一种基于双酶-水凝胶复合材料对葡萄糖快速检测的试剂盒及其检测方法

摘要

本发明公开了一种基于双酶‑水凝胶复合材料对葡萄糖快速检测的试剂盒及其检测方法，试剂盒包括：PCR管管体、包封双酶‑水凝胶复合材料的配套管盖、内装显色液和终止液的试剂管、小吸管、比色卡纸，所述双酶‑水凝胶复合材料由以下组分组成：0.2M pH 5.0～6.5的乙酸缓冲液4μL，30％丙烯酰胺7μL，乙酰丙酮2μL，20～100U/mL的葡萄糖氧化酶2μL、100～500U/mL的过氧化物酶4μL。本发明的试剂盒能够用于血清等复杂体系中葡萄糖的直接比色检测，相较于血糖仪成本低廉，易产业化。本发明可解决现有技术中对葡萄糖检测的操作要求高，检测过程复杂，检测成本高，检测时间长等问题。

说明书

技术领域

本发明属于检测试剂盒技术领域，具体涉及一种基于双酶-水凝胶复合材料对葡萄糖快速检测的试剂盒及其检测方法。

背景技术

葡萄糖含量的检测方法有很多种，目前用于血清葡萄糖含量检测的国家微升标准参考方法(标准号：WS/T 350-2011)时采用己糖激酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶联合的方法。近年来，葡萄糖氧化酶法已广泛应用于生物化学、临床化学及食品分析中葡萄糖的检测，酶在正常条件下表现出很高的选择性和反应性，但对pH和温度较敏感而易失活，游离酶价格昂贵使用一次后不能回收利用，增加了使用成本。实际应用中常用的方法有高效液相色谱(HPLC)法、气相色谱法、紫外分光光度法、旋光度法、电化学检测法、荧光法等。这些检测方法中大部分都需要借助相应的仪器设备实施，使用起来不便。而葡萄糖快速测定的血糖仪、试剂盒、试纸等因其构造复杂、制作过程繁琐，价格昂贵，在实际家庭医疗保健环境应用中受到很大限制。因此，发展低成本、操作简单、性能良好的葡萄糖快速检测方法及对应的可实际应用的试剂盒显得尤为重要。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一种基于双酶-水凝胶复合材料对葡萄糖快速检测的试剂盒及其检测方法，可以快速、高灵敏度地进行葡萄糖检测，且易于操作。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种基于双酶-水凝胶复合材料对葡萄糖快速检测的试剂盒，包括PCR管管体、配套管盖、内装显色液和终止液的试剂管、小吸管及比色卡纸；其中，所述配套管盖内侧包封有双酶-水凝胶复合材料，所述双酶-水凝胶复合材料由以下组分组成：0.2M pH 5.0～6.5的乙酸缓冲液4μL，30％丙烯酰胺7μL，乙酰丙酮2μL，20～100U/mL的葡萄糖氧化酶2μL、100～500U/mL的过氧化物酶4μL。

优选地，所述显色液为100μL 0.05～0.2mg/mL的3,3’,5,5’-四甲基联苯溶液，所述终止液为30μL 0.2～1M的H

一种基于上述试剂盒的葡萄糖浓度检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)制备双酶-水凝胶复合材料

取PCR管的管盖，按顺序及配比依次向盖中加入乙酸缓冲液、丙烯酰胺、乙酰丙酮、葡萄糖氧化酶溶液、辣根过氧化物酶溶液，然后用封口膜封住管盖，室温静置1～5min，制得包封双酶-水凝胶复合材料的配套管盖；

(2)葡萄糖比色检测

取步骤(1)制得的包封双酶-水凝胶复合材料的配套管盖，撕掉封口膜，将PCR管管体倒扣在管盖上，剪刀剪去尖端管底，用小吸管吸取待测样品10μL从开口处加入到管中，静置反应5min后滴入试剂管中的显色液，1min后滴入试剂管中的终止液终止反应，最后将溶液颜色与比色卡纸标准浓度对比，即可；

(3)葡萄糖定量检测

取步骤(1)制得的包封双酶-水凝胶复合材料的配套管盖，撕掉封口膜，将PCR管管体倒扣在管盖上，剪刀剪去尖端管底，用小吸管吸取待测样品10μL从开口处加入到管盖中，静置反应5min后滴入试剂管中的显色液，1min后滴入试剂管中的终止液终止反应，用紫外可见分光光度计测定450nm处的吸光度，绘制并对照浓度-吸光度波普图，即可。

优选地，所述静置反应的温度为室温。

优选地，步骤(2)所述葡萄糖比色检测中的静置反应及检测步骤如下：葡萄糖氧化酶与溶液中的葡萄糖发生反应生成双氧水，另一种过氧化物酶催化底物与双氧水使测试液呈现蓝色，加终止液终止反应，将溶液颜色与比色卡纸标准浓度对比，从而得出溶液中葡萄糖浓度的大小。

优选地，步骤(3)所述浓度-吸光度波谱图的建立步骤如下：将葡萄糖标准品配置成已知的不同浓度的葡萄糖标准溶液，加入到双酶-水凝胶复合材料中后，加入显色液，显色反应后加入终止液终止反应，再采用紫外-可见分光光度计测定溶液的吸光度，并以吸光度作为纵坐标，葡萄糖浓度作为横坐标，绘制出浓度-吸光度波谱图。

本发明的有益效果如下：

(1)本发明通过葡萄糖氧化酶氧化葡萄糖生成双氧水，双氧水与显色剂反应产生颜色变化，以识别葡萄糖的不同浓度。葡萄糖的浓度不同，则溶液颜色及颜色深浅均不同；通过肉眼观察即可判断葡萄糖是否超标，而不必借助任何仪器，因此检测成本低，操作简单。

(2)本发明的试剂盒及其检测方法，颜色变化明显，灵敏度高，需要的反应体系体积比较小，测量成本低。

(3)本发明的试剂盒及其检测方法，检测速度快，6min可完成检测，反应条件温和，重现性好，且无需昂贵的检测仪器，操作简便，可实现葡萄糖的快速可视化识别和检测。

(4)本发明的试剂盒及其检测方法，能够用于血清等复杂体系中葡萄糖的直接比色检测，相较于血糖仪成本低廉，易产业化，可实现商业化应用。

附图说明

图1为实施例2中对葡萄糖定量检测的浓度-吸光度波谱图；

图2为实施例3中对葡萄糖的选择性比对图；

图3为实施例4中对试剂盒循环使用并对葡萄糖定量检测的浓度-吸光度波谱图。

具体实施方式

下面结合附图与具体实施例对本发明做进一步详细说明。

实施例1

一种基于双酶-水凝胶复合材料对葡萄糖快速检测的试剂盒，由以下部件组成：

(1)200μL PCR管管体；

(2)包封双酶-水凝胶复合材料的配套管盖，制备方法如下：

取200μL PCR管，剪下PCR管盖，按顺序依次向盖中加入乙酸缓冲液4μL(0.2M，pH5.0～6.5)、30％丙烯酰胺7μL、乙酰丙酮2μL、葡萄糖氧化酶溶液2μL(0.5mg/mL)、辣根过氧化物酶溶液4μL(1mg/mL)，然后用parafilm封口膜封住配套管盖盖口，室温静置1～5min即成胶；

(3)内装显色液和终止液的试剂管；

所述显色液为100μL 0.05～0.2mg/mL的3,3’,5,5’-四甲基联苯溶液，所述终止液为30μL 0.2～1M的H

(4)小吸管；

(5)比色卡纸。

实施例2

一种基于实施例1制得的试剂盒的葡萄糖浓度检测方法，使用所述试剂盒，按下列步骤进行：

(1)取包封双酶-水凝胶复合材料的配套管盖，撕掉封口膜，将200μL PCR管管体倒扣在管盖上；

(2)用小吸管吸取待测样品10μL加入到开口的管体中，反应5min；

(3)滴入试剂管中的显色液，1min后滴入试剂管中的终止液终止反应；

(4)比色检测：葡萄糖氧化酶与溶液中的葡萄糖发生反应生成双氧水，另一种过氧化物酶催化底物与双氧水使测试液呈现蓝色，加终止液终止反应，将溶液颜色与比色卡纸标准浓度对比，从而得出溶液中葡萄糖浓度的大小。

(5)定量检测：取反应后的溶液100μL，用纯水稀释至250μL，然后放入350μL的Y形微量比色皿中，用紫外可见分光光度计测定450nm处的吸光度，绘制并对照浓度-吸光度波普图。

所述浓度-吸光度波谱图的建立步骤如下：将葡萄糖标准品配置成已知的不同浓度的葡萄糖标准溶液，加入到双酶-水凝胶复合材料中后，加入显色液，显色反应后加入终止液终止反应，再采用紫外-可见分光光度计测定溶液的吸光度，并以吸光度作为纵坐标，葡萄糖浓度作为横坐标，绘制出浓度-吸光度波谱图。

如图1所示，待测样品的浓度分别为0、2、5、8、10、12、15、20、30、40、50mM，随着待测样品的浓度增加，最大吸光峰处的吸光度的值不断增大。

实施例3

对葡萄糖的选择性检测，使用实施例1制得的试剂盒，具体步骤如下：

(1)取若干包封双酶-水凝胶复合材料的配套管盖，撕掉封口膜，将200μL PCR管管体倒扣在管盖上；

(2)用小吸管分别吸取10μL葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖和半乳糖，浓度均为20mM，加入到管盖中，反应5min；

(3)滴入试剂管中的显色液，1min后滴入试剂管中的终止液终止反应；

(4)将溶液颜色与比色卡纸标准浓度对比；

(5)如需定量检测，则取反应后的溶液100μL，用纯水稀释至250μL，然后放入350μL的Y形微量比色皿中，用紫外可见分光光度计测定450nm处的吸光度，绘制并对照浓度-吸光度波普图。

如图2所示，所测葡萄糖吸光度的值远大于果糖、蔗糖、乳糖和半乳糖的值，该试剂盒实现了葡萄糖的特异性检测。

实施例4

对葡萄糖浓度检测的重复使用，使用实施例1制得的试剂盒，具体步骤如下：

(1)取若干试剂盒加入10μL葡萄糖溶液(5mM)，室温下反应5min，滴入试剂管中的显色液，取出试剂盒中所有溶液后，1min后向取出的溶液中滴入试剂管中的终止液；

(2)继续向试剂盒中加入10μL葡萄糖溶液(5mM)进行反应，并重复上述步骤，共重复5次；

(3)将反应后的溶液100μL，用纯水稀释至250μL，然后放入350μL的Y形微量比色皿中，用紫外可见分光光度计测定450nm处的吸光度，绘制并对照浓度-吸光度波普图。

从图3可以看出，该试剂盒重复使用5次时所取出溶液的颜色变化不大，从而实现了该试剂盒的循环使用。

实施例5

对血清中葡萄糖的检测，使用实施例1制得的试剂盒，具体步骤如下：

(1)取包封双酶-水凝胶复合材料的配套管盖，撕掉封口膜，将200μL PCR管管体倒扣在管盖上；

(2)用小吸管吸取10μL稀释5倍的血清样品加入到开口的管体中，反应5min；

(3)滴入试剂管中的显色液，1min后滴入试剂管中的终止液终止反应；

(4)将溶液颜色与比色卡纸标准浓度对比或用紫外可见分光光度计测定450nm处的吸光度。

本发明在温和室温下制备了包裹双酶(葡萄糖氧化酶、过氧化物酶)的水凝胶复合材料，将葡萄糖氧化酶和过氧化物酶两种酶共同固定在水凝胶中，能够有效地提高多酶级联反应的效率，并保持了双酶的酶活性，保证了结果的可靠性，提高了酶的稳定性和易储存性。利用葡萄糖氧化酶氧化葡萄糖生成过氧化氢，在过氧化物酶催化作用下显色剂的显色反应来检测葡萄糖，可解决现有技术中对葡萄糖检测的操作要求高，检测过程复杂，检测成本高，检测时间长等问题，本发明提出的试剂盒及其检测方法，成本低、操作简单、反应灵敏，能够实现可视化快速检测样品中葡萄糖含量，能够用于血清等复杂体系中葡萄糖的直接比色检测，相较于血糖仪成本低廉，易产业化，可实现商业化应用。