鉴别CD44和CD24分子表型的方法

摘要

一种鉴别CD44和CD24分子表型的方法，包括特异性结合细胞表面CD44蛋白的第一抗体‑核酸偶联物、特异性结合细胞表面CD24蛋白的第二抗体‑核酸偶联物、DNA单链T链和DNA单链F链，T链与第一抗体‑核酸偶联物的核酸链互补结合，F链与第二抗体‑核酸偶联物的核酸链互补结合，共同构成程序化DNA回路，擦除CD44阳CD24阳表型细胞表面的信号标记，保留标记至细胞的信号探针。本发明的方法，实现了CD44和CD24分子表型的细胞的识别和有效区分，具有操作简便、结果准确、技术水平要求低和数据分析量小等特点。

说明书

技术领域

本发明涉及一种细胞按分子表型分离的方法，特别涉及一种对CD44和CD24分子表型进行鉴别的方法。

背景技术

2003年，A

乳腺癌干细胞具有典型的CD44

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种鉴别CD44和CD24分子表型的方法，用于相关细胞的鉴别，以获得目标细胞。

本发明的另一个目的在于提供一种鉴别CD44和CD24分子表型的方法，以电化学手段对相应表型的细胞进行鉴别，排除干扰细胞，利于科学研究的实施。

本发明的再一个目的在于提供一种鉴别CD44和CD24分子表型的方法，采用若干互补配对的核酸链形成程序化DNA回路，对相应表型的细胞进行鉴别，排除干扰细胞，简化鉴别过程，提高结果的准确性。

本发明的又一个目的在于提供一种鉴别CD44和CD24分子表型的方法，采用若干互补配对的核酸链形成程序化DNA回路，对相应表型的细胞进行鉴别，有效降低数据分析的工作量。

本发明所称的抗原是类似于在肌体中引起特异性(免疫)应答的物质。抗原进入机体后，可刺激肌体产生抗体和引起细胞免疫。在免疫测定中，抗原是指能与抗体结合的物质。抗原的反应性取决于抗原决定簇(antigenic determinant)，亦称表位(epitope)。一个抗原分子可带有不同的决定簇。此外，通过基因工程或化学连接的方式对表位进行拼接所取得分子形式，也包含与本发明所称抗原的范围内。

本发明所称的抗体，应当理解为具有识别抗原并与抗原结合的分子，尤其是聚合物，常见的抗体是能与抗原特异性结合的免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)。Ig分五类，即IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。与免疫测定有关的Ig主要为IgG和IgM。本发明中，抗体还包括具有识别抗原作用的分子，如：但不限于由Ig衍生而来的抗体Fab段、单链抗体、单域抗体和纳米抗体等也应属于此范畴。

本领域技术人员可以理解，抗原和抗体系免疫学上对两种分子的表述，本发明中应理解为是一对能够互相特异性结合的分子，具有识别性。

本发明的技术方案系使用能够特异性结合细胞表面CD44蛋白的抗体-核酸偶联物，实现CD44阳性细胞的信号标记，排除分子表型为CD44

本发明的技术方案采用的信号标记或信号标记物，其含义相同，均为能被肉眼或仪器所识别的物质，如：荧光标记、亲和标记、同位素标记和电化学标记等。

一种鉴别CD44和CD24分子表型的方法，采用的核酸组合物包括：

第一抗体-核酸偶联物，能够特异性结合细胞表面CD44蛋白；

第二抗体-核酸偶联物，能够特异性结合细胞表面CD24蛋白；

T链，系DNA单链；和

F链，系DNA单链；

T链与所述第一抗体-核酸偶联物的核酸链互补结合，F链与所述第二抗体-核酸偶联物的核酸链互补结合，共同构成程序化DNA回路，擦除CD44

一种第一抗体-核酸偶联物的具体实施方式，包括两条DNA单链A和A

另一种第一抗体-核酸偶联物的具体实施方式，第一抗体-核酸偶联物包括两条DNA单链A和A

另一种第一抗体-核酸偶联物的具体实施方式，第一抗体-核酸偶联物包括两条DNA单链A和A

另一种第一抗体-核酸偶联物的具体实施方式，其A链含有的核酸序列为：5'-TGCTCGCTATCTACTCG-3'。当其5'末端修饰TCO基团后，记为5'-(TCO)-TGCTCGCTATCTACTCG-3'。

另一种第一抗体-核酸偶联物的具体实施方式，其A

一种第二抗体-核酸偶联物的具体实施方式，包括两条DNA单链B和B

另一种第二抗体-核酸偶联物的具体实施方式，B链与B

另一种第二抗体-核酸偶联物的具体实施方式，其B链含有的核酸序列为：5'-TCACGCACCGCT-3'。当其3'末端修饰TCO基团后，记为5'-TCACGCACCGCT-(TCO)-3'。

另一种第二抗体-核酸偶联物的具体实施方式，其B

另一种T链的具体实施方式，含有的核酸序列为：5'-TCTCCTCACGCACCGCT-3'。

另一种F链的具体实施方式，含有的核酸序列为：5'-ACTGCTCGCTATCTACTCGCG-3'。

另一种DNA回路的具体实施方式，T链和B

另一种DNA回路的具体实施方式，T链与B

由于CD44

另一种DNA回路的具体实施方式，BB

本发明技术方案实现的有益效果：

本发明的鉴别CD44和CD24分子表型的方法，利用基于程序化DNA回路的信号擦除策略，擦除干扰细胞(CD44

本发明的鉴别CD44和CD24分子表型的方法，显著提高了CD44和CD24分子表型的细胞(如：乳腺癌干细胞)定性的准确性，还使得该种细胞的定量检测具有可行性，从而为深入地实施CD44和CD24分子表型的细胞的相关科学研究提供了工具。

本发明的鉴别CD44和CD24分子表型的方法，能从离体组织(如：病灶)中排除分子表型为CD44

附图说明

图1为鉴别CD44和CD24分子表型的乳腺癌干细胞的路线图；

图2A为乳腺癌干细胞的电化学响应图谱；

图2B为CD44

图2C为CD44

图2D为CD44

图3A为实施信号擦除前后乳腺癌干细胞的电化学响应图谱；

图3B为实施信号擦除前后分子表型为CD44

图4A为分析不同数量的乳腺癌干细胞时得到的电化学响应图谱；

图4B为电化学响应峰电流值随乳腺癌干细胞数量的变化图，以及乳腺癌干细胞在100个至5×10

图5为干扰细胞对乳腺癌干细胞电化学响应峰电流值变化的结果图；

图6为血清中不同数量的乳腺癌干细胞分型的电化学分析结果图。

具体实施方式

以下结合附图详细描述本发明的技术方案。本发明实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。

图1为鉴别CD44和CD24分子表型的乳腺癌干细胞的路线图。如图1所示，乳腺癌干细胞具有典型的CD44

(1)设计并制备能够特异性结合细胞表面CD44蛋白的抗体-核酸偶联物，实现乳腺癌干细胞和CD44

(2)设计并采用一种基于程序化DNA回路的信号擦除策略，擦除干扰细胞(CD44

①设计两条DNA单链B和B

②设计两条DNA单链T链和F链，它们与偶联至CD44抗体上的AA

③由于干扰细胞(CD44

(3)通过测定最终保留在细胞表面的电化学信号探针的电化学响应，实现对乳腺癌干细胞的分析。

实施例1基于CD44抗体-核酸偶联物的乳腺癌干细胞电化学信号标记

(a)取20μL浓度为50μM的DNA探针A和A

(b)取10μL步骤(a)中配置得到的AA

(c)取5μL浓度为1μM的CD44抗体与5μL浓度为5μM的Tetrazine-PEG5-NHS溶解在100μL磷酸盐缓冲液中，25℃反应2小时；随后，向溶液中进一步加入10μL步骤(b)中得到的连接有铜纳米颗粒的AA

(d)取100μL含乳腺癌干细胞或干扰细胞置于微量管内，然后向管中分别加入50μL步骤(c)中制备得到的anti-CD44@AA

(e)根据A

相关DNA探针序列如下：

A链：5'-(TCO)-TGCTCGCTATCTACTCG-3'；

A

如图2所示，乳腺癌干细胞和分子表型CD44

实施例2乳腺癌干细胞的电化学分析

(a)取20μL浓度为50μM的DNA探针A和A

(b)取10μL步骤(a)中配置得到的AA

(c)取5μL浓度为1μM的CD44抗体与5μL浓度为5μM的Tetrazine-PEG5-NHS溶解在100μL磷酸盐缓冲液中，25℃反应2小时；随后，向溶液中进一步加入10μL步骤(b)中得到的连接有铜纳米颗粒的AA

(d)取100μL含乳腺癌干细胞或CD44

(e)分别取5μL步骤(a)中配置得到的T链和F链溶液加入步骤(d)所得到的细胞重悬液中，混合后4℃反应2.5小时，通过基于程序化DNA回路的信号擦除策略，擦除CD44

(f)根据A

相关DNA探针序列如下：

A链：5'-(TCO)-TGCTCGCTATCTACTCG-3'；

A

B链：5'-TCACGCACCGCT-(TCO)-3'；

B

T链：5'-TCTCCTCACGCACCGCT-3'；

F链：5'-ACTGCTCGCTATCTACTCGCG-3'。

乳腺癌干细胞的分析容易受到CD44

图4A显示了分析不同数量的乳腺癌干细胞时得到的电化学响应图谱。如图所示，随着乳腺癌干细胞数量的增加，电化学响应信号也逐渐增强。这是合理的，因为存在越多的乳腺癌干细胞，就会引起越来越多电化学信号探针被标记至细胞表面，并在经历基于程序化DNA回路的背景擦除过程后，产生更强的电化学响应。图4B显示了电化学响应峰电流值随乳腺癌干细胞数量的变化情况，从图中可以看出，在0个细胞至5×10

实施例3干扰细胞共存条件下乳腺癌干细胞的电化学分析

为了考察本技术用于乳腺癌干细胞分析的特异性和抗干扰能力，我们分别将5×10

实施例4以血清为实际样本的乳腺癌干细胞的电化学分析

为了研究本发明建立的电化学实验技术用于实际样本中乳腺癌干细胞分析的可行性，我们将不同数量(5×10

序列表

<110> 章毅

中国干细胞集团上海生物科技有限公司

中国干细胞集团海南博鳌附属干细胞医院有限公司

重庆市干细胞技术有限公司

上海市干细胞技术有限公司

陕西省干细胞技术有限公司

苏州市干细胞技术有限公司

三亚市干细胞技术有限公司

<120> 鉴别CD44和CD24分子表型的方法

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tgctcgctat ctactcg 17

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

agcgtcgagt agatagcgag cagt 24

<210> 3

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tcacgcaccg ct 12

<210> 4

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

agcggtgcgt gaggagatcg ctatctactc gacgct 36

<210> 5

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tctcctcacg caccgct 17

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

actgctcgct atctactcgc g 21