同时定量检测多个肺癌标志物的抗体芯片及试剂盒

摘要

本发明涉及一种同时检测多个肺癌标志物的芯片，包括固相载体、固定在所述固相载体上的肿瘤标志物的捕获抗体，所述肺癌标志物为选自CA125抗体、CEA抗体、NSE抗体、SCCA1抗体、CY21‑1抗体、pro‑GRP抗体中的至少三种。本发明通过优化到合适的抗体组合(特别是一抗和二抗的组合)，能够实现高特异性和高灵敏度地、一次性地检测多个(一至六个)肺癌的生物标志物(CA125、CEA、NSE、SCCA1、CY21‑1、pro‑GRP)，可大大提高肺癌的检测效率，实现早期诊断，同时在高通量芯片的检测平台下，有效降低了成本，为人类健康带来福音。

说明书

技术领域

本发明属于体外免疫分析技术领域，特别是涉及一种同时定量检测多个肺癌标志物的抗体芯片及试剂盒。

背景技术

肺癌是最常见的恶性肿瘤，在我国，来至全世界都是第一大癌症死因。根据2012年世界卫生组织公布的全球统计报告，全世界每年肺癌新增患者达到180万人，而每年有超过140万人死于肺癌；在我国肺癌死亡率也居于首位。肺癌早期症状不明显，大约80％左右的肺癌一经确诊就是中晚期，其生存率仅有7.5％，但早期诊断、治疗后，五年的生存率可达到80％以上。因此开发上市一款满足临床应用需求的肺癌诊断产品，为肺癌早期患者提供检测服务，实现早发现、早治疗，为肺癌患者造福，将具有非常重大的价值。

随着肿瘤细胞的发生，肿瘤患者体内某些蛋白质会发生变化，或产生新的与肿瘤关联的异常蛋白。这些能反应肿瘤存在的化学类物质人们总称为肿瘤标志物。由于肿瘤标志物或不存在于正常成人组织而仅见于肿瘤组织，或在肿瘤组织中的含量大大超过或者低于在正常组织里的含量，它们的存在或量变可以提示肿瘤的性质，因此通过对这些异常的蛋白质的检测不仅可以用来诊断肿瘤的发生也可以用来监控药物对肿瘤的治疗进展，对肿瘤的诊治将起到重要作用。用于临床诊断的肿瘤标志物包括癌胚抗原、酶、激素、糖蛋白、癌基因和细胞表面肿瘤抗原等6大类。以下为临床诊断中常用的血清肺癌标志物辅助诊断：癌胚抗原(CEA)，癌抗原CA125，角蛋白19(CY21-1)，人鳞状细胞癌抗原1(SCCA1)，胃泌素释放前体(pro-GRP)，神经原特异性烯醇化酶(NSE)。癌胚抗原(CEA)、癌抗原CA125为癌症广谱生物标志物，在肺癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌等均有较高的表达。人鳞状细胞癌抗原1(SCCA1)在肺癌和卵巢癌中有较高的表达。角蛋白19(CY21-1)主要作为区分非小细胞肺癌的标志物。神经原特异性烯醇化酶(NSE)是神经母细胞瘤和小细胞肺癌的标记物。

生物芯片以成熟酶免(ELISA)技术为基础，实现样本的高通量筛选和检测，对于肺癌多指标诊断的方式，是一个非常重要的技术支撑和未来应用的基础平台。

肺癌标志物的临床诊断多有赖于以双抗体夹心法ELISA为主的免疫学方法。常规的ELISA一次只能从样品检测一个肿瘤标志物。对多个肿瘤标志物的检测用常规ELISA不止耗时耗力，而且需要许多病人的样品。

发明内容

基于此，为了解决上述技术问题，本发明提供的一种可以同时定量检测六个肿瘤标志物的肺癌芯片以及试剂盒。

实现上述目的的技术方案如下。

一种同时检测多个肺癌标志物的芯片，包括固相载体、固定在所述固相载体上的肿瘤标志物的捕获抗体，所述肺癌标志物为选自CA125抗体、CEA抗体、NSE抗体、SCCA1抗体、CY21-1抗体、pro-GRP抗体中的至少三种，所述固相载体为氨基化玻片或醛基化玻片。

在其中一些实施例中，所述固相载体为氨基化玻片或醛基化玻片，进一步优选为醛基化玻片。

一种同时定量检测多个肺癌标志物的试剂盒，包括至少6个上述同时检测多个肺癌标志物的芯片，以及肿瘤标志物的检测抗体，所述肺癌标志物为选自CA125抗体、CEA抗体、NSE抗体、SCCA1抗体、CY21-1抗体、pro-GRP抗体中的至少三种，所述检测抗体标记有免疫信号放大标记物；所述同时检测多个肺癌标志物的芯片之间所包被的对应的捕获抗体的量不同。

在其中一些实施例中，所述CA125抗体为广州瑞博奥生物科技有限公司的、货号为118-11248的抗体，Santa Cruz Biotechnology的货号为Sc-52095的抗体中的至少一种。

在其中一些实施例中，所述CEA抗体为郑州赛图康生物科技有限公司的、货号为CTA-1003或CTA-1004的抗体，Novus Biologicals的、货号为NBP2-52673的抗体的至少一种。

在其中一些实施例中，所述NSE抗体为广州瑞博奥生物科技有限公司的、货号为9602-100116的抗体，深圳盛源生物技术有限公司的、货号为C191的抗体的至少一种。

在其中一些实施例中，所述SCCA1抗体为广州瑞博奥生物科技有限公司的、货号为130-10459的抗体，广州淳源生物科技有限公司的、货号为SCCA1-103或SCCA1-104的抗体的至少一种。

在其中一些实施例中，所述CY21-1抗体为广州瑞博奥生物科技有限公司的、货号为130-10317或130-10426的抗体，上海领潮生物科技有限公司的、货号为L1C00706的抗体的至少一种。

在其中一些实施例中，所述pro-GRP抗体为菲鹏生物股份有限公司的、货号为4#和5#的抗体的至少一种。

在其中一些实施例中，所述捕获抗体为CA125抗体、CEA抗体、NSE抗体、SCCA1抗体、CY21-1抗体、和pro-GRP抗体。

在其中一些实施例中，所述固相载体上还固定有蛋白标准品，优选地，为生物素标记的牛IgG。

在其中一些实施例中，还包括含有0.5％±0.01蔗糖的pH为7.3-7.5的磷酸盐缓冲液。

在其中一些实施例中，所述捕获抗体有Santa Cruz Biotechnology的货号为Sc-52095的CA125抗体，郑州赛图康生物科技有限公司的、货号为CTA-1003的CEA抗体，NovusBiologicals的、货号为NBP2-52673的CEA抗体，广州瑞博奥生物科技有限公司的、货号为9602-100116的NSE抗体，深圳盛源生物技术有限公司的、货号为C191的NSE抗体，广州瑞博奥生物科技有限公司的、货号为130-10459的SCCA1抗体，广州瑞博奥生物科技有限公司的、货号为130-10317的CY21-1抗体，上海领潮生物科技有限公司的、货号为L1C00706的CY21-1抗体，和菲鹏生物股份有限公司的、货号为5#的pro-GRP抗体。

在其中一些实施例中，所述检测抗体有CA125抗体为广州瑞博奥生物科技有限公司的、货号为118-11248的CA125抗体，郑州赛图康生物科技有限公司的、货号为CTA-1003的CEA抗体，郑州赛图康生物科技有限公司的、货号为CTA-1004的CEA抗体，广州瑞博奥生物科技有限公司的、货号为9602-100116的NSE抗体，深圳盛源生物技术有限公司的、货号为C191的NSE抗体，广州淳源生物科技有限公司的、货号为SCCA1-103和SCCA1-104的抗体，广州瑞博奥生物科技有限公司的、货号为130-10317的CY21-1抗体，和菲鹏生物股份有限公司的、货号为4#的pro-GRP抗体。

在其中一个实施例中，所述免疫信号放大系统为生物素-亲合素系统，所述检测抗体标记有生物素。

在其中一个实施例中，包括有6-10个或6-12个，或6-16个，或16个权利要求1-4任一项所述的同时检测多个肺癌标志物的芯片，每个所述芯片上肿瘤标志物的捕获抗体的包被量为如下：

CA125抗体：140-160ug/ml；CEA抗体：190-210ug/ml；

NSE抗体：580-620ug/ml；SCCA1抗体：580-620ug/ml；

CY21-1抗体：190-210ug/ml；pro-GRP抗体：780-820ug/ml。

在其中一个优选的实施例中，所述芯片上肿瘤标志物的捕获抗体的包被量为如下：

CA125抗体：150ug/ml；CEA抗体：200ug/ml；NSE抗体：600ug/ml；

SCCA1抗体：600ug/ml；CY21-1抗体：200ug/ml；pro-GRP抗体：800ug/ml。

在其中一个优选的实施例中，所述检测抗体的溶度是：CA125抗体22-26ng/ml、CEA抗体12.5-13.5ng/ml、NSE抗体38-42ng/ml、SCCA1抗体14-16ng/ml、CY21-1抗体12.5-13.5ng/ml和pro-GRP抗体48-52ng/ml。

本发明通过优化到合适的抗体组合(特别是一抗和二抗的组合)，能够实现高特异性和高灵敏度地、一次性地检测多个(一至六个)肺癌的生物标志物(CA125、CEA、NSE、SCCA1、CY21-1、pro-GRP)，在此基础上，优化芯片处理，大大提高肺癌的检测效率，实现早期诊断，同时在高通量芯片的检测平台下，有效降低了成本，为人类健康带来福音。

附图说明

图1为本发明同时定量检测多个肺癌标志物的芯片的使用步骤参考图。

图2为实施例3中两种不同芯片的检测结果示意图。

图3为6种肺癌标志物的标准曲线图。

图4为6种肺癌标志物的检测指标与罗氏试剂的检测结果相关性分析结果示意图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将参照实施例对本发明进行更全面的描述，以下给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。应理解，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用试剂，均为市售产品。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

本发明提供了一种可以同时定量检测六个肿瘤标志物的肺癌芯片试剂盒，包括：(1)同时固定有若干种特异性抗体(捕获抗体)的玻片，所述特异性抗体与肿瘤标志物能够发生抗体-抗原反应，每种特异性抗体分别固定于所述玻片形成若干个独立识别位点；和(2)反应剂和检测剂，利用能肿瘤标志物能够发生抗体-抗原反应的检测抗体，通过夹心ELISA方法检测待测样品中是否存在能够与所述特异性抗体发生抗体-抗原反应的物质。

优选地，每张芯片上所述独立识别位点上固定有单一浓度的一种抗体，一种抗体以一种或者一种以上的浓度分别固定于玻片形成一个或者一个以上独立识别位点。

优选地，所述特异性捕获抗体中的任意一种以200ug～1000ug的含量点样固定于所述独立识别位点。

优选地，所述试剂盒中含有至少6个上述抗体芯片，优选为6-16个，可以是8个，9个，10个，11个，12个，13个，14个，15个，16个，每个抗体芯片上的相同的特异性捕获抗体包被量一样。优选地，所述试剂盒含有16个上述芯片构成的芯片组，每个芯片上的同样的特异性捕获抗体包被量一样，所述浓度范围为150ug～1000ug/ml(优选地，CA125抗体：140-160ug/ml；CEA抗体：190-210ug/ml；NSE抗体：580-620ug/ml；SCCA1抗体：580-620ug/ml；CY21-1抗体：190-210ug/ml；pro-GRP抗体：780-820ug/ml，更进一步在优选的实施例中，每个芯片上CA125包被抗体150ug/ml；CEA包被抗体200ug/ml；NES包被抗体600ug/ml；SCCA1包被抗体600ug/ml；CY21-1包被抗体200ug/ml；pro-GRP包被抗体800ug/ml)。芯片组的制备可以参考申请人的专利CN201420604204.1：例如硬质框架的框内划分为2×8个小格，可形成16个反应孔。用两个U型夹将一块标准载玻片、一块软质硅胶垫以及一个16孔(2×8孔)的硬质框架依次组装成一个16孔的独立反应容器；每个孔内可以点上多种抗体，做成抗体芯片。

在本发明的一个优选实施方案中，所述反应剂包括抗体混合液，所述抗体混合液为所述若干种特异性抗体的混合溶液，抗体混合液中的特异性抗体上标记有生物素。更优地，所述反应剂还包括识别生物素标记的链霉亲和素，所述反应剂还包括识别生物素标记的链霉亲和素，所述链霉亲和素标记有荧光染料，荧光染料为Cy3或具类似吸收波长的荧光染料。

在本发明的一个优选实施方案中，所述反应剂包括蛋白标准品，所述蛋白标准品为具有梯级浓度所述若干种重组蛋白的混合物。不同种重组蛋白通过一定的量比混合在一起，分装后用冷冻抽干的方法干燥。

另一方面，本发明的所有解决的技术问题还在于提供一种定量检测肿瘤标志物的蛋白质芯片试剂盒的制备方法，该方法包括一将特异性抗体固定于玻片的步骤，该步骤包括：

(1)将准备好的抗体(POS1、POS2(生物素标记的牛IgG)、CA125、CEA、NSE、SCCA1、CY21-1、pro-GRP)，用点样仪器点制成图1的整列(6*8，列*行)，捕获抗体的具体浓度为CA125包被抗体150ug/ml；CEA包被抗体200ug/ml；NES包被抗体600ug/ml；SCCA1包被抗体600ug/ml；CY21-1包被抗体200ug/ml；pro-GRP包被抗体800ug/ml。

(2)将点样好的玻片放于室温条件下静置过夜，于2℃到8℃保存备用。

其中，步骤(1)中采用全自动点样仪完成点样操作，各特异性蛋白质芯片点阵排布于所述玻片。

在本发明的一个实施例中，步骤(1)的点样操作中，采用美国铂金艾尔默(PerkinElmer)公司生产的全自动点样仪器。各特异性抗体蛋白质芯片点阵排布于玻片，而在具体的操作过程中，各特异性抗体的排布可以按照实验设计需要进行调整，根据不同的抗体蛋白芯片排布阵列，控制全自动点样仪，制备出所需要的中间产品。

通常，生物芯片制备过程中的难点在于如何采用特殊处理的固相及适配的缓冲液溶解抗体，试剂不仅要能识别靶向物，同时亦要能不和其他靶向物进行反应，同时要保持反应的稳定性，使芯片的有效期不低于一年。本发明经过多次筛选的缓冲液与特定抗体组合，最终形成合格的固相芯片。

实施例1

所述同时定量检测多个肺癌标志物的芯片制备如下。

一、抗体芯片的生产：

1、条件控制：

温度：(15～20)℃，湿度：45％～55％之间。

2、抗体芯片点制：

将准备好的浓度在150ug～1000ug/ml(CA125包被抗体150ug/ml；CEA包被抗体200ug/ml；NES包被抗体600ug/ml；SCCA1包被抗体600ug/ml；CY21-1包被抗体200ug/ml；pro-GRP包被抗体800ug/ml。)的抗体(POS1、POS2、CA125、CEA、NSE、SCCA1、CY21-1、pro-GRP)，用点样仪器点制成图1的整列(6*8，列*行)。

3、结合：

在上述条件控制设定的制备温度湿度下结合过夜。

4、干燥：

37℃干燥3个小时。

5、组装：

与芯片框架组装成试剂盒半成品。

二、实验操作步骤(一步法)

1、玻片芯片的预处理

将玻片芯片从盒子中取出来，在室温平衡20-30min后，将包装袋打开，揭开密封条。

2、封闭：每个孔中加100μl的封闭液，封板，室温摇床上孵育30分钟，封闭定量抗体芯片。

3.、清洗：1×洗液I清洗5次，每次振荡10秒，每孔300μl，洗板完成后抽干净洗液。

4、上样、孵育：每孔加入75ul的检测抗体混合物，再加入25ul的标准品或样本，封板，37℃，500rad/min下温育1小时。

5、清洗：步骤3相同。

6、显色液(Cy3-链霉亲和素)

每孔加100μl的显色液，封板，37℃，500rad/min下温育45分钟。

7、清洗：步骤3相同。

8、荧光检测

1)将玻片框架拆掉，小心不要用手接触到玻片印制抗体的一面。

2)去除玻片的残留洗液。

3)采用北京博奥的激光扫描仪扫描信号，采用Cy3或者绿色通道(激发频率＝532nm)。

9、芯片的数据提取以及用分析软件来进行数据分析。

1)通过标准品信号与浓度的对数关系建立最小二乘法曲线，获得改试剂盒6个项目的标准曲线。

2)将样本信号的对数带入标准曲线，计算被检测样本的各指标浓度。

本实施例所采用的参试抗体如表1所示，其中所涉及的供应商如下：广州瑞博奥生物科技有限公司(瑞博奥)、郑州赛图康生物科技有限公司(赛图康)、Invitrogen、Novus,上海领潮生物科技有限公司(上海领潮)、杭州华葵金培生物科技有限公司(华葵金培)、SantaCruz、菲鹏生物股份有限公司(菲鹏)、深圳常量医学工程有限公司(深圳常量)、广州埃唯迪生物科技有限公司(广州埃唯迪)、R&D、Origene、深圳盛源生物技术有限公司(深圳盛源)、广州淳源生物科技有限公司(淳源生物)。在37℃下，采用Thermo Scientific

配对性检测实验的实验参数为：载体，96孔板；抗原稀释液，1％BSA+PBS；封闭液，2％BSA+PBS；抗体稀释液，1％BSA+PBS；洗涤液，0.1％tween-20+Tris.Cl。

表1参试抗体信息

2.检测结果

本实施例部分参试抗体的配对性检测结果如表2–7所示。

表2 CA125-特异性抗体的抗原配对性检测响应信号值

表3 CEA-特异性抗体的抗原配对性检测响应信号值

表4 NSE-特异性抗体的抗原配对性检测响应信号值

表5 SCCA1-特异性抗体的抗原配对性检测响应信号值

表6 CY21-1-特异性抗体的抗原配对性检测响应信号值

表7 pro-GRP-特异性抗体的抗原配对性检测响应信号值

从抗CA125-特异性抗体的配对性检测中可以得出，第二、四、六CA125抗体会与其它抗原发生交叉反应。

从抗CEA-特异性抗体的配对性检测中可以得出，第四CEA抗体的响应信号值偏低，第三、五的CEA抗体会与其它抗原发生交叉反应。

从抗NSE-特异性抗体的配对性检测中可以得出，第二、四、六NSE抗体与其它抗原发生交叉反应。

从抗SCCA1-特异性抗体的配对性检测中可以得出，第二、五、六SCCA1抗体会与其它抗原发生交叉反应。

从抗CY21-1-特异性抗体的配对性检测中可以得出，第四、五、六CY21-1抗体会与其它抗原发生交叉反应。

从抗pro-GRP特异性抗体的配对性检测中可以得出，第三、四、六pro-GRP抗体与其它抗原发生交叉反应。

综上，第一、三、五CA125抗体，第一、二、六CEA抗体，第一、三、五NSE抗体，第一、三、四SCCA1抗体，第一、二、三CY-21-1抗体，第一、二、五pro-GRP抗体适合用于制作同时实现CA125、CEA、NSE、SCCA1、CY-21-1、pro-GRP多通量检测的检测芯片。

实施例2

1.参试抗体

选取实施例1中的以下抗体作为本实施例的参试抗体：

第一CA125抗体、第三CA125抗体、第五CA125抗体；

第一CEA抗体、第二CEA抗体、第六CEA抗体；

第一NSE抗体、第三NSE抗体、第五NSE抗体；

第一SCCA1抗体、第三SCCA1抗体、第四SCCA1抗体；

第一CY-21-1抗体、第二CY-21-1抗体、第三CY-21-1抗体；

第一pro-GRP抗体、第二pro-GRP抗体、第五pro-GRP抗体。

2.实验设置方式

使以同一种肺癌肿瘤标志物作为特异性抗原的参试抗体分别作为捕获抗体(一抗)和检测抗体(二抗)，一一对应组合，开展抗体间的配对实验，抗体间的配对实验的实验参数为：载体，醛基化玻璃片；一抗稀释液，PBS+1％BSA；封闭液，2％BSA+PBS；抗原稀释液，1％BSA+PBS；二抗稀释液，PBS；洗涤液，0.1％tween-20+Tris.Cl。

3.检测结果

抗体间的配对实验结果如表8–13所示，可以选择具有高响应信号值的抗体对构建依据ELISA双抗体夹心法设计的检测肺癌肿瘤的试剂盒。

表8抗CA125-特异性抗体的抗体间配对实验检测响应信号值

表9抗CEA-特异性抗体的抗体间配对实验检测响应信号值

表10抗NSE-特异性抗体的抗体间配对实验检测响应信号值

表11抗SCCA1特异性抗体的抗体间配对实验检测响应信号值

表12 CY21-1-特异性抗体的抗体间配对实验检测响应信号值

表13抗pro-GRP-特异性抗体的抗体间配对实验检测响应信号值

实施例3

1.实验设置方式

本实施例以配制捕获抗体混合物的芯片的固相载体作为变量设置两组处理组，处理组设置方式：处理a，以醛基化玻片作为芯片的固相载体；处理b，以醛基化玻片作为芯片的固相载体。

本实施例采用的一抗组合为实施例1中的：第三CA125抗体、第一CEA抗体、第六CEA抗体、第一NSE抗体、第三NSE抗体、第一SCCA1抗体、第二CY21-1抗体、第四CY21-1抗体和第一pro-GRP抗体。

本实施例采用的二抗组合为实施例1中的：第一CA125抗体、第二CEA抗体、第一CEA抗体、第三NSE抗体、第一NSE抗体、第四SCCA1抗体、第三SCCA1抗体、第一CY21-1抗体和第二pro-GRP抗体。

将一抗组合所包括的抗体溶于含有0.5％蔗糖的pH＝7.4磷酸盐缓冲液中形成抗体混合物；采用全自动点样仪(铂金艾尔默公司)，于抗体混合物中将每个抗体分别固定于氨基化玻片和醛基化玻片的点样孔中，具体的芯片点阵示意图如图1所示，生物素标记的牛IgG作为阳性对照。生物素标记的牛IgG有两种不同浓度(本发明实施例中都优选为1mg/ml,0.3mg/ml)的阳性对照在每个芯片中，和捕获抗体一样，都有6次的重复。然后加入二抗(即检测抗体0.01-0.5mg/ml，本实施例中，CA125抗体25ng/ml、CEA抗体13.3ng/ml、NSE抗体40ng/ml、SCCA1抗体15ng/ml、CY21-1抗体13.3ng/ml和pro-GRP抗体50ng/ml)及底物进行检测。将采用处理pH＝7.4磷酸盐缓冲液参试缓冲液制备的芯片一一对应地编号为芯片a、芯片b。

2.测试结果

如图2所示，芯片a和芯片b的背景都比较清晰干净，两者相比，采用醛基化玻片作为固相载体制作得到的芯片具有更优异测试性能。

实施例4

1.实验设置方式

实施例以配制捕获抗体混合物的缓冲液的组成作为变量设置两组处理组，处理组设置方式：

1.1处理A

参试缓冲液：pH＝7.4磷酸盐缓冲液；

抗体组合：

采用的一抗组合为实施例1中的：第三CA125抗体、第一CEA抗体、第六CEA抗体、第一NSE抗体、第三NSE抗体、第一SCCA1抗体、第二CY21-1抗体、第四CY21-1抗体和第一pro-GRP抗体。

采用的二抗组合为实施例1中的：第一CA125抗体、第二CEA抗体、第一CEA抗体、第三NSE抗体、第一NSE抗体、第四SCCA1抗体、第三SCCA1抗体、第一CY21-1抗体和第二pro-GRP抗体。

1.2处理B

参试缓冲液：含有0.5％蔗糖的pH＝7.4磷酸盐缓冲液。

抗体组合：

采用的一抗组合为实施例1中的：第三CA125抗体、第一CEA抗体、第六CEA抗体、第一NSE抗体、第三NSE抗体、第一SCCA1抗体、第二CY21-1抗体、第四CY21-1抗体和第一pro-GRP抗体。

采用的二抗组合为实施例1中的：第一CA125抗体、第二CEA抗体、第一CEA抗体、第三NSE抗体、第一NSE抗体、第四SCCA1抗体、第三SCCA1抗体、第一CY21-1抗体和第二pro-GRP抗体。

如实施例3，将两组一抗组合所包括的抗体对应地分别溶于处理A和处理B的参试缓冲液中形成抗体混合物；采用全自动点样仪(铂金艾尔默公司)，于抗体混合物中将每个抗体含量以0.01至0.5ng(CA125抗体25ng/ml、CEA抗体13.3ng/ml、NSE抗体40ng/ml、SCCA1抗体15ng/ml、CY21-1抗体13.3ng/ml和pro-GRP抗体50ng/ml)固定于醛基化玻片的点样孔中，具体的芯片点阵示意图如图1所示，生物素标记的牛IgG作为阳性对照。生物素标记的牛IgG有两种不同浓度,与捕获抗体一样，在每个芯片中都有六次的重复。然后加入同组的二抗及底物进行检测。将分别采用处理A、处理B的固相载体以及抗体组合制备的芯片一一对应地编号为芯片A、芯片B。

2.测试结果

芯片A和芯片B的测试结果分别如表14和表15所示。在芯片A、B提供的液体环境中，各抗体对均未发生交叉反应，但发现在芯片A提供的液体环境中阳性信号相对芯片B较低，背景相对芯片B较高；而在芯片B提供的液体环境中CY21-1抗体间的配对响应值偏低。据此得出结论：制作检测芯片时，采用含有0.5％蔗糖的pH＝7.4磷酸盐缓冲液作为溶解一抗的缓冲液，结合醛基化芯片，能够为CA125、CEA、NSE、SCCA1、CY21-1、pro-GRP的多通量检测提供理想的液体反应环境。

表14芯片A的响应信号值

表15芯片B的响应信号值

实施例5

1)按照实施例3所述的同时定量检测多个肺癌标志物的芯片，以醛基化玻片作为芯片的固相载体，共有16个同时定量检测多个肺癌标志物的芯片组成，其中6个加入蛋白标准品作为标曲，其它10个可以加入血样来检测血样中目标蛋白的浓度。每个芯片上的包被的捕获抗体的浓度是一样的：CA125包被抗体150ug/ml；CEA包被抗体200ug/ml；NES包被抗体600ug/ml；SCCA1包被抗体600ug/ml；CY21-1包被抗体200ug/ml；pro-GRP包被抗体800ug/ml。

检测抗体的浓度为：CA125抗体25ng/ml、CEA抗体13.3ng/ml、NSE抗体40ng/ml、SCCA1抗体15ng/ml、CY21-1抗体13.3ng/ml和pro-GRP抗体50ng/ml。

采用有0.5％蔗糖的pH为7.4的磷酸盐缓冲液作为溶解一抗的缓冲液。

2)试剂盒的灵敏度和特异性数据

S1.样本的预处理

利用RIPA细胞裂解液、蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂配制样本处理液，采用样本处理液对样本进行稀释，血浆、血清、细胞上清液、细胞或组织裂解液均适用于作为本实施例的所述检测试剂盒的待测样本。注：不同样品的样本预处理方式不一样：血浆、血清使用前用样品处理液1：1稀释；细胞上清液可用原液；细胞或组织裂解液经蛋白浓度测定后利用样本处理液配制成蛋白浓度为50－500μg/mL的样本稀释液。

S2.检测芯片的完全干燥

将检测芯片从盒子中取出来，在室温平衡20–30分钟后，将包装袋打开，揭开密封条，然后将芯片放在真空干燥器或者室温干燥1-2小时。

S3.封闭和孵育

S3.1每个孔中加100μL的样品稀释液，室温摇床上孵育30分钟，封闭定量抗体芯片。

S3.2抽去每个孔中的缓冲液，添加100μL的标准液和样品到孔中，在摇床上4℃过夜孵育。

S3.3清洗

抽去每个孔中的标准品或样品，1从洗液I清洗5次，每次5min室温摇床震荡，每孔150μL的1×洗液I，每次清洗要抽干净洗液，用去离子水稀释20×洗液I。

抽去每个孔中的1×洗液I，加入1×洗液II清洗2次，每次5min室温摇床震荡，每孔150μL的1×洗液II，每次清洗要抽干净洗液，用去离子水稀释20×洗液II。

S3.4检测抗体混合物的孵育

离心检测抗体混合物小管，然后加入1.4ml的样品稀释液，混合均匀后再次快速离心。添加80μl的检测抗体到每个孔中，室温摇床上孵育2小时。

S3.5清洗

抽去每个孔中的检测抗体，1×洗液I清洗5次，每次5min室温摇床震荡，每孔150μl的1×洗液I，每次清洗要抽干净洗液，然后加入1×洗液II清洗2次，每次5min室温摇床震荡，每孔150μL的1×洗液II，每次清洗要抽干净洗液。

S3.6 Cy3-链霉亲和素的孵育

离心Cy3-链霉亲和素小管，然后加入1.4mL的样品稀释液，混合均匀后再次快速离心。添加80μL的Cy3-链霉亲和素到每个孔中，用铝箔纸包住玻片避光孵育，室温摇床上孵育1个小时。

S3.7清洗

抽去每个孔中的Cy3-链霉亲和素，1×洗液I清洗5次，每次5min室温摇床震荡，每孔150μl的1×洗液I，每次清洗要抽干净洗液。

S3.8荧光检测

1)将玻片框架拆掉，小心不要用手接触到玻片印制抗体的一面。

2)将玻片放置在玻片清洗管中，添加约30ml的1×洗液I，能整个覆盖住玻片，在室温摇床上震荡15min，弃去1×洗液I，添加约30ml的1×洗液II，在室温摇床上震荡5min。

3)去除玻片的残留洗液。将玻片放置在玻片清洗管/干燥管中，不盖盖子，在1000rpm离心3min。

4)采用激光扫描仪例如Axon GenePix扫描信号，采用Cy3或者绿色通道(激发频率＝532nm)。

S3.9芯片的数据提取以及用分析软件来进行数据分析

1)用GenePix软件来读取生物芯片的荧光值。

2)读数后选用的数值为除掉地方背景的中间值读数(F532Median－LocalBackground)。用常规的定量芯片计算软件作每个肿瘤标志物的标准曲线。

可以按照以下方法绘制上述标准曲线：

添加500μL的样本处理液到肿瘤标志物标准混合物的小管中，重新溶解标准品。打开小管前，先快速的离心，轻轻的上下抽打溶解粉末，标记这个小管为Std1；分别标记6个干净的离心管为Std2、Std3、Std4、Std5，添加200μL的样本处理液到每个小管中；从Std1中抽取100μL稀释样品加入到Std2中轻轻混合，然后从Std2中抽取100μL加入到Std3中，如此梯度稀释至Std5；抽取100μL的样品稀释液到另一个新的离心管中，标记为CNTRL，作为阴性对照。采用试剂盒的检测芯片按照上述测得Std1–Std5分别对应的荧光强度，利用标准浓度值及其对应的荧光强度值拟合得到标准曲线(参见图3)。

线性范围:

灵敏度:

根据以上标准曲线，计算10次空白测试对应浓度的均值；见下表

特异性:

分别向每孔加单一抗原(500U/ml的CA125、100ng/ml的CEA、100ng/ml的NSE、30ng/ml的SCCA1、20ng/ml的CY21-1、1000pg/ml的pro-GRP、100ng/ml的AFP、500pmol/ml的HE4、500U/ml l的CA199、100U/ml l的CA724)，测试该体系下的交叉特异性；见下表。

3)试剂盒的稳定性实验

配制两个质控品置于2～8℃冰箱，将试剂盒置于37℃-3天、7天、8天后以2～8℃试剂盒作为对照组，分别检测2～8℃保存的两个质控品(蛋白标准品)，计算加速前后检测结果的相对偏差；见下表。而试剂盒放在37℃中，分别放了0，3，7，8天，每过0，3，7，8天分别检测放在冰箱中保存的质控品，得到稳定性的结果。结果显示稳定性良好，即使在37℃放置8天，结果偏差在6％以内。

高浓度质控品

高浓度质控品

4)试剂盒的临床血清实施(与其他试剂盒的对比)

各指标与罗氏试剂的检测结果相关性分析如下。

以优选的CA125,CEA,NSE,SCCA1,CY21-1,proGRP的6种蛋白之特异性抗体，按照实施例3的方式制备试剂盒。6种蛋白之特异性抗体按照图1所示进行点样。采用本试剂盒检测30份临床样本(临床样本的的检测值已知，采用电化学发光法测得)，检测方法同实施例5所述。将临床样本检测值与本试剂盒的检测值对比画成散点图，其相关性如下：电化学发光检测结果与本试剂盒的检测结果基本相当。结果参见图4(X轴为罗氏试剂盒的检测信号值，Y轴为本试剂盒的检测信号值)。

图4为本试剂盒CEA抗体与电化学发光法试剂盒检测结果的相关性如下，其趋势方程为y＝0.9774x-0.2893，相关系数为0.9808。CA125抗体与电化学发光法试剂盒检测结果的相关性如下，其趋势方程为y＝1.0488x-27.724，相关系数为0.966。NSE抗体与电化学发光法试剂盒检测结果的相关性如下，其趋势方程为y＝0.9966x-1.3364，相关系数为0.9672。SCCA1抗体与电化学发光法试剂盒检测结果的相关性如下，其趋势方程为y＝1.1348x+0.0452，相关系数为0.9911。pro-GRP抗体与电化学发光法试剂盒检测结果的相关性如下，其趋势方程为y＝1.0338x+1.2336，相关系数为0.9933。CY21-1抗体与电化学发光法试剂盒检测结果的相关性如下，其趋势方程为y＝0.9793x+0.9794，相关系数为0.9802。

5)其他实验结果重复性：配制质控品重复检测10次，信号的重复性CV；结果显示本发明所述试剂盒对疾病样本检测的重复性分析，CV在10％，重复性良好。见下表。

实施例6

采用实施例5所述试剂盒对以下16种血清进行检测，得到的临床荧光信号值如下。

检测方法参考实施例3-5。

选取16个经医院确诊的临床血清，诊断结果具体如下。

检测得到的结果与临床标本高度吻合，说明本发明所述的同时检测多个肺癌标志物的试剂盒的检测效果很好，符合实际检测的需要。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。