L-苹果酸在制备防治肝脏缺血再灌注损伤药物中的应用

摘要

本发明公开了L‑苹果酸在制备防治肝脏缺血再灌注损伤药物中的应用，具体的，本发明公不了L‑苹果酸作为唯一的活性成分在制备预防或治疗肝脏缺血再灌注损伤的药物或保健品中的应用。本发明经小鼠体内实验论证，L‑苹果酸能够显著降低肝脏缺血再灌注引起的血清中丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶和乳酸脱氢酶等肝损伤标志物的增加，减小肝脏坏死面积，同时抑制缺血再灌注导致的肝脏组织脂质过氧化和细胞铁死亡，进而减轻肝损伤。本发明为肝脏缺血再灌注损伤相关疾病的治疗提供了理论依据，具有临床应用价值。

说明书

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及L-苹果酸在制备防治肝脏缺血再灌注损伤的药物中的应用。

技术背景

缺血再灌注损伤(Ischemia/Reperfusion Injury，IRI)是指组织器官缺血一段时间后重新恢复血液循环，细胞功能障碍及组织结构破坏不但未减轻反而加重的现象。缺血再灌注损伤在许多重要器官包括心、肝、肺、肾、胃肠道等均可发生。

肝脏缺血再灌注损伤(Hepatic Ischemia/Reperfusion Injury，HIRI)是肝切除、肝移植等肝脏外科手术中常见的并发症，是导致手术效果不佳，肝脏移植失败等情况的主要原因之一。严重的HIRI可导致肝细胞的大量死亡，进而可造成肝脏功能衰竭，甚至患者死亡。根据已有的研究报道，该病理生理过程发生机制复杂，且目前临床上尚缺乏针对HIRI的切实有效方法及特异性药物；因此，如何防治肝脏缺血再灌注损伤已经成为重大的医学研究方向。

铁死亡(Ferroptosis)是一类铁依赖的新型程序性细胞死亡途径，与凋亡、坏死和自噬在形态学、生物化学和遗传学等方面均有明显差异。铁死亡的发生与多种生物化学过程密切相关，包括多不饱和脂肪酸、铁和氨基酸代谢，以及谷胱甘肽、磷脂、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸和辅酶Q10的生物合成；具体可表现为脂质过氧化水平及标志基因Ptgs2表达量升高。新近研究发现，细胞铁死亡(Ferroptosis)是肝脏缺血再灌注损伤的重要分子机制之一。使用铁死亡特异性抑制剂可以在小鼠模型中有效缓解肝脏缺血再灌注损伤，因此铁死亡是一个具有临床应用潜力的治疗靶点。

L-苹果酸(L-Malate)，又名L-羟基丁二酸，是生物体代谢过程中产生的重要有机酸。它在线粒体产生能量物质ATP的三羧酸循环中发挥关键作用，也是苹果酸-天冬氨酸穿梭体系的重要组成部分，对胞质和线粒体之间还原当量的转移起到重要的作用。L-苹果酸安全、无毒、无害、可食用，且在机体内具有提高运动能力、抗疲劳、保护心脏、改善记忆能力等生理功能。

公开号为CN109966278A的中国发明专利申请公开了及草酰苹果酸在制备治疗神经细胞损伤的药物中的应用；学术论文“苹果酸醋酸钠林格液在围手术期肝缺血保护中的临床应用[D].”公开了苹果酸醋酸林格液能减轻肝脏部分切除手术后早期肝损伤，降低术后乳酸水平，保护肝功能。

然而目前为止，尚无L-苹果酸作为唯一的活性成分在细胞铁死亡及肝脏缺血再灌注损伤方面作用的报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供L-苹果酸作为唯一的活性成分在制备防治肝脏缺血再灌注损伤的药物或保健品中的应用，为新药研发和创新疗法提供基础。

本发明解决上述技术问题所提供的技术方案为：

L-苹果酸作为唯一的活性成分在制备预防或治疗肝脏缺血再灌注损伤的药物或保健品中的应用。

L-苹果酸在制备预防或治疗肝脏缺血再灌注引起肝损伤标志物升高的药物或保健品中应用。

L-苹果酸作为唯一的活性成分在制备预防或治疗肝脏缺血再灌注引起肝损伤标志物升高的药物或保健品中应用。

所述的肝损伤标志物为丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶或乳酸脱氢酶。

L-苹果酸在制备预防或治疗肝脏缺血再灌注引起脂质过氧化的药物或保健品中应用。

L-苹果酸作为唯一的活性成分在制备预防或治疗肝脏缺血再灌注引起脂质过氧化的药物或保健品中应用。

L-苹果酸在制备预防或治疗肝脏缺血再灌注引起肝细胞铁死亡的药物或保健品中应用。

L-苹果酸作为唯一的活性成分在制备预防或治疗肝脏缺血再灌注引起肝细胞铁死亡的药物或保健品中应用。

本发明的有益效果主要体现在：

本发明首次公开L-苹果酸作为唯一的活性成分对肝脏缺血再灌注损伤具有保护作用，其可用于制备预防或治疗肝脏缺血再灌注损伤的药物或保健品。经试验证明，L-苹果酸处理能够显著降低减少接受肝脏缺血再灌注手术后小鼠的血清肝损伤标志物及肝脏病理变化，并抑制了肝脏铁死亡的发生，有广泛的临床应用价值。

本研究结果为L-苹果酸改善肝脏缺血再灌注损伤提供了理论依据，特别是对相关药物或保健品的研发提供了基础。

附图说明

图1为不同实验分组中小鼠血清肝损伤标志物含量变化的对比图，其中，图A为血清丙氨酸氨基转移酶含量对比，图B为天冬氨酸氨基转移酶含量对比，图C为乳酸脱氢酶含量对比。

图2为L-苹果酸对小鼠肝脏缺血再灌注手术后病理变化的影响。

图3为不同实验分组中铁死亡标志基因以及脂质过氧化产物丙二醛含量变化对比图，其中，图A为肝脏铁死亡标志基因Ptgs2 mRNA含量对比，图B为脂质过氧化产物丙二醛含量对比。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。

实施例1动物实验：L-苹果酸在制备防治肝脏缺血再灌注损伤的药物中的应用

1、材料和方法

1.1、实验动物

6周龄SPF级C57BL/6雄性小鼠购自江苏集萃药康生物科技有限公司，SPF环境饲养。标准饲料AIN-76A(Research Diets，Inc)适应喂养2周后，按体重随机分组，每组8-10只。

1.2、实验药物

L-苹果酸购自Sigma-Aldrich公司(货号02288)，纯度≥99％，溶于生理盐水中。

1.3、小鼠肝脏缺血再灌注模型的构建

小鼠用异氟烷麻醉(3％浓度用于麻醉诱导，1.5％浓度用于麻醉维持)后并固定于37度恒温平台，常规脱毛，酒精棉球消毒。沿腹部正中线一次切开皮肤和肌肉，分离分离肝脏周围的镰状韧带和左右三角韧带，充分暴露肝门部血管，用微型无损血管夹夹闭门静脉、肝动脉及胆总管(肝叶颜色由鲜红变为灰暗)。开始记时，并用温热生理盐水纱布覆盖切口。缺血1小时后，放开血管夹，恢复肝叶血流并逐层关腹。再灌注6小时后，处死小鼠并留取肝脏组织和血液标本。

实验分组：

6周龄的C57BL/6雄性小鼠标准膳食均衡2周后随机分成4组，第一、二组为假手术组(仅行麻醉、剖腹，只牵拉分离肝组织)，第三、四组均进行肝脏缺血再灌注手术(缺血1小时，再灌注6小时)。

其中第二、四组在缺血前2小时和再灌注前10小时各腹腔注射L-苹果酸(10毫克/公斤体重)，而第一、三组在相同的时间点给予同样剂量的生理盐水。

再灌注结束后解剖小鼠，收集血清和肝脏组织，检测血清肝损伤标志物、肝脏病理变化以及铁死亡水平。

1.4、血清肝损伤标志物的检测

采集的血液室温放置2小时后，转速3000g离心10分钟以收集血清。采用罗氏COBASINTEGRA 800全自动生化分析仪检测血清中丙氨酸氨基转移酶(ALT)，天冬氨酸氨基转移酶(AST)和乳酸脱氢酶(LDH)含量，检测结果如图1所示。

由图1所示，与假手术组相比，缺血再灌注组血清中这三种酶的含量显著升高，说明肝损伤造模成功；L-苹果酸处理对假手术组无影响，说明其安全无害；而L-苹果酸处理能够显著降低肝脏缺血再灌注小鼠中这些酶的含量，提示其在这种病理状态下对肝脏功能的保护作用。

1.5、肝脏石蜡切片HE染色

(1)肝组织于10％甲醛溶液中固定24小时，脱水、透明、浸蜡、包埋；

(2)蜡块切片，厚度为5μm，65℃烤箱烘烤2小时，常温保存；

(3)苏木精染液浸泡5分钟，去离子水洗去浮色，1％盐酸酒精分化2-5秒，去离子水再冲洗10分钟；

(4)伊红染液浸泡3分钟，去离子水洗去浮色；

(5)梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片；

(6)光学显微镜下观察。

结果如图2所示，L-苹果酸处理可以显著减轻肝脏缺血再灌注造成的肝细胞坏死、空泡样变性及肝窦充血等病理损伤。

1.6、RNA提取和荧光定量实时PCR

Trizol(Life Technologies)法提取细胞和组织的RNA，具体操作按说明书进行。Nanodrop 1000Spectrophotometer上检测RNA纯度(OD

2.0微克RNA经DNase(Promega)处理后，M-MLV反转录酶(Promega)和Oligo(dT)18primer(Takara Bio Inc.)进行反转录。CFX96 Real-Time System(Bio-Rad)中进行荧光定量实时(Real-time PCR)检测mRNA水平各相关基因表达，检测体积为10ul，试剂采用iQSYBR Green Supermix(Bio-Rad)，引物序列如下：

小鼠Gapdh引物：

正向：ATCATCCCTGCATCCACT

反向：ATCCACGACGGACACATT

小鼠Ptgs2引物：

正向：CTGCGCCTTTTCAAGGATGG

反向：GGGGATACACCTCTCCACCA

结果如图3A所示，L-苹果酸处理能够显著回落因肝脏缺血再灌注损伤而升高的铁死亡标志基因。

1.7、肝组织中丙二醛(MDA)的测定

丙二醛(MDA)是生物体脂质氧化的一种产物，其含量可用于判断细胞内脂质氧化的水平，过氧化脂质降解产生的MDA能够与硫代巴比妥酸缩合，产生红色产物，在532nm处形成最大吸收峰。因此，检测MDA的含量能反映机体内脂质过氧化的程度，可以间接指示细胞铁死亡的程度。本发明采用碧云天生物技术(Beyotime Biotechnology)脂质氧化(MDA)检测试剂盒(S0131)，按说明书操作：

(1)组织用PBS进行匀浆、裂解；

(2)1，600g离心10分钟取上清用于后续测定；

(3)测定蛋白浓度，以便于后续计算单位蛋白重量组织或细胞内的MDA含量；

(4)称取适量TBA，用TBA配制液配制成浓度为0.37％的TBA储存液；

(5)配制MDA检测工作液；

(6)取适量标准品用蒸馏水稀释至1、2、5、10、20、50μM，用于后续制作标准曲线；

(7)在离心管中加入0.1ml PBS作为空白对照，加入0.1ml上述不同浓度标准品用于制作标准曲线，加入0.1ml样品用于测定，随后加入0.2ml MDA检测工作液；

(8)混匀后，100℃或沸水浴加热15分钟；

(9)冷却至室温，1，000g室温离心10分钟；

(10)取200μl上清加入到96孔板中，随后用酶标仪在532nm测定吸光度。

结果如图3B所示，缺血再灌注损伤可以显著升高小鼠肝脏中的MDA水平，提示脂质过氧化及铁死亡的发生；而使用L-苹果酸处理后，小鼠肝脏在损伤后的MDA升高得到了明显抑制，说明L-苹果酸可以抑制以脂质过氧化为关键分子机制的铁死亡过程。

1.8、统计方法

全部数据采用均数±标准误(mean±SD)表示，使用GraphPad Prism(version6.0，GraphPad software；SanDiego，CA，USA)统计学软件进行统计学分析。P＜0.05代表差异有显著性，具有统计学意义。

2、实验结果

结果显示，相较于单纯的缺血再灌注组，L-苹果酸处理能明显抑制被手术显著上调的血清肝损伤标志物(图1)和肝脏病理改变(图2)，说明其对肝脏功能的保护作用。同时，被缺血再灌注处理显著激活的铁死亡水平也被L-苹果酸显著抑制(图3)。

结论：基于上述实验，运用L-苹果酸抑制铁死亡是防治肝脏缺血再灌注的新型疗法。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。