲线，拟合曲线可以给出Top、Bottom、EC50、HillSlope等四个参数。

为了测定IL-2蛋白药物及抗CD25抗体药物的生物学活性，首先需要建立一种能够稳定表达STAT5-荧光素酶报告基因的效应细胞，并且需要确保该细胞能够满足JAK-STAT5信号通路转导、启动与STAT5序列连接的荧光素酶报告基因的表达所需要的条件和配件，才能获得本发明所述检测方法中的效应细胞。基于此，本申请的发明人选择了本领域常规用于表达外源基因的多种宿主细胞(C8166、HDLM-2、Mo7e)进行作为本发明方法的效应细胞的测试和筛选。结果发现，即使分别将含有STAT5-荧光素酶报告基因序列的载体成功转染到上述多种宿主细胞中，仍然无法保证被成功转染的宿主细胞可以作为测定IL-2蛋白药物及抗CD25抗体药物生物学活性的效应细胞，在这些细胞中，只有C8166细胞是能够满足JAK-STAT5信号通路转导、启动与STAT5序列连接的荧光素酶报告基因的表达所需要的条件和配件的母细胞系。

本申请的发明人经过大量的细胞筛选工作，选择了人T淋巴细胞白血病细胞C8166细胞，用于构建本发明检测方法中的效应细胞。基于C8166细胞构建得到的效应细胞的检测效果显著优于其他类型的细胞构建得到的效应细胞。针对C8166细胞这一悬浮生长的细胞，选择了在特定条件下进行慢病毒转染的方式，成功构建了稳定高表达STAT5-荧光素酶报告基因的效应细胞，通过比较不同单克隆效应细胞株对荧光素酶的表达反应性情况、IL-2蛋白药物及抗CD25抗体药物的生物学活性的测定信噪比等性能，获得了一株稳定高表达STAT5-荧光素酶报告基因、高表达荧光素酶、高信噪比的细胞株，建立了一种用于IL-2蛋白药物及抗CD25抗体药物的生物学活性的快速、准确的定量检测方法。

本发明的优点和有益效果如下：

(1)本发明针对IL-2蛋白药物及抗CD25抗体药物的生物学活性的检测，建立了一种快速、准确的定量检测方法。

(2)本发明对常规用于表达外源基因的多种宿主细胞(包括C8166、HDLM-2、Mo7e)进行了筛选，最终筛选出对IL-2的刺激有较好荧光素酶表达反应性的C8166宿主细胞。

(3)与现有技术相比，本发明提供的检测方法在加入检测组分后可在不同的时间检测结果，无需任何人原代组织来源的细胞或其他组分，显色更加稳定，质量更加可控。

(4)本发明提供的检测方法具有实验周期短、操作简便、检测结果稳定可靠、成本低等优点，当天即可获得活性结果，一方面避免了长时间孵育和多步骤操作所带来的细胞污染可能性等客观因素，另一方面也可以评价药物对细胞信号下游的相关指示。

(5)本发明提供的检测方法能够用于对IL-2蛋白药物及抗CD25抗体药物进行评价和筛选，可作为IL-2蛋白药物及抗CD25抗体药物早期研发与筛选过程中的一种有效措施。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1是慢病毒转染后C8166单克隆细胞株对IL-2蛋白药物刺激效应细胞荧光素酶的四参数曲线图；

图2是优化后不同浓度的IL-2蛋白药物刺激效应细胞荧光素酶的四参数曲线图；

图3是优化后不同浓度的抗CD25抗体蛋白药物刺激效应细胞荧光素酶的四参数曲线图；

图4是慢病毒转染后HDLM-2细胞株对IL-2蛋白药物刺激效应细胞荧光素酶的四参数曲线图；

图5是慢病毒转染后Mo7e细胞株对IL-2蛋白药物刺激效应细胞荧光素酶的四参数曲线图；

图6是三种不同的效应细胞转染后对IL-2蛋白药物刺激效应细胞荧光素酶的四参数曲线图；

图7是传统的IL-2蛋白药物生物学活性测定方法得到的四参数曲线图；

图8是传统的抗CD25抗体药物生物学活性测定方法得到的四参数曲线图；

图9是传统的抗CD25抗体药物生物学活性测定方法得到的PLA分析图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解为：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。

实施例1稳定表达STAT5-luciferase的单克隆细胞株的构建与筛选1、实验材料

C8166细胞来源于ATCC；pLV-STAT5-PGK-Zencin购于吉满生物工程有限公司；IL-2购于biosystemsACRO；巴利昔抗体(抗CD25的单克隆抗体药物)为单克隆抗体室留存(诺华)；Bright-Glo荧光素酶试剂盒购于Promega公司。

2、慢病毒转导

采用慢病毒包装方法对C8166细胞进行转导，取50μL构建好的慢病毒质粒加入到96孔板中，并在同一孔中加入50μL的密度为1×10

3、单克隆细胞株筛选

待细胞密度和活力恢复后，通过有限稀释法，按照0.5个/孔的密度，铺96孔板筛选单克隆。在细胞生长期间，观察并标记哪些孔是单克隆，当单克隆孔内C8166细胞汇合度达到50％以上时，将此孔内细胞转移至24孔板，逐步扩大培养。稀释到2.5×10

选取信噪比最高的细胞进行再一次的单克隆细胞的筛选。通过有限稀释法，按照0.5个/孔的密度，铺96孔板筛选单克隆。在细胞生长期间，观察并标记哪些孔是单克隆，当单克隆孔内C8166细胞汇合度达到50％以上时，将此孔内细胞转移至24孔板，逐步扩大培养，直到稳定传代培养。选取活率80％以上的细胞液，稀释到2.5×10

选取活率80％以上的细胞液，稀释到2.5×10

4、实验结果

结果显示，经过筛选得到的稳定表达STAT5-luciferase的单克隆细胞株C8166对IL-2的刺激有较好荧光素酶表达反应性(见图1-3)，因此，通过本发明所述的方法构建得到的稳定表达STAT5-luciferase的单克隆细胞株C8166可作为实验用细胞。

实施例2不同效应细胞的比较

1、实验材料

C8166细胞来源于ATCC；pLV-STAT5-PGK-Zencin购建于吉满生物工程有限公司；IL-2购于biosystemsACRO；巴利昔抗体(抗CD25的单克隆抗体药物)为单克隆抗体室留存(诺华)；Bright-Glo荧光素酶试剂盒购于Promega公司。

2、慢病毒转导

采用慢病毒包装方法对HDLM-2、Mo7e细胞进行转导，分别取50μL构建好的慢病毒质粒加入到96孔板中，并在同一孔中加入50μL的密度为1×10

3、单克隆细胞株筛选

待细胞密度和活力恢复后，通过有限稀释法，按照0.5个/孔的密度，铺96孔板筛选单克隆。在细胞生长期间，观察并标记哪些孔是单克隆，当单克隆孔内HDLM-2、Mo7e细胞汇合度达到50％以上时，将此孔内细胞转移至24孔板，逐步扩大培养。稀释到2.5×10

4、将三种不同的效应细胞转染后进行比较

将三种不同的的细胞分别加到96孔板中，稀释到2.5×10

5、实验结果

结果显示，分别将含有STAT5-荧光素酶报告基因序列的载体成功转染到C8166、HDLM-2、Mo7e宿主细胞中，只有C8166宿主细胞对IL-2的刺激有较好荧光素酶表达反应性(见图4-6)，表明C8166宿主细胞是能够满足JAK-STAT5信号通路转导、启动与STAT5序列连接的荧光素酶报告基因的表达所需要的条件和配件的母细胞系。

实施例3检测方法的验证

1、与传统IL-2蛋白药物测活方法的方法学比较

中国药典上采用CTLL-2检测IL-2蛋白药物的生物学活性，该细胞为悬浮细胞，细胞复苏后约3周可用于分析。另外，细胞复苏时需在完全培养基中添加10％CTLL-2细胞上清，平时培养过程中需要预留上清备用。细胞培养液为RPMI1640+10％FBS+1％青链霉素+100IU/mL IL-2，此方法周期约为3～4天，第一天将细胞铺板前洗涤3遍以上，铺板后加样，37℃，5％CO

该传统方法存在检测周期长、操作繁琐、信噪比低等缺陷(见图7)。

2、与传统抗CD25抗体药物测活方法的方法学比较

目前抗CD25抗体生物学活性的检测采用的方法有细胞竞争ELISA法等。

该制品生物学活性测定方法实际为竞争结合活性，无法反映下游信号通路的细胞生物学活性测定方法，缺乏用于放行和稳定性指示的适用性，结果需用PLA分析计算相对活性(见图8和图9)。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。