用于从黑米中提取花青素的固定化酶及制备和使用方法

摘要

本发明用于从黑米中提取花青素的固定化酶及制备和使用方法，所述方法包括步骤1，将表面包裹有SiO2的Fe3O4纳米粒子分散在乙醇中，之后加入3‑氨丙基三乙氧基硅烷恒温处理得到混合体系A，将产物分离并清洗、干燥，得到Fe3O4/SiO2‑NH2纳米粒子；步骤2，将该粒子浸泡在戊二醛水溶液中，戊二醛将其氨基氧化成醛基得到混合体系B，将产物分离并清洗、干燥得到活化的纳米粒子；步骤3，将其浸泡在温度为20‑70℃、pH为4.5‑7.0的酶液中进行固定，得到固定液，酶液由纤维素酶水溶液和α‑淀粉酶水溶液混合得到，将产物从固定液中分离并清洗，得到用于从黑米中提取花青素的固定化酶。

说明书

技术领域

本发明属于提取加工技术领域，具体为用于从黑米中提取花青素的固定化酶及制备和使用方法。

背景技术

黑米含有丰富的蛋白质以及维生素B

目前，从黑米中提取花青素的方法主要包括溶剂浸提法和辅助提取法。其中，溶剂浸提法因其提取成本低，工艺简单等优点被广泛使用。然而，细胞壁内存在多糖如半纤维素，淀粉，果胶，降低了常规提取技术的提取效率。且，常规提取技术都不可避免地存在痕量的有机溶剂，如无水甲醇，乙醇和丙酮，低提取产率，时间效率低和提取质量差等问题。因此，利用绿色和新颖的提取方法来提取花色苷是当前食品工业的发展趋势。酶辅助从植物中提取生物分子是传统溶剂提取方法的潜在替代方法之一，与传统方法相比，酶辅助提取方法具有更低的能量消耗，更高的提取率以及更少的溶剂用量。但是，天然酶在食品工业中的应用，由于其操作稳定性低，回收程序复杂和再次利用难等缺点受到阻碍。这些缺点通常可以通过酶的固定化得到的固定化酶来克服。酶的固定化可用作增强酶的操作性能，改善酶的稳定性以实现可扩展性。并且，酶固定化改善了酶催化性能和热稳定性以及对有机溶剂的耐受性，使其具有工业和经济可行性。

四氧化三铁(Fe

发明内容

为了解决现有技术存在的问题，本发明提供用于从黑米中提取花青素的固定化酶及制备和使用方法，制备方法简单，成本低，环境友好，不仅提高了固定化酶的使用效率和可重复使用次数，同时提高了花青素的提取效率。

本发明是通过以下技术方案来实现：

用于从黑米中提取花青素的固定化酶的制备方法，包括如下步骤：

步骤1，将表面包裹有SiO

步骤2，将Fe

步骤3，将戊二醛活化的Fe

优选的，步骤1所述的Fe

将每2g Fe

进一步，步骤1在混合液中加入5mL正硅酸乙酯在30℃恒温下搅拌12h，得到混合体系a。

优选的，步骤1在分散液中加入3-氨丙基三乙氧基硅烷后在50℃恒温搅拌10h，得到混合体系A。

优选的，步骤2中所述的戊二醛水溶液为质量分数为2％-12％的戊二醛水溶液。

优选的，步骤3将戊二醛活化的Fe

优选的，步骤2和步骤3均采用磁铁吸附的方式对产物进行磁性分离，之后弃去上清液，然后用pH为7的磷酸盐缓冲液清洗。

一种由上述任意一项所述的用于从黑米中提取花青素的固定化酶的制备方法得到的固定化酶。

上述固定化酶的使用方法，将所述的固定化酶、黑米皮和pH为5.5-6的柠檬酸钠缓冲液混合均匀，其中所述的固定化酶与黑米皮的质量比为9：10，固定化酶与黑米皮的总质量与柠檬酸钠缓冲液的质量比为1:(20-70)，该柠檬酸钠缓冲液的温度为20-70℃，该固定化酶对花青素进行提取，提取时间为30-180min。

进一步，所述的黑米皮按如下方式得到，

将黑米粉碎后过200目筛，得到所述的黑米皮。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

本发明用于从黑米中提取花青素的固定化酶的制备方法，将表面包裹有SiO

附图说明

图1为本发明实施例2得到的固定化酶在10μm下的电镜扫描图。

图2为本发明实施例2得到的固定化酶在1μm下的电镜扫描图。

图3为本发明实施例2得到的固定化酶的傅里叶红外图。

图4为本发明实施例2得到的固定化酶的X衍射图。

图5为本发明实施例2得到的固定化酶的磁力吸附曲线。

图6为本发明实施例2得到的固定化酶分离时的实物图和提取完花青素分离时的实物图。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

本发明一种用于从黑米中提取花青素的固定化酶的制备方法，包括以下步骤：

S1：在参数优化的基础上利用TEOS在Fe

准确称取2g粒径为30nm的Fe

合成机理：溶胶-凝胶法是磁性纳米粒子包裹SiO

S2：在参数优化的基础上利用APTES在Fe

准确称取2g Fe

引入氨基的方法是采用带有氨基的硅烷偶联剂(APTES)与目标物进行反应。在无水条件下，APTES在二氧化硅表面的吸附和反应，硅氧烷键直接与二氧化硅表面羟基反应实现修饰。在无水条件下APTES的乙氧基直接与二氧化硅表面的Si-OH发生缩醇反应，形成Si-O-Si键，无水条件下APTES分子之间不会缩合，故形成较为规则的单分子层修饰。在酶固定化领域通常使用的是带有氨基功能基团的硅烷偶联剂，可以利用硅烷偶联剂上的氨基功能基团与之后的交联剂戊二醛形成稳定的Shiff碱结构，实现酶的固定化。

S3：在Fe

A：准确称取0.2g Fe

B：向戊二醛活化的Fe

酶液由1mg/mL的纤维素酶水溶液和2mg/mL的α-淀粉酶水溶液按体积比为1:1的比例混合得到。

酶固定的原理：经过氨基修饰的磁性Fe

酶活性：通过3,5-二硝基水杨酸(DNS)试剂法测定α-淀粉酶和纤维素酶(固定或游离)的活性。固定之后，α-淀粉酶和纤维素酶的活性回收率分别为55％-71％和50％-65％(以酶的初始活性为100％)。

S4：黑米粗粉碎分离出黑米皮；

黑米烘干，粉碎，过200目筛，得到黑米皮，用于提取花青素。

S5：利用固定化酶提取花青素；

将固定化酶、黑米皮和pH为5.5-6的柠檬酸钠缓冲液混合均匀，其中固定化酶与黑米皮的质量比为9：10，固定化酶与黑米皮的总质量与柠檬酸钠缓冲液的质量比为1:(20-70)，温度为20-70℃，时间为30-180min，固定化酶的循环使用次数1-6次。

之后采用pH示差法测定花青素的含量。

提取率为200-250mg/100g。

实施例1

准确称取2g粒径为30nm的Fe

准确称取2g Fe

准确称取0.2g Fe

向戊二醛活化的Fe

选择市售黑米烘干，粉碎，过200目筛，用于提取花青素。固定化酶用量为900mg/g，料液比为1:50，提取时溶液的pH为6.0，提取温度为20℃，提取时间为60min，固定化酶的循环使用次数1次。

实施例2

准确称取2g粒径为30nm的Fe

准确称取2g Fe

准确称取0.2g Fe

向戊二醛活化的Fe

选择市售黑米烘干，粉碎，过200目筛，用于提取花青素。固定化酶用量为900mg/g，料液比为1：50，提取时溶液的pH为5.5，提取温度为40℃，提取时间为90min，如图6所示进行磁性分离，花青素的提取率为268.18mg/100g，固定化酶的循环使用次数1次。

如图1和图2所示，固定化酶呈球形或椭圆形，粒径小于100nm。纳米颗粒尺寸越小，比表面积与体积比越大，从而提高了酶的固定化率。

傅立叶变换红外光谱用于表征Fe

X射线衍射用于分析固定纤维素酶和α-淀粉酶之前和之后的磁性纳米颗粒的晶体结构。如图4所示，三个样品的特征峰几乎相同，并且在2θ＝30.1、35.5、43.0、53.4、56.9和62.4处可以观察到特殊的衍射峰，分别对应于晶格面(220)，(311)，(400)，(422)，(511)和(440)。结果表明，固定纤维素酶和α-淀粉酶后，Fe

固定化酶的磁力吸附曲线分析了纳米载体和固定化酶纳米颗粒的磁性变化。如图5所示，Fe

实施例3

准确称取2g粒径为30nm的Fe

准确称取2g Fe

准确称取0.2g Fe

向戊二醛活化的Fe

选择市售黑米烘干，粉碎，过200目筛，用于提取花青素。固定化酶用量为900mg/g，料液比为1：50，提取时溶液的pH为5.5，提取温度为20℃，提取时间为60min，固定化酶的循环使用次数1次。

实施例4

准确称取2g粒径为30nm的Fe

准确称取2g Fe

准确称取0.2g Fe

向戊二醛活化的Fe

选择市售黑米烘干，粉碎，过200目筛，用于提取花青素。固定化酶用量为900mg/g，料液比为1：50，提取时溶液的pH为6.0，提取温度为20℃，提取时间为90min，固定化酶的循环使用次数1次。