基于汞离子增敏锇纳米粒子氧化酶活性的肝素酶检测方法

摘要

本发明公开一种基于汞离子增敏锇纳米粒子氧化酶活性的肝素酶检测方法。肝素修饰锇纳米粒子加入汞离子之后，肝素修饰锇纳米粒子的氧化酶活性被增敏和激活，能够催化氧化3,3’,5,5’‑四甲基联苯胺盐酸盐生成蓝色物质。而肝素酶能够降解肝素，加入肝素酶，汞离子增敏肝素‑锇纳米粒子催化氧化3,3’,5,5’‑四甲基联苯胺盐酸盐的蓝色物质由深蓝变为浅蓝，紫外600 nm处的吸收值降低，建立显色体系实现对肝素酶的检测。该方法所得在肝素酶检测的线性范围为20‑1000µg/L，检测限为15µg/L。该检测方法可以实现血清样品中肝素酶的便捷分析，具有操作简便、检测时间短、灵敏度高、特异性强等优点，易于推广使用。

说明书

技术领域

本发明开发基于汞离子增敏锇纳米粒子氧化酶活性的肝素酶检测方法，属于分析化学和纳米技术领域。

背景技术

肝素酶是由肝素黄杆菌产生的一种肝素降解酶，在外科手术和其他应用中，肝素酶可特异性地裂解肝素聚合物中存在的葡萄糖胺（1-4）醛酸糖苷键，从而使血液去肝素化。肝素酶降解肝素的作用促进了肝素的结构分析和污染检测，并具有生产低分子量肝素的巨大潜力，生产途径更加绿色高效。此外，肝素酶影响多种生物学过程，包括形态形成、炎症、血管生成，肿瘤侵袭和转移。然而，目前肝素酶的检测方法较少，且存在如特异性和选择性差，试剂不稳定，成本高和标准化困难等缺点，因此，建立新型高选择性，低成本和方便快捷的肝素酶检测技术具有重要的意义。

纳米酶的发现，推动了纳米科技的基础研究也拓展了纳米材料的应用。纳米酶是一种具有酶类特征的纳米材料。相比天然酶，纳米酶具有成本低，稳定性高，经久耐用等优点，因其独特优势广泛应用于生物医学传感、疾病诊断、治疗，环境监测等领域。

基于上述背景，本发明利用肝素修饰锇纳米粒子氧化酶活性构建肝素酶检测方法。本发明发现肝素修饰锇纳米粒子的氧化酶活性相对较低，但加入汞离子之后，肝素修饰锇纳米粒子的氧化酶活性被增敏和激活，具有广泛的催化活性，能够催化氧化3, 3’, 5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐生成蓝色物质。而肝素酶能够降解肝素，汞离子增敏后催化氧化3,3’, 5, 5’-四甲基联苯胺盐酸盐的蓝色物质由深蓝变为浅蓝，紫外600 nm处的吸收值降低，基于上述现象，可建立显色体系实现对肝素酶的检测。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于汞离子增敏锇纳米粒子氧化酶活性的肝素酶检测方法。肝素修饰锇纳米粒子的氧化酶活性相对较低，但加入汞离子之后，肝素修饰锇纳米粒子的氧化酶活性被增敏和激活，具有广泛的催化活性，能够催化氧化3, 3’, 5, 5’-四甲基联苯胺盐酸盐生成蓝色物质。而肝素酶能够降解肝素，加入肝素酶，汞离子增敏肝素-锇纳米粒子催化氧化3, 3’, 5, 5’-四甲基联苯胺盐酸盐的蓝色物质由深蓝变为浅蓝，紫外600nm处的吸收值降低，建立显色体系实现对肝素酶的检测。

为了实现上述检测方法的目的，本发明采用以下技术方案：

一种基于汞离子增敏锇纳米粒子氧化酶活性的肝素酶检测方法，其特征是肝素修饰锇纳米粒子加入汞离子之后，肝素修饰锇纳米粒子的氧化酶活性被增敏和激活，具有广泛的催化活性，能够催化氧化3, 3’, 5, 5’-四甲基联苯胺盐酸盐生成蓝色物质，而肝素酶能够降解肝素，加入肝素酶，汞离子增敏肝素-锇纳米粒子催化氧化3, 3’, 5, 5’-四甲基联苯胺盐酸盐的蓝色物质由深蓝变为浅蓝，紫外600 nm处的吸收值降低，建立显色体系实现对肝素酶的检测。

所述的基于汞离子增敏锇纳米粒子氧化酶活性的肝素酶检测方法，其特征是能根据紫外吸收光谱的最大吸收波长600 nm处的吸收值以判断肝素酶的浓度。

所使用的肝素修饰锇纳米粒子由下述方法制备的：将0.1 g的肝素与1 mL浓度为10 mM的六氯锇酸钾混合，再加入48 mL双蒸水，避光条件下搅拌30分钟，随后加入1 mL浓度为0.2 M的硼氢化钠，继续搅拌90分钟，溶液颜色由浅绿色变为浅棕色，制得50 mL浓度为38mg/L的肝素修饰锇纳米粒子。

所述的基于汞离子增敏锇纳米粒子氧化酶活性的肝素酶检测方法，其特征是汞离子能通过如下方式增敏锇纳米粒子的氧化酶活性：在0.4 mL，50 µM汞离子中加入0.1 mL浓度为38 mg/L的肝素修饰锇纳米粒子，继而在混合溶液中再加入3300 µL pH=6，20 mM的磷酸盐缓冲溶液和200 µL浓度为2 mM的3, 3’, 5, 5’-四甲基联苯胺盐酸盐，于25 ℃水浴中反应5 min后，用紫外-可见分光光度仪测定最大吸收波长600 nm处的吸光值。

所述的基于汞离子增敏锇纳米粒子氧化酶活性的肝素酶检测方法，其特征是100µL浓度为38 mg/L的肝素修饰锇纳米粒子与200 µL不同浓度的肝素酶在25 ℃下混合15分钟后加入0.4 mL，50 µM汞离子，在混合溶液中陆续加入3300 µL pH=6，20 mM的磷酸盐缓冲溶液和200 µL浓度为2 mM的3, 3’, 5, 5’-四甲基联苯胺盐酸盐，于25 ℃水浴中反应5min后，用紫外-可见分光光度仪测定最大吸收波长600 nm处的吸光值；随着肝素酶的含量在2-1000 µg/L范围内增加，显色体系在最大吸收波长600 nm处的吸收值降低，记录波长600 nm处的吸光值，根据A

所述的基于汞离子增敏锇纳米粒子氧化酶活性的肝素酶检测方法，其特征是汞离子加入的浓度为50 µM及肝素酶与肝素修饰锇纳米粒子的混合时间为15分钟。

本发明所述的一种基于汞离子增敏锇纳米粒子氧化酶活性的血清中肝素酶检测方法，其特征是包括如下步骤：100 µL浓度为38 mg/L的肝素修饰锇纳米粒子与200 µL血清样品在25 ℃下混合15分钟后加入0.4 mL，50 µM汞离子，在混合溶液中陆续加入3300 µLpH=6，20 mM的磷酸盐缓冲溶液和200 µL浓度为2 mM的3, 3’, 5, 5’-四甲基联苯胺盐酸盐，于25 ℃水浴中反应5 min后，用紫外-可见分光光度仪测定最大吸收波长600 nm处的吸光值，根据显色体系溶液颜色初步判断或通过根据A

具体地说，本发明采用的技术方案为：

（一）肝素-锇纳米粒子的制备：

首先，0.1 g的肝素与1 mL浓度为10 mM的六氯锇酸钾混合，再加入48 mL双蒸水，避光条件下搅拌30分钟，随后加入1 mL浓度为0.2 M的硼氢化钠，继续搅拌90分钟，溶液颜色由浅绿色变为浅棕色，制得50 mL的肝素修饰锇纳米粒子（浓度为38 mg/L）。所得的肝素修饰锇纳米粒子于4℃保存。（过程中使用的所有玻璃器皿均经过王水浸泡，并用双蒸水彻底清洗，晾干）。

（二）汞离子增敏锇纳米粒子的氧化酶活性：

在0.4 mL，50 µM汞离子中加入0.1 mL技术方案（一）制备后的肝素修饰锇纳米粒子（浓度为38 mg/L）。继而在混合溶液中再加入3300 µL的磷酸盐缓冲溶液（pH=6，20 mM）和200 µL的3, 3’, 5, 5’-四甲基联苯胺盐酸盐（2 mM），于25 ℃水浴中反应5 min后，用紫外-可见分光光度仪测定最大吸收波长600 nm处的吸光值。

（三）肝素酶的检测：

100 µL的肝素修饰锇纳米粒子（浓度为38 mg/L）与200 µL不同浓度的肝素酶在25 ℃下混合15 min后加入0.4 mL，50 µM汞离子，在混合溶液中陆续加入3300 µL的磷酸盐缓冲溶液（pH=6，20 mM）和200 µL的3, 3’, 5, 5’-四甲基联苯胺盐酸盐（2 mM），于25 ℃水浴中反应5 min后，用紫外-可见分光光度仪测定最大吸收波长600 nm处的吸光值。

本发明的优点：

（1）本发明主要是利用肝素酶能够降解肝素，加入肝素酶，汞离子增敏肝素-锇纳米粒子催化氧化3, 3’, 5, 5’-四甲基联苯胺盐酸盐的蓝色物质由深蓝变为浅蓝，紫外600 nm处的吸收值降低，建立显色体系实现对肝素酶的检测。从而表现出溶液颜色和紫外吸收光谱特征的变化，可以用于肝素酶的含量检测。检测工作可在20分钟完成并得到检测结果。

（2）本发明所使用的肝素修饰锇纳米粒子由肝素作为稳定剂修饰在表面，硼氢化钠还原六氯锇酸钾得到，其制备过程简单快速、材料稳定存放时间久。

（3）本发明每次检测所需肝素修饰锇纳米粒子用量较少，显色底物（3, 3’, 5,5’-四甲基联苯胺盐酸盐）及汞离子常见易得所需用量较少，检测成本低。

（4）本发明检测肝素酶的检测线性范围为20–1000 μg/L，检测的灵敏度高，检测限为15 μg/L。

综合上述，本发明提供的肝素酶检测方法，检测过程简便，稳定性好，具有操作简便、检测时间短、灵敏度高、特异性强等优点，易于推广使用。

附图说明

图1为基于汞离子增敏锇纳米粒子氧化酶活性的肝素酶检测方法示意图。

图2为汞离子浓度对肝素酶检测方法的影响。

图3为肝素酶与材料反应时间对肝素酶检测方法的影响。

图4为不同浓度的肝素酶存在时显色体系的紫外吸收光谱图。右为不同浓度肝素酶存在时显色体系的颜色照片图，具体颜色变化：随着肝素酶浓度的增大，溶液颜色逐渐变浅。

图5为肝素酶的标准曲线图。

图6为不同物质对显色体系的干扰；牛血清白蛋白（BSA）、丙氨酸（Ala）、甘氨酸（Gly）、缬氨酸（Val），葡萄糖（Glucose）浓度为5000 µg/L，肝素酶（Heparinase）、超氧化物歧化酶（SOD），葡萄糖氧化酶（GOD）浓度为500 µg/L。

具体实施方式

实施例1：

0.1 g的肝素与1 mL浓度为10 mM的六氯锇酸钾混合，再加入48 mL双蒸水，避光条件下搅拌30分钟，随后加入1 mL浓度为0.2 M的硼氢化钠，继续搅拌90分钟，溶液颜色由浅绿色变为浅棕色，制得50 mL的肝素修饰锇纳米粒子（浓度为38 mg/L）。所得的肝素修饰锇纳米粒子于4℃保存。（过程中使用的所有玻璃器皿均经过王水浸泡，并用双蒸水彻底清洗，晾干）。

实施例2：

将100 µL的实施例1制得的肝素修饰锇纳米粒子（浓度为38 mg/L）与200 µL不同浓度的肝素酶在25 ℃下混合15 min后加入0.4 mL，50 µM汞离子，在混合溶液中陆续加入3300µL的磷酸盐缓冲溶液（pH=6，20 mM）和200 µL的3, 3’, 5, 5’-四甲基联苯胺盐酸盐（2mM），于25 ℃水浴中反应5 min后，用紫外-可见分光光度仪测定最大吸收波长600 nm处的吸光值。如图1所示为肝素酶检测的示意图，肝素酶能够降解肝素，加入肝素酶，汞离子增敏肝素-锇纳米粒子催化氧化3, 3’, 5, 5’-四甲基联苯胺盐酸盐的蓝色物质由深蓝变为浅蓝，紫外600 nm处的吸收值降低，建立显色体系实现对肝素酶的检测。

实施例3：

在0.4 mL，不同浓度汞离子样品溶液中加入0.1 mL实施例1制备后的肝素修饰锇纳米粒子（浓度为38 mg/L）。继而在混合溶液中再加入3300 µL的磷酸盐缓冲溶液（pH=6，20 mM）和200 µL的3, 3’, 5, 5’-四甲基联苯胺盐酸盐（2 mM），于25 ℃水浴中反应5 min后，用紫外-可见分光光度仪测定最大吸收波长600 nm处的吸光值。如图2所示，为更好地实现肝素酶检测，优化了该体系中的汞离子浓度，当加入的汞离子浓度达到50 µM后，汞离子增敏肝素-锇纳米粒子催化氧化3, 3’, 5, 5’-四甲基联苯胺盐酸盐在紫外600 nm处的吸收值达到平台，优化后该体系中的汞离子浓度选择为50 µM。

实施例4：

100 µL实施例1制得的肝素修饰锇纳米粒子（浓度为38 mg/L）与200 µL不同浓度的肝素酶在25 ℃下混合不同的时间后加入0.4 mL，50 µM汞离子，在混合溶液中陆续加入3300µL的磷酸盐缓冲溶液（pH=6，20 mM）和200 µL的3, 3’, 5, 5’-四甲基联苯胺盐酸盐（2mM），于25 ℃水浴中反应5 min后，用紫外-可见分光光度仪测定最大吸收波长600 nm处的吸光值。如图3所示，为更好地实现肝素酶检测，优化了该体系中的肝素修饰锇纳米粒子与肝素酶的混合时间，优化后时间为15分钟。

实施例5：

100 µL实施例1制得的肝素修饰锇纳米粒子（浓度为38 mg/L）与200 µL不同浓度的肝素酶在25 ℃下混合15分钟后加入0.4 mL，50 µM汞离子，在混合溶液中陆续加入3300 µL的磷酸盐缓冲溶液（pH=6，20 mM）和200 µL的3, 3’, 5, 5’-四甲基联苯胺盐酸盐（2 mM），于25 ℃水浴中反应5 min后，用紫外-可见分光光度仪测定最大吸收波长600 nm处的吸光值。如图4所示为用紫外-可见分光光度仪测定的该体系对于不同浓度（0-1500 µg/L）汞离子的响应光谱图，右图的照片可以发现当不含肝素酶时，溶液深蓝色，随着肝素酶浓度的增大，体系溶液颜色逐渐变浅。

实施例6：

100 µL实施例1制得的肝素修饰锇纳米粒子（浓度为38 mg/L）与200 µL不同浓度的肝素酶在25 ℃下混合15分钟后加入0.4 mL，50 µM汞离子，在混合溶液中陆续加入3300 µL的磷酸盐缓冲溶液（pH=6，20 mM）和200 µL的3, 3’, 5, 5’-四甲基联苯胺盐酸盐（2 mM），于25 ℃水浴中反应5 min后，用紫外-可见分光光度仪测定最大吸收波长600 nm处的吸光值。如图5所示，随着肝素酶的含量增加（2-1000 µg/L），显色体系在最大吸收波长600 nm处的吸收值降低，记录波长600 nm处的吸光值，根据A

实施例7：

100 µL实施例1制得的肝素修饰锇纳米粒子（浓度为38 mg/L）与200 µL不同物质在25℃下混合15分钟后加入0.4 mL，50 µM汞离子，在混合溶液中陆续加入3300 µL的磷酸盐缓冲溶液（pH=6，20 mM）和200 µL的3, 3’, 5, 5’-四甲基联苯胺盐酸盐（2 mM），于25 ℃水浴中反应5 min后，用紫外-可见分光光度仪测定最大吸收波长600 nm处的吸光值。如图6所示，为实现更好的肝素酶检测，验证体系的专一性，对比了多种物质对上述体系的响应，其中牛血清白蛋白（BSA）、丙氨酸（Ala）、甘氨酸（Gly）、缬氨酸（Val），葡萄糖（Glucose）浓度为5000 µg/L，肝素酶（Heparinase）、超氧化物歧化酶（SOD），葡萄糖氧化酶（GOD）浓度为500 µg/L。图6所示该方法对肝素酶有较好的选择性。

实施例8：

100 µL的肝素修饰锇纳米粒子（浓度为38 mg/L）与200 µL含有不同浓度肝素酶的血清样品在25 ℃下混合15分钟后加入0.4 mL，50 µM汞离子，在混合溶液中陆续加入3300 µL的磷酸盐缓冲溶液（pH=6，20 mM）和200 µL的3, 3’, 5, 5’-四甲基联苯胺盐酸盐（2 mM），于25 ℃水浴中反应5 min后，用紫外-可见分光光度仪测定最大吸收波长600 nm处的吸光值。结合实施例6的标准曲线计算肝素酶的含量，肝素酶在血清中的加标回收率在95.49~106.16 %，相对标准偏差为0.81~4.32 %，见表1。

表 1血清样品中肝素酶的加标回收率实验