一种抗晚疫病马铃薯野生种资源的发掘方法

摘要

本发明提供了一种抗晚疫病马铃薯野生种资源的发掘方法，通过大量资源筛选和测序得到一份含有广谱抗病基因Rpi‑Pat1的优异晚疫病抗性野生种质资源，并设计了Rpi‑Pat1基因特异引物，可用于监测该抗病基因转育。通过大量亲本和多次授粉技术，首次获得了该野生种与栽培种的有性杂种后代，通过有性杂交和分子标记辅助选择将来自野生种的Rpi‑Pat1成功导入栽培种中。本申请创制的资源材料和标记可用于马铃薯晚疫病抗病育种。

说明书

技术领域

本发明属于马铃薯晚疫病抗病种质资源培育领域，具体涉及一种抗晚疫病马铃薯野生种资源的发掘方法。

背景技术

马铃薯是继水稻、小麦、玉米之后的世界第四大粮食作物。由致病疫霉(Phytophthora infestans(Mont.)de Bary)引起的晚疫病是马铃薯生产中为最为严重的毁灭性病害，在世界范围马铃薯产区普遍发生。我国是世界马铃薯第一生产大国，正常年份因晚疫病危害造成的损失达20-30％，特别是多雨潮湿发病严重的年份，损失更为严重。晚疫病抗性是世界范围马铃薯育种的十分重要的目标。

当前马铃薯生产中主要利用化学农药来控制晚疫病，理论上晚疫病防治最经济有效的途径是利用抗病品种。马铃薯晚疫病垂直抗性主要受主效R基因的控制，目前世界上马铃薯栽培种中的抗病基因主要是利用从马铃薯野生种Solanum demisum中转育而来的R1-R11基因，其中绝大多数抗病基因已被快速进化的晚疫病菌克服。但是在南美洲的马铃薯起源地，晚疫病菌与马铃薯协同进化，存在一些仍然抗性良好的野生种马铃薯，而且一些抗病基因具有广谱持久的特点，例如克隆自野生种Solanum bulbocastanum的Rpi-Blb1(RB)基因(Song et al.,2003；Vossen et al.,2003)，克隆自野生种S.venturi的Rpi-vnt1.1基因(Foster et al.,2009)。如果将这些基因转育到栽培种中，则会有效提高栽培种马铃薯晚疫病抗性(朱素贤等，2010)。

尽管在丰富的马铃薯野生种资源中存在广谱、持久的抗病基因，但是要将这些基因转育到栽培种中存在很大的困难。首先，74％以上野生种是二倍体，有些是六倍体，与四倍体栽培种杂交存在生殖隔离，无法杂交；其二，即便采用各种方法杂交成功，杂种后代会携带大量来自野生种的不利性状(遗传累赘)，需要几年至几十年的多代的回交才能消除。最为快速、直接的方法是从野生种中克隆广谱、持久的抗病基因，通过转基因技术导入栽培种中，但是，目前公众对于转基因作物还存在很多顾虑。

我们在马铃薯晚疫病抗性资源研究中，发现一份野生种资源对采自我国晚疫病高发区的多个高毒力晚疫病菌小种表现高抗(图1.C)。这份材料为本实验室保存的Solanumpapita Rvdb (2n＝4X＝48)，为起源于墨西哥的马铃薯野生种。据报道该野生种中可能含有晚疫病广谱抗病基因Rpi-Pat1(Vleeshouwers et al,2008)。尽管该种为四倍体，但是与栽培种存在杂交不亲和，很难与栽培种成功杂交(Espejo et al.,2012)。Rpi-Pat1在马铃薯晚疫病育种中有很好利用价值。但是,很难将Rpi-Pat1基因通过有性杂交转育到栽培种中。

我们利用抗病基因组测序技术(dRenSeq)通过对该材料测序，发现这份材料中很可能含有晚疫病广谱抗病基因Rpi-Pat1，但该基因与已报到基因存在3个核苷酸多态性位点。为了获得有性杂交后代，我们通过大量亲本组配，采用多次授粉方式，最后发现只有一个组合获得24粒实生种子。证实S.papita与栽培种确实存在杂交困难问题。利用测序结果设计了特异引物。对24粒实生种子播种得到的实生苗进行了分子标记检测，发现9个单株能够扩增出标记，进一步晚疫病接鉴定发现，这9个单株表现高抗，其余表现感病，与标记检测结果一致。这9个单株株型良好，薯块小，圆形，表皮较光滑，整体上表现出较好的农艺性状。可作为进一步杂交转育的亲本，用于广谱抗病基因的转育。

现有技术存在的问题：通过原生质体融合技术(体细胞杂交)可以克服有性杂交困难的问题，但实际上要获得野生种与栽培种的体细胞杂种技术难度很大，即便获得体细胞杂种，体细胞杂种减数分裂形成配子时会发生紊乱，往往不能产生杂种后代。

野生种与栽培种有性杂交，在向栽培种成功转育晚疫病抗病基因的同时，会带来不可预测的大量来自野生种的不利性状(遗传累赘)，需要多代的回交才能消除。通过转基因技术将野生种晚疫病抗病基因直接导入栽培种相对简单，但是公众还不能接受转基因马铃薯。

发明内容

本发明要解决的关键技术问题在于提供一种抗晚疫病马铃薯野生种资源的发掘方法。具体通过

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

1.一种抗晚疫病马铃薯野生种资源的发掘方法，包括：

(1)资源材料的发掘：资源材料为本实验室保存的S.papita Rvdb(2n＝4X＝48)；利用强毒力晚疫病菌小种HB0914-2和3928A(本实验室保存)经过多轮晚疫病离体叶片鉴定，筛选出一份起源于墨西哥的野生种材料S.papita-2(S.papita Rvdb)，高抗晚疫病，该材料植株表型接近栽培种，块茎性状比较好，薯块小，薯形圆形，流式细胞仪鉴定倍性为4倍体 (2n＝4X＝48)；

(2)抗病基因诊断：利用抗病基因组捕获测序技术对该材料进行抗病基因诊断，该材料含有晚疫病广谱抗病基因Rpi-Pat1，利用抗病基因组捕获测序获得的数据与Rpi-Blb1序列进行比较，结果显示Rpi-Pat1与Rpi-Blb1在编码区5’端存在差异，在1％碱基错配率下无法完全匹配。另外，在野生种S.papita-2材料中诊断出的抗病基因与已报道Rpi-Pat1存在3个单碱基突变(SNP)；

(3)Rpi-Pat1标记设计：利用已报道Rpi-Blb1基因特异引物进行扩增，结果表明该对引物无法扩增；再根据对野生种材料S.papita-2抗病基因测序结果，对抗病基因Rpi-Pat1及其同源抗病基因类似物进行了系统分析，设计了抗病基因位点特异引物Pat1F和Pat1R，以 RP2-F和RP2-R扩增内参基因(RNA Polymerase II,RP2)；在22个马铃薯材料中，只有S. papita-2材料中扩增出条带，在含有Rpi-Blb1基因的材料J101K27中仅扩增出很弱条带，表明引物对Rpi-Pat1基因扩增具有很高的特异性，可用于对Rpi-Pat1基因在转育过程中进行分子标记辅助选择跟踪；

(4)Rpi-Pat1基因有性杂交转育：通过大量亲本组配(102个)，以S.papita为父本，收集其花粉，采用多次给母本重复授粉，最后发现只有一个组合Brigus×S.papita杂交成功，总计获得24粒实生种子，将这24粒种子发芽，移栽实生苗，分别抽提两个亲本和24个杂交后代单株基因组DNA，用Rpi-Pat1特异引物和内参引物进行扩增，发现9个后代中可以检测到Rpi-Pat1标记；

(5)杂交后代抗性鉴定：采用强毒力晚疫病菌小种HB09-14-2和3828A对24个单株分别进行离体叶片鉴定，结果显示9个能扩增出标记的单株表现高抗，其余表现感病，与标记检测结果一致；总体上，杂交后代单株植株表型更趋向于栽培种，植株明显特征是茎秆叶柄基部有肾形环抱小叶，块茎近圆形，表皮基本光滑，表现出比较理想的杂交亲本材料特点，用其中几个抗性单株花粉与其他栽培种授粉，可以获得回交二代种子，表明该材料具有良好的交配亲和性，可用于广谱抗病基因Rpi-Pat1向马铃薯栽培种正常转育，培育抗晚疫病马铃薯新品种。

2.一种抗晚疫病马铃薯种资源筛选标记，包括如下两对引物：

RP2-F(内参)：5’-TCGTGGATTTTTCCGATCTC；

RP2-R(内参)：5’-ATCTCGCTCCATCTCTCCAA；

Pat1F：5’-GTGCCCTTTTCTGACCCTTTC；

Pat1R：5’-AACACAATTGAATTTTTAGAC。

3.一种马铃薯抗晚疫病基因Rpi-Pat1，基因编码区与GenBank已报道Rpi-Pat1序列 AY426259.1存在3个核苷酸变异位点，其中，679位为A，870位为T，2741位为G，斜杠后核苷酸为本专利测序结果如序列表SEQ ID NO：3，其中679位A和2741位G核苷酸位点变异导致两个氨基酸编码变异。

4.马铃薯杂交组合Brigus×S.papita在抗晚疫病基因Rpi-Pat1整合到栽培种品种中的应用。马铃薯野生种含有抗晚疫病基因Rpi-Pat1，而栽培种不含有，野生种和栽培种之间存在杂交不亲和现象。通过大量杂交组配(102个)，发现杂交组合Brigus×S.papita获得杂交种子，分子标记检测发现已将抗晚疫病基因Rpi-Pat1转育到杂种后代中。

有益效果：本申请通过大量资源筛选，筛选到一份优异晚疫病抗性野生种种质资源，通过抗病基因组测序，明确其含有广谱抗病基因Rpi-Pat1。依据抗病基因组测序结果，设计了 Rpi-Pat1基因特异引物，可用于监测该抗病基因转育。通过大量亲本和多次重复授粉技术，首次获得了该野生种与栽培种的有性杂种后代，分子标记检测和接种鉴定证明，通过有性杂交将来自野生种的Rpi-Pat1成功导入栽培种中，获得了农艺性状较好的杂种后代。本申请创制的资源材料和标记可用于马铃薯晚疫病抗病育种。

由于野生种S.papita与栽培种有性杂交十分困难，国外有报道通过原生质体融合技术 (体细胞杂交)获得S.papita与栽培种杂交后代(Espejo et al.,2012)，原生质体融合时两个原生质体染色体完全融合到一个细胞中，导致染色体倍性升高，体细胞杂种植株减数分裂形成配子时染色体配对往往发生紊乱，导致不能产生有性杂种后代。国内尚无发掘野生种S. papita晚疫病抗性的研究，Rpi-Pat1也没有在育种中应用。本研究通过常规有性杂交获得野生种S.papita与栽培种的杂交后代，后代植株表型良好、抗性突出；同时开发了用于选择该基因的特异分子标记，可以促进晚疫病广谱抗病基因Rpi-Pat1的在育种中的高效应用。利用原生质体融合技术可以突破有性杂交困难的障碍，获得体细胞杂种，然后通过体细胞杂种将 Rpi-Pat1转育到栽培种中。原生质体融合技术获得体细胞杂种实际上十分困难，即使获得体细胞杂种，减数分裂形成配子时很容易发生紊乱，往往不能产生有性杂种后代。理论上可以通过转基因技术将Rpi-Pat1转育到栽培品种中。

附图说明

图1为S.papita-2植株、块茎表型，倍性及晚疫病抗性鉴定；

其中，A.S.papita-2植株形态；B.块茎形态；C.晚疫病接种鉴定，12个马铃薯材料编号：1.AC029、2.03HE45-5、3.CT9-4,4.Hjt349-3、5.Cha、6.R7、7.98101、8.Amarilis、9.Yungay、10.华薯1号、11.J101K27和12.S.papita-2。晚疫病菌株HB09-14-2接种6天后发病症状。D.S.papita-2流氏细胞仪鉴定倍性。

图2为S.papita-2材料抗病基因诊断结果；

其中，A.与Rpi-Blb1基因比对结果，B.与Rpi-Pat1基因比对结果。

图3为S.papita-2材料中Rpi-Pat1与已报道基因序列3个SNP位点差异。

图4为S.papita-2材料中Rpi-Pat1基因编码区序列；

其中，灰色背景框标记部分为本专利所用材料测序结果与报道序列存在的3个核苷酸变异位点，斜杠后核苷酸为本专利测序结果，其中第一个和第3个核苷酸位点变异导致两个氨基酸编码变异。

图5Rpi-Blb1基因与Rpi-Pat1基因编码区核苷酸序列比较，灰框背景示意差异碱基，黑色背景示意相同碱基。

图6为Rpi-Pat1引物特异性检测；

其中，泳道M为DNA分子量标准DL2000。泳道1-23分别为：1.93012,2.93013,3.93036,4.93041,5.93042,6.94024,7.94053,8.E-potato-5,9.08HE171-1,10.S.papita-2,11. JX1,12.93038,13.94012,14.94016,15.94025,16.94031,17.J101K27,18.B3C321,19.06HE13-1,20.SD-14,21.Amarilis,22.E-potato-3,23.阴性对照。

图7为PCR扩增检测杂交组合后代中Rpi-Pat1基因；

其中，Maker为DL2000，泳道1-24为24个杂交后代，25为Brigus(母本)，26为S.papita-2 (父本)，27为阴性对照。

图8为Brigus和S.papita-2杂交后代24个单株晚疫病抗性鉴定结果。

图9为Brigus和S.papita-2杂交后代代表性单株株型和薯块形状；

其中，A.单株植株表型；B.茎秆叶柄基部有肾形环抱小叶(圆圈示意)；C.四个抗性单株块茎性状。

图10为杂交组合母本信息。

具体实施方法

本发明专利下述实施例中使用方法和装置，如无特殊说明，均为常规方法和装置；所用器材、试剂均为试剂公司购买的常规器材和试剂。为使本发明专利的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合具体实施例对本发明专利的具体实施方式进行详细说明。这些优选实施方式的示例在具体实施例中进行了例示。在此，还需要说明的是，为了避免因不必要的细节而模糊了本发明专利的技术方案，在实施例中仅仅示出了与根据本发明专利的方案密切相关的技术方案和/或处理步骤，而省略了关系不大的其他细节。

实施例1

本实施例提供一种抗晚疫病马铃薯野生种资源的发掘方法，包括：

1.资源材料的发掘：资源材料为本实验室保存的S.papita Rvdb(2n＝4X＝48)，为起源于墨西哥的马铃薯野生种。据报道该野生种种可能含有晚疫病广谱抗病基因Rpi-Pat1基因 (Vleeshouwers et al,2008)。尽管该种为四倍体，但是与栽培种存在杂交不亲和，胚败育等障碍(Espejo et al.,2012)。因此，很难将Rpi-Pat1基因通过有性杂交转育到栽培种中。

利用强毒力晚疫病菌小种HB0914-2和3928A(本实验室保存)经过多轮晚疫病离体叶片鉴定，筛选出一份起源于墨西哥的野生种材料S.papita-2(S.papita Rvdb)，高抗晚疫病 (附图1.C)。该材料植株表型接近栽培种(附图1.A)，块茎性状比较好，薯块小，薯形圆形(附图1.B)，流式细胞仪鉴定倍性为4倍体(2n＝4X＝48)(附图1.D)。

2.抗病基因诊断：利用抗病基因组捕获测序技术对该材料进行抗病基因诊断，该材料含有晚疫病广谱抗病基因Rpi-Pat1(附图2)。利用抗病基因组捕获测序获得的数据与Rpi-Blb1 序列进行比较，结果显示Rpi-Pat1与Rpi-Blb1在编码区5’端存在差异，在1％碱基错配率下无法完全匹配(附图2A)。另外，在野生种S.papita-2材料中诊断出的抗病基因与已报道 Rpi-Pat1存在3个单碱基突变(SNP)，见附图3。Rpi-Pat1基因编码区序列见附图4，灰色背景框示意3个SNP位点。Rpi-Pat1与Rpi-Blb1在编码区存在10个碱基的差异(附图5)。

3.Rpi-Pat1标记设计：目前国内外没有报道用于Rpi-Pat1筛选的分子标记。据报道 Rpi-Blb1与Rpi-Pat1是分别来自不同野生种S.bulbocastanum(2n＝2X＝24)和S.papita (2n＝4X＝48)的直系同源基因(Orthologous gene)(Vleeshouwers et al,2008)，尝试利用文献(Colton等，2006)报道的Rpi-Blb1(RB)基因特异引物进行扩增，结果表明该对引物无法扩增。

根据对野生种材料S.papita-2抗病基因测序结果，对抗病基因Rpi-Pat1及其同源抗病基因类似物进行了系统分析，设计了抗病基因位点特异引物Pat1F和Pat1R，以RP2-F和RP2-R 扩增内参基因(RNA Polymerase II,RP2)，具体引物序列见表1。在22个马铃薯材料中，只有在S.papita-2材料中扩增出条带，在含有Rpi-Blb1(RB)基因的材料J101K27中仅扩增出很弱条带(附图6)，表明我们设计的引物对Rpi-Pat1基因扩增具有很高的特异性，可用于对Rpi-Pat1基因在转育过程中进行分子标记辅助选择跟踪。PCR体系及扩增条件见表2和表3。

表1 Rpi-Pat1基因特异引物

表2 PCR扩增体系成份表

表3 Rpi-Pat1基因检测的PCR扩增程序

4.Rpi-Pat1基因有性杂交转育

文献报道S.papita与栽培种存在杂交不亲和，因此,很难将Rpi-Pat1基因通过有性杂交转育到栽培种中(Espejo et al.,2012)。为了获得有性杂交后代，以S.papita为父本，以附图10中的102份马铃薯材料为母本，进行大量亲本组配杂交尝试；收集S.papita花粉，采用多次给母本重复授粉，最后发现只有一个组合Brigus×S.papita杂交成功(母本为附图10 中的89号)，总计获得24粒实生种子。将这24粒种子发芽，移栽实生苗。分别抽提两个亲本和24个杂交后代单株基因组DNA，用Rpi-Pat1特异引物和内参引物进行扩增，发现9个后代中可以检测到Rpi-Pat1标记(附图7)。

5.杂交后代抗性鉴定

采用强毒力晚疫病菌小种HB09-14-2和3828A对24个单株分别进行离体叶片鉴定，结果显示9个能扩增出标记的单株表现高抗，其余表现感病(附图8，表4)，与标记检测结果一致。

表4 Brigus和S.papita-2杂交后代晚疫病抗性鉴定

注：I，免疫；R，抗病；MR，中抗；MS，中感；S感病。晚疫病菌小种为强毒力小种HB09-14-2。接种后5天观察记载叶片发病情况。

总体上，杂交后代单株植株表型更趋向于栽培种，植株明显特征是茎秆叶柄基部有肾形环抱小叶，块茎近圆形，表皮基本光滑，表现比较理想的杂交亲本材料特点(附图9)。我们用其中几个抗性单株花粉与其他栽培种授粉，获得了回交二代种子，表明该材料具有较好的交配亲和性，可用于广谱抗病基因Rpi-Pat1向马铃薯栽培种的正常转育，用来培育抗晚疫病马铃薯新品种。

实施例2

本实施例提供一种抗晚疫病马铃薯种资源筛选标记，包括如下两对引物：

RP2-F(内参)：5’-TCGTGGATTTTTCCGATCTC；

RP2-R(内参)：5’-ATCTCGCTCCATCTCTCCAA；

Pat1F：5’-GTGCCCTTTTCTGACCCTTTC；

Pat1R：5’-AACACAATTGAATTTTTAGAC。

实施例3

本实施例提供一种马铃薯抗晚疫病基因Rpi-Pat1序列见附图4。基因编码区与GenBank 已报道Rpi-Pat1序列(AY426259.1)存在3个核苷酸变异位点(灰色背景框标记部分)，斜杠后核苷酸为本专利测序结果(如序列表SEQ ID NO：3)，其中第1个和第3个核苷酸位点变异导致两个氨基酸编码变异。

以上所述仅是本申请的具体实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本申请的保护范围。

参考文献：

(1)Colton,L M,Groza H I,Wielgus S M,Jiang J M.2006.Marker-assistedselection for the broad-spectrum potato late blight resistance conferred bygene RB derived from a wild potato species.Crop Science,46:589-594.

(2)Espejo R,Cipriani G,Golmirzaie A.An efficient method of protoplastisolation and plant regeneration in the wild species Solanum papitaRydberg.Bio Techlogia,2012,16(4):24-31

(3)Foster S J,Park T H,Pel M,Brigneti G,Sliwka J,Jagger L,Van derVossen E,Jones J D. Rpi-vnt1.1,a Tm-22 Homolog from Solanum venturii,confersresistance to potato late blight.Mol. Plant Microbe Interact.,2009,22(5):589-600.

(4)Shandil R K,Chakrabarti S K,Singh B P,Sharma S,Sundaresha S,Kaushik S K,Bhatt A K,Sharma N N.Genotypic background of the recipient plantis crucial for conferring RB gene mediated late blight resistance inpotato.BMC Genet.2017,18(1):22.

(5)Song J,Bradeen J M,Naess S K,Raasch J A,Wielgus S M,et al.Gene RBcloned from Solanum bulbocastanum confers broad spectrum resistance to potatolate blight.Proc Natl Acad Sci USA.2003,100(16):9128-9133.

(6)Vleeshouwers VGAA,Rietman H,Krenek P,Champouret N,Young C,Oh S K,Wang M, Bouwmeester K,Vosman B,Visser R G,Jacobsen E,Govers F,Kamoun S,Vander Vossen E A. Effector genomics accelerates discovery and functionalprofiling of potato disease resistance and Phytophthora infestans avirulencegenes.PLoS One,2008,3(8):e2875.

(7)Vossen E A G,Sikkema A,Hekkert B L,Gros J,Allefs S.An ancient Rgene from the wild potato species Solanum bulbocastanum confers broad-spectrum resistance to Phytophthora infestans in cultivated potato andtomato.Plant Journal,2003,36(6):867-882.

(8)朱素贤，祝军，李颖，Maarten N，Marjan B，Hendrik R，Evert J.马铃薯广谱抗病Rpi-blb1同源基因抗性被进化晚疫病菌株克服.园艺学报.2010,37(02):241-246。

<110> 华中农业大学

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<212> DNA

<213> 马铃薯（Solanum tuberosum）

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1 ATGGCTGAAG CTTTCATTCA AGTTCTGTTA GACAATCTCA CTTCTTTCCT CAAAGGGGAA

61 CTTACATTGC TTTTCGGTTT TCAAGATGAG TTCCAAAGGC TTTCAAGCAT GTTTTCTACA

121 ATCCAAGCCG TCCTTGAAGA TGCTCAGGAG AAGCAACTCA ACAACAAGCC TCTAGAAAAT

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1201 CTTGATTTGA AACAATGCTT TGCGTATTGT GCGGTGTTCC CAAAGGATGC CAAAATGGAA

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1321 GAGCTAGAGG ATGTGGGCGA TGAAGTATGG AAAGAATTAT ACTTGAGGTC TTTTTTCCAA

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1621 TTACCATCTT CCATTGGAGA TCTAGTACAT TTAAGATACT TGAACCTGTA TGGCAGTGGC

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1741 TATTGCACCA AGCTTTGTTG TTTGCCAAAA GAAACAAGTA AACTTGGTAG TCTCCGAAAT

1801 CTTTTACTTG ATGGTAGCCA GTCATTGACT TGTATGCCAC CAAGGATAGG ATCATTGACA

1861 TGCCTTAAGA CTCTAGGTCA ATTTGTTGTT GGAAGGAAGA AAGGTTATCA ACTTGGTGAA

1921 CTAGGAAACC TAAATCTCTA TGGCTCAATT AAAATCTCGC ATCTTGAGAG AGTGAAGAAT

1981 GATAGGGACG CAAAAGAAGC CAATTTATCT GCAAAAGGGA ATCTGCATTC TTTAAGCATG

2041 AGTTGGAATA ACTTTGGACC ACATATATAT GAATCAGAAG AAGTTAAAGT GCTTGAAGCC

2101 CTCAAACCAC ACTCCAATCT GACTTCTTTA AAAATCTATG GCTTCAGAGG AATCCATCTC

2161 CCAGAGTGGA TGAATCACTC AGTATTGAAA AATATTGTCT CTATTCTAAT TAGCAACTTC

2221 AGAAACTGCT CATGCTTACC ACCCTTTGGT GATCTGCCTT GTCTAGAAAG TCTAGAGTTA

2281 CACTGGGGGT CTGCGGATGT GGAGTATGTT GAAGAAGTGG ATATTGATGT TCATTCTGGA

2341 TTCCCCACAA GAATAAGGTT TCCATCCTTG AGGAAACTTG ATATATGGGA CTTTGGTAGT

2401 CTGAAAGGAT TGCTGAAAAA GGAAGGAGAA GAGCAATTCC CTGTGCTTGA AGAGCTGATA

2461 ATTCACGAGT GCCCTTTTCT GACCCTTTCT TCTAATCTTA GGGCTCTTAC TTCCCTCAGA

2521 ATTTGCTATA ATAAAGTAGC TACTTCATTC CCAGAAGAGA TGTTCAAAAA CCTTGCAAAT

2581 CTCAAATACT TGACAATCTC TCGGTGCAAT AATCTCAAAG AGCTGCCTAC CAGCTTGGCT

2641 AGTCTGAATG CTTTGAAAAG TCTAAAAATT CAATTGTGTT GCGCACTAGA GAGTCTCCCT

2701 GAGGAAGGGC TGGAAGGTTT ATCTTCACTC ACAGAGTTAT GTGTTGAACA CTGTAACATG

2761 CTAAAATGTT TACCAGAGGG ATTGCAGCAC CTAACAACCC TCACAAGTTT AAAAATTCGG

2821 GGATGTCCAC AACTGATCAA GCGGTGTGAG AAGGGAATAG GAGAAGACTG GCACAAAATT

2881 TCTCACATTC CTAATGTGAA TATATATAAT TAA