一种碱性磷酸酶标记结合物的保存液及其制备方法

摘要

本发明涉及体外检测试剂技术领域，特别涉及一种碱性磷酸酶标记结合物的保存液及其制备方法。该保存液由如下组分组成：缓冲盐10～100mmol/L、蛋白质2～20g/L、表面活性剂0.5～5g/L、离子盐0.1～0.5mol/L、防腐剂0.5～5g/L、磷酸盐0.1～5mmol/L、水余量。本发明的保存液无需添加蛋白保护剂、糖类、脂类、醇类等稳定剂，能有效的提高碱性磷酸酶标记结合物溶液在储存和使用过程中的稳定性。且组份简单，制备方便，且减少配制的时间，降低生产成本，便于实现大批量生产。

说明书

技术领域

本发明涉及体外检测试剂技术领域，特别涉及一种碱性磷酸酶标记结合物的保存液及其制备方法。

背景技术

目前，化学发光免疫分析已成为体外诊断领域主要的检测方法，在病毒学、内分泌学、肿瘤学、生殖生理学、血液学、遗传学等医学和生物学各科的临床和科研工作中有了广泛的应用。其中酶促化学发光中需要用到碱性磷酸酶的标记结合物，碱性磷酸酶标记结合物的稳定性和灵敏度为高质量的化学发光试剂提供保证。

目前，提高碱性磷酸酶结合物的稳定性的方法主要包括，化学修饰和添加技术。然而化学修饰技术比较复杂且不易控制。添加技术简单、易行，所以该技术备受关注。

现有添加技术，主要是醇类、糖类、脂类等各种稳定剂添加，有些还会添加蛋白保护剂保护。即不同的酶标记结合物所需添加的稳定剂可能是醇类、糖类、脂类中的一种或者几种组合，蛋白保护剂也可能是一种或多种组合，即不同的酶标记结合物需要不同的配方，一方面，配制过程比较繁琐、复杂；另一方面，蛋白保护剂一般价格比较昂贵，添加一种或多种蛋白保护剂会增加成本；更重要的是，添加这些组份后，还可能会影响试剂性能，如：试剂灵敏度等。

专利CN109212180A公开了用于小分子抗原与碱性磷酸酶标记结合物的保存液。由缓冲盐、蛋白物质、盐离子、糖类物质、表面活性剂、稳定剂、防腐剂组成。该保存液仅针对小分子抗原与酶标记结合物。未涉及抗体与碱性磷酸酶结合物的稳定性。

因此，发明一种能够适用多种碱性磷酸酶结合物稳定性的保存液非常有必要。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种碱性磷酸酶标记结合物的保存液及其制备方法。该保存液无需添加醇类、糖类、脂类等稳定剂，以及无需添加蛋白保护剂保护剂，只需添加一种保护剂PB溶液，即可达到试剂稳定的效果，能够有效的提高碱性磷酸酶标记结合物溶液的在使用和存储的稳定性，特别是对小分子抗原，如：甲状腺素(T4)、三碘甲状腺原氨酸(T3)以及促甲状腺激素(TSH)抗体与碱性磷酸酶结合物效果更为显著。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种碱性磷酸酶标记结合物的保存液，由如下组分组成：

优选地，该保存液由如下组分组成：

作为优选，磷酸盐由磷酸二氢钠和磷酸氢二钠组成，pH值为7.0～7.8。

优选地，磷酸盐的pH值为7.4。

优选地，磷酸盐的浓度为5mmol/L。

作为优选，缓冲盐选自Tris、MES、MOPS、HEPES中任意一种。

在本发明提供的具体实施例中，缓冲盐为Tris。

优选地，缓冲盐的浓度为50mmol/L。

作为优选，蛋白质选自牛血清白蛋白、酪蛋白、明胶蛋白中任意一种。

优选地，蛋白质为牛血清白蛋白。

优选地，蛋白质的浓度为10g/L。

作为优选，表面活性剂选自吐温20、吐温40、吐温80、曲拉通x-100、曲拉通x-405、Brij-35中任意一种。

在本发明提供的具体实施例中，表面活性剂为Brij-35。

优选地，表面活性剂的浓度为1g/L。

作为优选，离子盐选自氯化钠、氯化镁、氯化锌、氯化钾中任意一种或多种的组合。

优选地，离子盐为氯化钠、氯化镁、氯化锌的组合；或者，离子盐为氯化钾、氯化镁、氯化锌的组合；

氯化钠浓度为0.1～0.3mol/L；氯化镁浓度为0.5～5mmol/L；氯化锌浓度为0.05～1mmol/L；氯化钾浓度为0.1～0.3mol/L。

优选地，氯化钠浓度为0.1～0.2mol/L；氯化镁浓度为2.5～5mmol/L；氯化锌浓度为0.1～0.5mmol/L；氯化钾浓度为0.1～0.2mol/L。

更优选地，氯化钠浓度为0.15mol/L；氯化镁浓度为5mmol/L；氯化锌浓度为0.1mmol/L。

更优选地，氯化钠浓度为0.15mol/L；氯化镁浓度为2.5mmol/L；氯化锌浓度为0.5mmol/L；氯化钾浓度为0.15mol/L。

作为优选，防腐剂选自叠氮钠、PC300、氯霉素、庆大霉素中任意一种或多种的组合。

在本发明提供的具体实施例中，防腐剂为叠氮钠。

优选地，防腐剂的浓度为1g/L。

作为优选，保存液的pH值为7.0～8.0。

优选地，保存液的pH值为7.4。

本发明还提供了该保存液的制备方法，包括如下步骤：

在水中加入缓冲盐，混匀，调整pH至为7.0～8.0；

加入离子盐、蛋白质、表面活性剂、防腐剂、保护剂，混匀，调整pH值为7.0～8.0，定容，过滤。

优选地，过滤的孔径为0.22μm。

本发明提供了一种碱性磷酸酶标记结合物的保存液及其制备方法。该保存液由如下组分组成：缓冲盐10～100mmol/L、蛋白质2～20g/L、表面活性剂0.5～5g/L、离子盐0.1～0.5mol/L、防腐剂0.5～5g/L、磷酸盐0.1～5mmol/L、水余量。与现有技术相比，本发明优点在于：

1、本发明的保存液不仅能稳定碱性磷酸酶标记小分子抗原结合物(如：T3、T4)在37℃加速7天的活性；而且也能稳定碱性磷酸酶标记抗体结合物(如：TSH)在37℃加速7天的活性。本发明的保存液能有效的提高碱性磷酸酶标记结合物溶液在储存和使用过程中的稳定性。

2、本发明将廉价的PB溶液作保护剂用于碱性磷酸酶结合物保存液中，无需添加蛋白保护剂、糖类、脂类、醇类等稳定剂；组份简单，制备方便，且减少配制的时间，降低生产成本，便于实现大批量生产。

具体实施方式

本发明公开了一种碱性磷酸酶标记结合物的保存液及其制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

各实施例中，“BSA”为“牛血清白蛋白”；

PB溶液为磷酸盐溶液。PB溶液本是一种缓冲液，在本申请中，发明人开发其新用途，可在酶标保存液中做保护剂。

0.2mol/L的PB缓冲液的配制

注：根据配比配制所需pH的PB溶液，然后稀释至对应浓度即可。

本发明碱性磷酸酶标记结合物的保存液及其制备方法中所用试剂或仪器均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1

用于碱性磷酸酶标记结合物的保存液，以保存液体积计，各组分及其含量如下：50mmol/L Tris、10g/L BSA、9g/LNaCl、1g/L Brij-35、1g/L NaN

制备步骤如下：

1、在干净容器中加入Tris缓冲盐后，加入800mL纯水充分混匀，用1M HCl调整pH为7.0-8.0；

2、在上述溶液中加入NaCl、MgCl

3、加入BSA搅拌混匀；

4、加入表面活性剂Brij-35搅拌混匀；

5、加入防腐剂NaN

6、加入保护剂PB溶液，PB终浓度为5mmol/L，搅拌混匀，并用1M HCl或1M NaOH调pH为7.4(±0.02)，用纯水定容至1000mL，用0.22um滤芯过滤，得到保存液。

实施例2

用于碱性磷酸酶标记结合物的保存液，以保存液体积计，各组分及其含量如下：10mmol/L Tris、2g/L BSA、9g/LNaCl、0.5g/L Brij-35、0.5g/L NaN

制备步骤如下：

1、在干净容器中加入Tris缓冲盐后，加入800mL纯水充分混匀，用1M HCl调整pH为7.0-8.0；

2、在上述溶液中加入NaCl、MgCl

3、加入BSA搅拌混匀；

4、加入表面活性剂Brij-35搅拌混匀；

5、加入防腐剂NaN

6、加入保护剂PB溶液，PB终浓度为0.1mmol/L，搅拌混匀，并用5M HCl或5M NaOH调pH为7.4(±0.02)，用纯水定容至1000mL，用0.22um滤芯过滤，得到保存液。

实施例3

用于碱性磷酸酶标记结合物的保存液，以保存液体积计，各组分及其含量如下：100mmol/L Tris、15g/L BSA、9g/L NaCl、2g/L Brij-35、2g/L NaN

制备步骤如下：

1、在干净容器中加入Tris缓冲盐后，加入800mL纯水充分混匀，用1M HCl调整pH为7.0-8.0；

2、在上述溶液中加入NaCl、MgCl

3、加入BSA搅拌混匀；

4、加入表面活性剂Brij-35搅拌混匀；

5、加入防腐剂NaN

6、加入保护剂PB溶液，PB终浓度为2mmol/L，搅拌混匀，并用1M HCl或1M NaOH调pH为7.4(±0.02)，用纯水定容至1000mL，用0.22um滤芯过滤，得到保存液。

对比例1

用于碱性磷酸酶标记结合物的保存液，以保存液体积计，各组分及其含量如下：

50mmol/L Tris、10g/L BSA、0.15mol/L NaCl、1g/L Brij-35、1g/L NaN

对比例2

与实施例1相比，未添加PB溶液。

用于碱性磷酸酶标记结合物的保存液，以保存液体积计，各组分及其含量如下：50mmol/L Tris、10g/L BSA、9g/L NaCl、1g/L Brij-35、1g/L NaN

制备步骤如下：

1、在干净容器中加入Tris缓冲盐后，加入800mL纯水充分混匀，用1M HCl调整pH为7.0-8.0；

2、在上述溶液中加入NaCl、MgCl

3、加入BSA搅拌混匀；

4、加入表面活性剂Brij-35搅拌混匀；

5、加入防腐剂NaN

6、用1M HCl或1M NaOH调pH为7.4(±0.02)，用纯水定容至1000mL，用0.22um滤芯过滤，得到保存液。

实验例 稳定性验证试验

酶标试剂由向上述保存液中加入三碘甲状腺原氨酸(T3)、甲状腺素(T4)与碱性磷酸酶标记结合物制得。

将上述试剂分为两份，一份放置于37℃加速老化7天，一份放置于2～8℃保存。放置7天后，以放置2～8℃试剂为对照，用两份酶标试剂同步测试相同样本。

37℃加速7天结果如下：

表1 FT3及FT4酶标记结合物37℃加速7天稳定性结果

从检测结果可以看出，本发明保存液配制的碱性磷酸酶标记抗原结合物37℃加速7天，FT3和FT4的发光值降幅在3％以内；保护剂含量对稳定性影响不大。

从对比例1中可以看出，碱性磷酸酶标记抗原结合物在含有醇类、糖类、脂类、鼠IgG的保存液中，37℃加速7天，其发光值降幅均在15％左右；

从对比例2中可以看出，碱性磷酸酶标记抗原结合物在在未添加PB的保存液中，FT3和FT4的发光值降幅在20％以上，未添加PB对稳定性有较大影响。

将表1中酶标记抗原结合物替换成碱性磷酸酶标记促甲状腺激素(TSH)抗体结合物，按上述方法检测加速7天后的发光值，测试结果如下：

表2 TSH酶标记结合物37℃加速7天稳定性结果

从检测结果可以看出，实施例1-3的发光值降幅也在3％以内；对比例1发光值降幅均在10％以上，对比实例2发光值降幅均在15％以上。

说明，本发明的保存液不仅可以保持小分子抗原和碱性磷酸酶结合物在37℃加速7天的稳定性，而且对一些抗体与碱性磷酸酶结合物也有同样的效果。

另外，实施例1中，将缓冲盐替换成其他种类，如MES、HEPES、MOPS等，保存液效果与实施例1无差别。

将离子盐NaCl更换成KCl，保存液效果与实施例1无差别。

将表面活性剂更换成Tween-20、吐温40、吐温80、曲拉通x-100、曲拉通x-405，保存液效果与实施例1无差别。

将防腐剂更换成PC300、氯霉素、庆大霉素，保存液效果与实施例1无差别。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。