氨基酸同位素标记物的定量分析方法

摘要

本发明属于氨基酸分析方法技术领域，具体公开了一种氨基酸同位素标记物的定量分析方法，包括以下步骤：包括以下步骤：S1、配制13C培养基和12C培养基；S2、分别采用S1得到的13C培养基和S1得到的12C培养基培养细胞；S3、细胞收集：弃去12C培养基和13C培养基，得到13C细胞和12C细胞进行衍生化前准备，得到13C样本和12C样本；S4、MCF衍生化；S5、采用GC‑MS对衍生化溶液进行分析；S6、数据挖掘获得氨基酸的碎片的荷质比、保留时间、13C可取代氨基酸的位置及个数。本发明通过实验得到衍生化代谢物可能的特征离子荷质比，进一步扩展了GC‑MS的SIAM的数据库，用于基于GC‑MS的13C同位素标记物的定位和定量分析，能够直观观测在不同环境或疾病的条件下细胞的代谢的变化情况，准确反映细胞代谢与环境或疾病之间的关系具有重要意义。

说明书

技术领域

本发明属于氨基酸分析方法技术领域，尤其涉及一种氨基酸同位素标记物的定量分析方法。

背景技术

氨基酸是蛋白质的基本组成单位，含有氨基官能团和羧基官能团，参与了人体多条代谢通路，所以针对氨基酸的分析技术对蛋白质化学、生物化学，乃至整个生命科学的研究都具有重要意义。

稳定同位素辅助代谢组学(简称SIAM)利用稳定同位素示踪剂标记的化合物(被标记化合物)研究物质转化或变化规律，具体原理为：由于被标记化合物与其相应的非标记化合物(被追踪物质)具有相同的化学和生物学性质，在生物机体内所发生的化学变化和生物过程也完全相同，所以将二者混合后，通过同位素丰度或比值的变化测出同种非标记化合物含量。

对于氨基酸来讲，稳定同位素标记的氨基酸是普通氨基酸中的一种或几种元素被稳定同位素(如

用于SIAM的技术平台主要是液相色谱-质谱技术(简称LC-MS)，但是LC-MS存在以下问题：(1)共洗脱基质成分会引起离子抑制(基质是指样品中被分析物以外的组分，共洗脱基质是指与目标物共同出峰的基质成分)，从而降低被追踪物质的生成效率和离子强度，导致检测信号变弱，检测结果产生偏差；(2)基质会受微生物种类和前处理过程的影响，稀释样品法可以消除基质效应，但可能降低对低丰度代谢物的敏感性，具体原因在于：稀释是最简单的样品预处理技术，样品只需要用LC-MS兼容的溶剂稀释即可，但是样品中所有组分都会进入LC-MS系统，从而降低对低丰度代谢物的敏感性，所以稀释样品法只适用于基质效应不大且不存在灵敏度问题的情形。

GC-MS较少用于SIAM，而且只能分析挥发性化合物，对非挥发性化合物需要首先进行氨基酸衍生化，降低氨基酸的沸点。常用的氨基酸衍生化方法是氯甲酸甲酯(MCF)衍生化和氯甲酸乙酯(ECF)衍生化。

由于氨基酸R基不同，氨基酸的化学性质存在较大差异，比如按照等电点pH可以将氨基酸分为酸性氨基酸、碱性氨基酸和中性氨基酸，所以采用气相色谱-质谱技术(简称GC-MS)测定氨基酸存在一定的困难，目前基于GC-MS而建立的氨基酸数据库还不够完善，对揭开生物体或细胞内代谢的理化过程，了解生物体的新陈代谢规律存在较大的局限性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种氨基酸同位素标记物的定量分析方法，以解决基于GC-MS而建立的氨基酸数据库还不够完善，对揭开生物体或细胞内代谢的理化过程，了解生物体的新陈代谢规律存在较大的局限性的技术问题。

为了达到上述目的，本发明的技术方案如下：

氨基酸同位素标记物的定量分析方法，包括以下步骤：

S1、配制

S2、分别采用S1得到的

S3、细胞收集：弃去

S4、MCF衍生化；

S5、采用GC-MS对衍生化溶液进行分析，氦气流的流速为0.5-1.5mL/min；进样口温度为270-300℃；柱升温程序如下：GC烤箱设置为42-48℃，维持1-2min后，以5-9℃/min速率升到170-185℃，维持4-8min后，以35-45℃/min速率升到210-230℃，维持4-8min后，以30-50℃/min速率升到240-250℃，维持10-15min后，以30-50℃/min速率升到260-290℃，维持1-4min；质谱离子原的温度为140-160℃；质谱四级杆温度为225-235℃；连接杆温度为245-255℃；

S6、数据挖掘获得氨基酸的碎片的荷质比、保留时间、

本技术方案的原理和有益效果在于：

(1)本技术方案首先对氨基酸进行衍生化，然后通过严格控制柱升温程序、氦气流的流速和进样口温度，使各个氨基酸的峰充分分开，得到衍生化代谢物的特征离子荷质比，进一步扩展了GC-MS的SIAM的数据库，有助于进一步直观观测细胞的代谢的变化情况，进一步准确反映细胞代谢改变，对于揭开生物体或细胞内代谢的理化过程，了解生物体的新陈代谢规律具有重要意义。

(2)本技术方案通过计算

(3)本技术方案的精密度高，RSD＜10％。

附图说明

图1为本发明实施例1中的衍生化原理图；

图2为本发明实施例1中丙氨酸的质谱图；

图3为本发明实施例1中甘氨酸的质谱图；

图4为本发明实施例1中缬氨酸的质谱图；

图5为本发明实施例1中亮氨酸的质谱图；

图6为本发明实施例1中异亮氨酸的质谱图；

图7为本发明实施例1中脯氨酸的质谱图；

图8为本发明实施例1中苏氨酸的质谱图；

图9为本发明实施例1中天冬氨酸的质谱图；

图10为本发明实施例1中谷氨酰胺的质谱图；

图11为本发明实施例1中组氨酸的质谱图；

图12为本发明实施例1中酪氨酸的质谱图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

本实施例提供了一种氨基酸同位素标记物的定量分析方法，具体包括以下步骤：

S1、配制

例如：如果

S2、细胞培养：分别采用S1得到的

S3、细胞收集：弃去

S4、MCF衍生化：在常温条件下，向S3得到的

本步骤中，MCF衍生化用于使氨基酸及非氨基酸有机物形成挥发性酯或氨基甲酸酯，首先，在MCF衍生化反应中，羧基中的氧、一级或二级氨基基团中氮可作为基底替代氯离子。在羧酸中，其中间产物——酸酐受电子对的袭击，释放一分子的碳酸甲酯，并产生一分子酯；在氨基基团中，碳酸甲酯与氮结合，使氮失去一个质子，形成氨基甲酸酯基。MCF衍生后，代谢物中每个羧基的分子质量增加了14个质量单位，每个一级或二级氨基基团中分子质量增加了58个质量单位，具体原理参见图1。

S4的衍生化迅速，得到的产物单一且得到的衍生化产物结构稳定。

S5、采用GC-MS对衍生化溶液进行分析，优选的色谱柱为ZB-1701(30m×250μm×0.15μm，含5m保护柱)；流动相为氦气；进样体积为0.5-1.5μL，优选进样体积为1μL；氦气流的流速为0.5-1.5mL/min，优选流速为1mL/min；压力为0.2-0.6bar，优选压力为0.5bar；进样口温度为270-300℃，优选进样口温度为290℃。

柱升温程序如下：GC烤箱设置为42-48℃，维持1-2min后，以5-9℃/min速率升到170-185℃，维持4-8min后，以35-45℃/min速率升到210-230℃，维持4-8min后，以30-50℃/min(优选)速率升到240-250℃，维持10-15min后，以30-50℃/min(优选)速率升到260-290℃，维持1-4min，整个柱升温程序累计时间为40-57min，优选为43min，在该时间内，可分开保留时间接近的代谢物，并清理质谱柱。

进一步优选的柱升温程序如下：GC烤箱设置为45℃，维持2min后，以9℃/min速率升到180℃，维持5min后，以40℃/min速率升到220℃，维持5min后，以40℃/min速率升到240℃，维持11.5min后，以40℃/min速率升到280℃，再维持2min。

现有技术常采用的升温程序为：以10℃/min的速度升温到260-280℃，这种升温程序会出现80％以下的氨基酸的峰重叠，不利于氨基酸的定量分析，本实施例的升温程序能够将90％以上的氨基酸的各个峰分开。

电子碰撞电离能为70eV。质量扫描范围为38-550m/z，优选质量扫描范围为38-280m/z，其扫描速度为1.562μ/s。

质谱离子原的温度为140-160℃，优选质谱离子原的温度为150℃，能够保证95％以上的离子化效率。

质谱四级杆温度会影响离子飞行速度，本实施例中的质谱四级杆温度为225-235℃，进一步优选为230℃；

本实施例控制连接杆温度为245-255℃，优选为250℃。连接杆温度的温度偏高或者偏低均会导致太差，连接杆温度为250℃时，能够保证气体到质谱的传导效率≥98％。

为了能检测低浓度代谢物，不过度污染气象柱，S5采用pulsed splitless的分流方式。

S6、数据挖掘：采用AMDIS软件、MassOmics软件提取质谱数据，得到14种氨基酸的碎片的荷质比及

以上定量分析方法得到以下结论：

在正常组细胞培养组中，细胞的生长促使亮氨酸、脯氨酸、赖氨酸中含2个碳被

实施例2-计算

本实施例可通过计算

首先，

最后，

M代表代谢物中

下面以图2为例详细说明计算方法：

具体计算公式如下：

含一个

含两个

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。