一种缓解结肠炎的多酚-蛋白纳米颗粒的制备方法

摘要

本发明涉及食品生物技术领域，具体涉及一种缓解结肠炎的多酚‑蛋白纳米颗粒的制备方法。本发明提供了一种缓解结肠炎的多酚‑蛋白纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：(1)将蛋白溶解于缓冲液中，室温下搅拌至蛋白完全水化，得蛋白溶液，置于0‑5℃下保存备用；(2)将蛋白溶液过滤膜后进行热处理，然后冷却，得热处理过的蛋白溶液；(3)将多酚溶解于溶液中，避光保存；按顺序以0.5‑2h的间隔依次加入热处理过的蛋白溶液中，得复合物溶液；用高速分散器分散，并均质数次，即得。本发明提供的方法制备获得的多酚‑蛋白纳米乳液能保护多酚不受胃液、小肠液的消化影响，使多酚有效到达结肠处，发挥抗氧化、抗炎、缓解结肠炎症状。

说明书

技术领域

本发明涉及食品生物技术领域，具体涉及一种缓解结肠炎的多酚-蛋白纳米颗粒的制备方法。

背景技术

植物来源的多酚，如阿魏酸(亲水性)、槲皮素(疏水性)和香草酸(两亲性)、白藜芦醇等具有抗菌、消炎、抗氧化、清除自由基等，如薯莨鞣质具收敛性，能使创面的微血管收缩，有局部止血作用，内服可用于治疗胃肠道出血、溃疡和水泻等症。另外，薯莨鞣质能与蛋白质作用，凝固微生物体内的原生质，因此具有抑菌作用。但多酚对光、热、pH值等环境的变化非常敏感，稳定性差，易被氧化形成醌类物质失去活性，限制了其在食品工业中的广泛应用。

专利号201410034076.6的发明专利，一种多酚-大麦醇溶蛋白纳米颗粒及其制备方法，能显著提高多酚的包封率和载药率，该发明所述的纳米乳液，粒径为 50-400nm，而纳米颗粒是指50％以上的颗粒尺寸分布在1～100nm，而该发明中的纳米颗粒未明确纳米颗粒的占比，属于纳米、微米颗粒的混合物，所以是否能发挥纳米颗粒的作用并不明了。

本发明提供一种缓解结肠炎的多酚-蛋白纳米颗粒的制备方法，所述多酚-蛋白纳颗粒，是将多酚负载在蛋白上制备成纳米颗粒，可延缓多酚在肠道中消化，多酚到达结肠释放后，可以发挥抗氧化、缓解肠炎的作用，显著提高了其生物利用度。

发明内容

为了实现上述发明目的，本发明的第一个方面提供了一种缓解结肠炎的多酚 -蛋白纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：

(1)将蛋白溶解于缓冲液中，室温下搅拌至蛋白完全水化，得蛋白溶液，置于0-5℃下保存备用；

(2)将蛋白溶液过滤膜后进行热处理，然后冷却，得热处理过的蛋白溶液；

(3)将多酚溶解于溶液中，避光保存；按顺序以0.5-2h的间隔依次加入热处理过的蛋白溶液中，得复合物溶液；用高速分散器分散，并均质数次，即得。

作为本发明一种优选的技术方案，步骤(1)中，所述蛋白选自乳清蛋白、α- 乳白蛋白、β-乳球蛋白、血清白蛋白中的至少一种。

作为本发明一种优选的技术方案，步骤(1)中，所述缓冲液为磷酸钠缓冲液；所述磷酸钠缓冲液的浓度为30-70mmol/L，pH为5.5-7.5。

作为本发明一种优选的技术方案，所述蛋白溶解于缓冲液的条件为：转速为 300-800rpm/min连续搅拌100-180min，蛋白的浓度为10-20mg/mL。

作为本发明一种优选的技术方案，步骤(2)中，所述热处理为水浴加热，温度为60-80℃、时间为10-20min；所述冷却为冰水冷却5-20min。

作为本发明一种优选的技术方案，步骤(3)中，所述多酚包括亲水性多酚、疏水性多酚、两亲性多酚中的至少一种；所述多酚选自茶多酚、阿魏酸、槲皮素、香草酸、白藜芦醇、薯莨鞣质中的至少一种。

作为本发明一种优选的技术方案，步骤(3)中，所述多酚加样顺序为：亲水性多酚、疏水性多酚、两亲性多酚。

作为本发明一种优选的技术方案，步骤(3)中，所述分散条件为3000-8000 rpm下分散1-10min；所述均质压力为30-90MPa、均质次数为1-8次。

本发明第二个方面提供了一种根据所述缓解结肠炎的多酚-蛋白纳米颗粒的制备方法制备得到的多酚-蛋白纳米颗粒。

作为本发明一种优选的技术方案，所述多酚-蛋白纳米颗粒中多酚浓度为 0.01-0.2mg/mL。

有益效果

本发明提供了一种缓解结肠炎的多酚-蛋白纳米颗粒的制备方法，通过将多酚负载在蛋白上，制备成纳米颗粒，使多酚免受胃液、小肠液的消化，到达结肠释放后发挥抗氧化、抗炎等作用；其制备得到的多酚-蛋白纳米颗粒，粒径在100 nm内，纳米颗粒中多酚的浓度为0.01-0.2mg/mL，提高了多酚的负载率，使多酚能在结肠处释放更多后发挥作用。

具体实施方式

参选以下本发明的优选实施方法的详述以及包括的实施例可更容易地理解本发明的内容。除非另有限定，本文使用的所有技术以及科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同的含义。当存在矛盾时，以本说明书中的定义为准。

如本文所用术语“由…制备”与“包含”同义。本文中所用的术语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”或其任何其它变形，意在覆盖非排它性的包括。例如，包含所列要素的组合物、步骤、方法、制品或装置不必仅限于那些要素，而是可以包括未明确列出的其它要素或此种组合物、步骤、方法、制品或装置所固有的要素。

连接词“由…组成”排除任何未指出的要素、步骤或组分。如果用于权利要求中，此短语将使权利要求为封闭式，使其不包含除那些描述的材料以外的材料，但与其相关的常规杂质除外。当短语“由…组成”出现在权利要求主体的子句中而不是紧接在主题之后时，其仅限定在该子句中描述的要素；其它要素并不被排除在作为整体的所述权利要求之外。

当量、浓度、或者其它值或参数以范围、优选范围、或一系列上限优选值和下限优选值限定的范围表示时，这应当被理解为具体公开了由任何范围上限或优选值与任何范围下限或优选值的任一配对所形成的所有范围，而不论该范围是否单独公开了。例如，当公开了范围“1至5”时，所描述的范围应被解释为包括范围“1至4”、“1至3”、“1至2”、“1至2和4至5”、“1至3和5”等。当数值范围在本文中被描述时，除非另外说明，否则该范围意图包括其端值和在该范围内的所有整数和分数。

单数形式包括复数讨论对象，除非上下文中另外清楚地指明。“任选的”或者“任意一种”是指其后描述的事项或事件可以发生或不发生，而且该描述包括事件发生的情形和事件不发生的情形。

说明书和权利要求书中的近似用语用来修饰数量，表示本发明并不限定于该具体数量，还包括与该数量接近的可接受的而不会导致相关基本功能的改变的修正的部分。相应的，用“大约”、“约”等修饰一个数值，意为本发明不限于该精确数值。在某些例子中，近似用语可能对应于测量数值的仪器的精度。在本申请说明书和权利要求书中，范围限定可以组合和/或互换，如果没有另外说明这些范围包括其间所含有的所有子范围。

本发明第一个方面提供了一种缓解结肠炎的多酚-蛋白纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：

(1)将蛋白溶解于缓冲液中，室温下搅拌至蛋白完全水化，得蛋白溶液，置于0-5℃下保存备用；

(2)将蛋白溶液过滤膜后进行热处理，然后冷却，得热处理过的蛋白溶液；

(3)将多酚溶解于溶液中，避光保存；按顺序以0.5-2h的间隔依次加入热处理过的蛋白溶液中，得复合物溶液；用高速分散器分散，并均质数次，即得。

本发明中，所述步骤(1)具体为：将蛋白溶解于缓冲液中，室温下搅拌至蛋白完全水化，得蛋白溶液，置于0-5℃下保存备用；

本发明中，所述蛋白选自乳清蛋白、α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、血清白蛋白中的至少一种。

发明人认为，所述乳清蛋白由于其营养和功能特性，常被用来当作食品添加剂；β-乳球蛋白分子是一种高度结构化的球状蛋白质，含有9条β-折叠和1段较长的α-螺旋和4段较短的α-螺旋，其中8条反平行的β-折叠组成内包含花萼状疏水孔穴的β-桶型结构，内部含有很多隐藏的-OH、-SH和其他疏水基团，也就是说乳清蛋白具有多个配体结合位点，可同时结合不同的小分子配体，因此可以被用来作为一些疏水小分子的配体，提高多酚的生物利用度。

本发明中，所述缓冲液为磷酸钠缓冲液。

在一种优选的实施方式中，所述磷酸钠缓冲液为30-70mmol/L，pH为5.5-7.5。

在一种更优选的实施方式中，所述磷酸钠缓冲液为40-60mmol/L，pH为6-7.5。

在一种更更优选的实施方式中，所述磷酸钠缓冲液为45-55mmol/L，pH为 6-7。

本发明中，所述蛋白溶解于磷酸钠缓冲液的条件为：转速为300-800rpm/min 连续搅拌100-180min，蛋白的浓度为10-20mg/mL。

在一种优选的实施方式中，所述蛋白溶解磷酸钠缓冲液的条件为：转速为 400-750rpm/min连续搅拌110-160min。

在一种更优选的实施方式中，所述蛋白溶解磷酸钠缓冲液的条件为：转速为 500-700rpm/min连续搅拌115-150min。

本发明中，所述步骤(2)具体为：将蛋白溶液过滤膜后进行热处理，然后冷却，得热处理过的蛋白溶液；

本发明中，所述滤膜的孔径为0.05-0.5μm。

在一种优选的实施方式中，所述滤膜的孔径为0.2μm。

本发明采用过滤膜进行过滤去除蛋白质聚集物和杂质。

本发明中，所述热处理为水浴加热，温度为60-80℃、时间为10-20min；所述冷却为冰水冷却5-20min。

在一种优选的实施方式中，所述热处理的温度为65-75℃、时间为10-20min；所述冷却为冰水冷却8-15min。

本发明中的加热过程的作用是让蛋白在加热条件下打开紧密结构，迅速冷却，能使蛋白的尺度变小。

本发明中，所述步骤(3)具体为：将多酚溶解于溶液中，避光保存；按顺序以0.5-2h的间隔依次加入热处理过的蛋白溶液中，得复合物溶液；用高速分散器分散，并均质数次，即得。

本发明中，所述多酚包括亲水性多酚、疏水性多酚、两亲性多酚中的至少一种。

在一种优选的实施方式中，所述多酚选自茶多酚、阿魏酸、槲皮素、香草酸、白藜芦醇、薯莨鞣质中的至少一种。本发明对所述茶多酚、阿魏酸、槲皮素、香草酸、白藜芦醇、薯莨鞣质的来源没有特殊限定，采用本领域常规的市售商品即可。

在一种更优选的实施方式中，所述多酚加样顺序为：亲水性多酚、疏水性多酚、两亲性多酚。

本发明中，所述溶液，没有特别的限制，可根据多酚的亲水性分别将其溶解在磷酸钠缓冲溶液、无水乙醇或70％乙醇中。

本发明中，所述分散条件为3000-8000rpm下分散1-10min。

在一种优选的实施方式中，所述分散条件为4000-7000rpm下分散1-8min。

在一种更优选的实施方式中，所述分散条件为4500-6500rpm下分散1-7min。

本发明中，所述均质压力为30-90MPa、均质次数为1-8次。

在一种优选的实施方式中，所述均质压力为40-80MPa、均质次数为1-7次。

在一种更优选的实施方式中，所述均质压力为50-75MPa、均质次数为1-5 次。

本发明中分散和均质的作用能让制备的多酚-蛋白纳米颗粒分布更均匀，粒径更小。

本发明第二个方面提供了一种根据所述缓解结肠炎的多酚-蛋白纳米颗粒的制备方法制备得到的多酚-蛋白纳米颗粒。

作为本发明一种优选的技术方案，所述多酚-蛋白纳米颗粒中多酚浓度为 0.01-0.2mg/mL。

本发明还提供了所述制备方法制备获得的多酚-蛋白纳米颗粒。所述多酚-蛋白纳米颗粒的溶解度优选为0.01-0.2mg/mL。本发明中所述多酚-蛋白纳米颗粒的溶解度相对于多酚而言，有了明显的提高，同时所述多酚-蛋白纳米颗粒具有良好的抗氧化、抗炎作用，可以应用于缓解结肠炎的食品或药物的制备中。

下面通过实施例对本发明进行具体描述。有必要在此指出的是，以下实施例只用于对本发明作进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的专业技术人员根据上述本发明的内容做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

另外，如果没有其它说明，所用原料都是市售的。

实施例

实施例1提供了一种缓解结肠炎的多酚(槲皮素)-β-乳球蛋白纳米颗粒的制备方法，由包括以下步骤的制备方法制备得到：

(1)取蛋白溶解在磷酸钠缓冲液(40mmol/L，pH为6)，加叠氮化钠用作防腐剂以避免微生物生长。在室温下300rpm/min连续搅拌100min，确保蛋白质完全水化，将蛋白溶液在4℃下保存过夜，通过0.2μm的滤膜过滤样品，去除蛋白质聚集物和杂质。将蛋白溶液放入具塞玻璃管中，水浴加热60℃下加热 12min，取出后冰水冷却10min，获得的蛋白溶液浓度为在10mg/mL；

(2)根据多酚的亲水性分别将其溶解在磷酸钠缓冲溶液、无水乙醇或70％乙醇中，避光保存。按照亲水性多酚、疏水性多酚、两亲性多酚的顺序以1h的间隔依次加入到热处理过的蛋白溶液中；

(3)将获得的复合物溶液用高速分散器5000rpm下分散2min分散，并在 40MPa下均质5次，得到多酚-蛋白纳米颗粒中多酚浓度为0.10mg/mL。

实施例2提供了一种缓解结肠炎的多酚(阿魏酸、槲皮素)-β-乳球蛋白纳米颗粒的制备方法，由包括以下步骤的制备方法制备得到：

(1)取蛋白溶解在磷酸钠缓冲液(40mmol/L，pH为6.5)，加叠氮化钠用作防腐剂以避免微生物生长。在室温下300rpm/min连续搅拌110min，确保蛋白质完全水化，将蛋白溶液在4℃下保存过夜，通过0.2μm的滤膜过滤样品，去除蛋白质聚集物和杂质。将蛋白溶液放入具塞玻璃管中，水浴加热60℃下加热 10min，取出后冰水冷却10min，获得的蛋白溶液浓度为在10mg/mL；

(2)根据多酚的亲水性分别将其溶解在磷酸钠缓冲溶液、无水乙醇或70％乙醇中，避光保存。按照亲水性多酚、疏水性多酚、两亲性多酚的顺序以1h的间隔依次加入到热处理过的蛋白溶液中；

(3)将获得的复合物溶液用高速分散器4000rpm下分散2min分散，并在 40MPa下均质5次，得到多酚-蛋白纳米颗粒中多酚浓度为0.10mg/mL。

实施例3提供了一种缓解结肠炎的多酚(槲皮素、香草酸)-α-乳球蛋白纳米颗粒的制备方法，由包括以下步骤的制备方法制备得到：

(1)取蛋白溶解在磷酸钠缓冲液(45mmol/L，pH为6)，加叠氮化钠用作防腐剂以避免微生物生长。在室温下400rpm/min连续搅拌110min，确保蛋白质完全水化，将蛋白溶液在4℃下保存过夜，通过0.2μm的滤膜过滤样品，去除蛋白质聚集物和杂质。将蛋白溶液放入具塞玻璃管中，水浴加热65℃下加热 10min，取出后冰水冷却8min，获得的蛋白溶液浓度为在12mg/mL；

(2)根据多酚的亲水性分别将其溶解在磷酸钠缓冲溶液、无水乙醇或70％乙醇中，避光保存。按照疏水性多酚、两亲性多酚、亲水性多酚的顺序以1h的间隔依次加入到热处理过的蛋白溶液中；

(3)将获得的复合物溶液用高速分散器4500rpm下分散3min分散，并在 50MPa下均质3次，得到多酚-蛋白纳米颗粒中多酚浓度为0.12mg/mL。

实施例4提供了一种缓解结肠炎的多酚(槲皮素、香草酸、阿魏酸)-α-乳球蛋白纳米颗粒的制备方法，由包括以下步骤的制备方法制备得到：

(1)取蛋白溶解在磷酸钠缓冲液(45mmol/L，pH为6)，加叠氮化钠用作防腐剂以避免微生物生长。在室温下400rpm/min连续搅拌110min，确保蛋白质完全水化，将蛋白溶液在4℃下保存过夜，通过0.2μm的滤膜过滤样品，去除蛋白质聚集物和杂质。将蛋白溶液放入具塞玻璃管中，水浴加热65℃下加热 10min，取出后冰水冷却8min，获得的蛋白溶液浓度为在12mg/mL；

(2)根据多酚的亲水性分别将其溶解在磷酸钠缓冲溶液、无水乙醇或70％乙醇中，避光保存。按照疏水性多酚、两亲性多酚、亲水性多酚的顺序以1h的间隔依次加入到热处理过的蛋白溶液中；

(3)将获得的复合物溶液用高速分散器4500rpm下分散3min分散，并在 60MPa下均质2次，得到多酚-蛋白纳米颗粒中多酚浓度为0.12mg/mL。

性能测试

1.通过动态多分散粒径仪检测纳米颗粒粒径、多分散指数(PDI)和ζ电位。取样品15μL稀释100倍后分别加入石英比色皿(径长10mm)和电极比色皿中，检测角度为13°，检测结果见表1：

表1.实施例粒径、PDI和ζ电位的测试结果

2.包封率和负载量：将复合物纳米颗粒置于超滤离心管中，在14000rpm，4℃下离心15min；取上清液，利用超高效液相色谱测定三种多酚单体的含量；通过以下公式计算其负载率(LE)和负载量(LC)；

阿魏酸的色谱条件为：色谱柱：Waters BEH C18(2.1×50mm，1.7μm)；流动相：0.2％甲醇乙腈-0.1％甲酸水(30：70，V/V)；检测波长：324nm；流速 0.3mL/min；进样量5μL；

槲皮素的色谱条件为：色谱柱：Waters BEH C18(2.1×50mm，1.7μm)；流动相：乙腈-0.1％甲酸水(45：55，V/V)；检测波长：360nm；流速0.3mL/min；进样量5μL。

香草酸的色谱条件为：色谱柱：Waters BEH C18(2.1×50mm，1.7μm)；流动相：乙腈-0.1％磷酸水(20：80，V/V)；检测波长：254nm；流速0.3mL/min；进样量5μL。

测试结果见表2。

表2.实施例包封率和负载量的测试结果

3.多酚-蛋白纳米颗粒对大鼠结肠炎的缓解作用(实施例4)

选SD大鼠作为实验对象，随机分为3组，即空白对照组、结肠炎组、结肠炎+多酚-蛋白纳米乳液组。

空白对照组：使用常规饲料饲养56天(8周)，每天用蒸馏水按照1mL/只的剂量灌胃；同时在第28-30天(第5周的第1天-3天)用蒸馏水灌肠2mL/只/ 天，连续3天；

结肠炎组：使用常规饲料饲养56天(8周)，每天用蒸馏水按照1mL/只/的剂量灌胃，同时在第28-30天(第5周的第1天-3天)用2mL 4％乙酸对大鼠进行灌肠，连续3天，构建大鼠结肠炎模型；

结肠炎+多酚-蛋白纳米乳液组：使用常规饲料饲养56天(8周)，每天用多酚蛋白纳米颗粒按照1mL/只/的剂量灌，同时在第28-30天(第5周的第1天-3 天)用2mL 4％乙酸对大鼠进行灌肠，连续3天，构建大鼠结肠炎模型；

实验结束后，将实验大鼠麻醉处死；

(1)取血清测定炎症因子，如白细胞介素1-β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α (TNF-α)和内毒素的含量，以上均使用试剂盒进行测定，结果见表3；

(2)取结肠组织制备成组织悬液，测定结肠组织中的谷胱甘肽过氧化物酶 (GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、髓过氧化物酶(MPO)，以上指标均匀试剂盒测定，结果见表4；

(3)将大鼠结肠样本用10％甲醛固定，石蜡包埋，切片并进行苏木精和伊红(HE)染色，结果见表5。

表3.多酚蛋白纳米颗粒对血清炎症因子的影响

表4.多酚蛋白纳米颗粒对结肠组织的抗氧化作用

表5.多酚蛋白纳米颗粒对结肠组织的抗氧化作用

由表5可知，大鼠经乙酸造模后，结肠出现不同程度的溃疡、黏膜增厚、绒毛缺失、淋巴结肿大、黏膜水肿、杯状细胞、隐窝缺失、隐窝肿胀破坏，肠黏膜和黏膜下层出现不同程度的炎症细胞浸润等，多酚-蛋白纳米颗粒组大鼠结肠组织(黏膜、绒毛等)的完整性明显高于空白对照组和肠炎组。

前述的实例仅是说明性的，用于解释本发明所述方法的一些特征。所附的权利要求旨在要求可以设想的尽可能广的范围，且本文所呈现的实施例仅是根据所有可能的实施例的组合的选择的实施方式的说明。因此，申请人的用意是所附的权利要求不被说明本发明的特征的示例的选择限制。在权利要求中所用的一些数值范围也包括了在其之内的子范围，这些范围中的变化也应在可能的情况下解释为被所附的权利要求覆盖。