一种基于LC-MS代谢组学中降低检测假阳性的方法

摘要

本发明公开了一种基于LC‑MS代谢组学中降低检测假阳性的方法，其包括，确定基准物的特征离子碎片和母离子，用所述母离子与所述特征离子碎片构建离子对，所述离子对包括第一离子对和第二离子对；在色谱仪和/或质谱仪的MRM模式下优化DP、CE参数，获得所述第一离子对和/或所述第二离子对的保留时间及峰面积信息；计算所述第一离子对和所述第二离子对之间的峰面积比值，定义所述比值为R值；建立第一离子对数据库和/或第二离子对数据库；获取待测物样品，检测所述待测物样品，获取其所述第一离子对和所述第二离子对出峰结果，并与所述数据库比对分析，进行假阳性过滤。使用该广靶的方法，具有检测的物质准确的特点。

说明书

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种基于LC-MS代谢组学中降低检测假阳性的方法。

背景技术

代谢组学是继基因组学、转录组学和蛋白组学后出现的新兴学科，它是通过对生物体内的小分子代谢物进行定性和定量分析，描述生物基质中小分子代谢物的表达与修饰变化来系统反馈生命体对自身机体调控或者外界环境扰动所做出的代谢应答变化规律的一门学科，是系统生物学的重要组成部分。当前，代谢组学已广泛应用于药理毒理，疾病发病机制和临床诊断，植物生长发育等研究领域。代谢组学分析常采用非靶向和靶向的分析策略，非靶向的方法虽然具有分析通量高、数据信息丰富特点，但存在数据的稳定性、重复性差，线性范围小等缺陷，不能产生可靠准确的定量分析结果。而靶向的分析方法虽然具有灵敏度高，稳定性好，定量准确的特点，但是其也存在着分析的靶标代谢物数量有限，分析通量低的问题。而最近新出现的技术广靶分析策略，是一种结合非靶向代谢组学和靶向代谢组学优点的新方法，可同时定量近千种代谢物，具有高灵敏度、广覆盖的代谢物的检测。该方法是利用已建好的代谢物的离子对信息和保留时间的数据信息，通过三重四级杆质谱基于多反应监测(multiple reaction monitoring，MRM)的质谱模式，对生物样本进行分析检测的一种方法。因为代谢组学样本中代谢物的复杂性，以及色谱柱的更换、污染，不同仪器间的差别，仪器固有属性的特殊性，使得样本中的实际保留时间与数据库中的保留时间有差异，从而导致代谢物的定性存在着一定的假阳性。如何快速的准确去除假阳性，是制约广靶发展的主要瓶颈之一，本文提出的双离子对定性的方法，是一种适用于广靶的快速准确的定性方法，可大幅度提高广靶的准确性，降低假阳性。

发明内容

本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。

鉴于上述的技术缺陷，提出了本发明。

因此，作为本发明其中一个方面，本发明克服现有技术中存在的不足，提供一种基于LC-MS代谢组学中降低检测假阳性的方法。

为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种基于LC-MS代谢组学中降低检测假阳性的方法，其包括，确定基准物的特征离子碎片和母离子，用所述母离子与所述特征离子碎片构建离子对，所述离子对包括第一离子对和第二离子对；在色谱仪和/或质谱仪的MRM模式下优化DP、CE参数，获得所述第一离子对和/或所述第二离子对的保留时间及峰面积信息；计算所述第一离子对和所述第二离子对之间的峰面积比值，定义所述比值为R值；建立第一离子对数据库和/或第二离子对数据库；获取待测物样品，检测所述待测物样品，获取其所述第一离子对和所述第二离子对出峰结果，并与所述数据库比对分析，进行假阳性过滤。

作为本发明所述的基于LC-MS代谢组学中降低检测假阳性的方法的优选方案，其中：所述进行假阳性过滤，采用的判定标准为，所述待测物样品中第一离子对和/或第二离子对出峰的保留时间之间差值大于第一预判时间，即判定所述目标物样品为假阳性。

作为本发明所述的基于LC-MS代谢组学中降低检测假阳性的方法的优选方案，其中：所述进行假阳性过滤，采用的判定标准为，所述待测物样品中第一离子对和/或第二离子对出峰的出峰保留时间与所述第一离子对数据库和/或所述第二离子对数据库中保留时间差值超过第二预判时间，即判定所述目标物样品为假阳性。

作为本发明所述的基于LC-MS代谢组学中降低检测假阳性的方法的优选方案，其中：所述进行假阳性过滤，采用的判定标准为，所述待测物样品中第一离子对和/或第二离子对出峰的R值与所述第一离子对数据库和/或所述第二离子对数据库R值差值超过第三预判值，即判定所述目标物样品为假阳性。

作为本发明所述的基于LC-MS代谢组学中降低检测假阳性的方法的优选方案，其中：所述第一预判时间为0.1min以内；所述第二预判时间0.5min以内；所述第三预判值小于50％。

作为本发明所述的基于LC-MS代谢组学中降低检测假阳性的方法的优选方案，其中：所述待测物为代谢组学中的各类检测样品，包括但不限于血浆、尿液；其中，所述检测所述待测物样品为将所述待测物样品制成质控样本和常规样本，同时检测。

作为本发明所述的基于LC-MS代谢组学中降低检测假阳性的方法的优选方案，其中：所述同时检测，其为将质控样本和常规样本的交替进样。

作为本发明所述的基于LC-MS代谢组学中降低检测假阳性的方法的优选方案，其中：所述数据库，其信息包括离子对信息、保留时间信息、DP、CE参数、R值、目标物信息中的一种或几种。

作为本发明所述的基于LC-MS代谢组学中降低检测假阳性的方法的优选方案，其中：所述第一离子对为大离子对，所述第二离子对为小离子对，所述R值为所述第一离子对的峰面积除以所述第二离子对的峰面积。

作为本发明的另一方面，本发明提供一种基于LC-MS代谢组学中降低检测假阳性的方法的应用，其为：适用于血浆、尿液等样品中氨基酸、核苷酸、维生素等类型的物质的检测。

本发明的有益效果：

1)相对于非靶的检测方法，使用广靶的检测方法，具有高灵敏的特点，对样本中的低含量物质有较好的检出；

2)相对与靶向的检测方法，使用广靶的检测方法，具有检测物质覆盖广的特点；

3)使用该广靶的方法，具有检测的物质准确的特点，可有效去除检测的假阳性物质。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：

图1为特征离子碎片与母离子通过多离子对方法组成A、B离子对结果图；

图2为本发明方法的结果图；

图3为验证结果对比图。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。

其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。

一种基于LC-MS代谢组学中降低检测假阳性的方法，主要步骤如下：

1)，通过质谱仪，获取碎片离子，可通过多离子对方法，选取标准品的2个特征离子碎片与母离子分别组成A、B离子对，离子对的选择是通过该物质的质谱图，看碎片的丰度，以及结合物质结构特性决定的，如某一代谢物的母离子为165.1，碎片离子分别有150.0，94.0，122.2，79.0，即A离子对为165.1-150.0，B离子对为165.1-122.2。此处以3-甲基黄嘌呤物质为例。

2)，优化去簇电压(DeclusteringPotential，DP)，调整碰撞能(CollisionEnergy，CE)值，降低代谢物检测时的背景干扰，提高检测代谢物的灵敏度，A、B离子对分别设值如下的DP，CE值通过MRM模式进行DPCE上机优化，通过比较峰面积(表1)分别获得A，B离子对的最优DP，CE值以及保留时间信息。

3)，通过计算A，B离子对在最优DPCE下的峰面积获的R值

R＝Area

4)，通过获得的代谢物的数据信息，将A、B离子对信息分别建立代谢物的A数据库与B数据库，A数据库是定量的离子对，B是用来定性的，B数据库只需要跑混样mix就可以。数据库结果见表2、3。

5)，按照一定的方法提取要检测的样本，分别吸取一定量的样本提取液做成质控混样。获取待测物中的目标物；

6)，将质控混样穿插在样本中间上机检测，质控混样的检测分别使用数据库A与数据库B进行跑样检测，而样本仅使用数据库A检测。

7)，通过混样中的A，B离子对的出峰情况与A，B离子对的比值R来对检测到的代谢物进行定性分析

8)，对于检测到的代谢物进行假阳性过滤，假阳性的判断标准为：满足其中之一，则结果为假阳性。

①质控混样中A，B离子对出峰保留时间之间偏差超过0.1min，

②质控混样中A，B离子对的出峰时间与数据库中保留时间偏差超过0.5min，

③质控混样中A，B离子对的比值R与数据库中的比值R偏差超过50％，

表1

表2 A数据库信息

表3 B数据库信息

实施例1：以血浆样本为例

1样本的制备

1.样本提取液的制备

从-80℃冰箱中取出冻存的血浆样本，在4℃下解冻后取一定量的血浆于EP管中，按体积比例为血浆：冰甲醇＝1:3加入冰甲醇(含内标，1ug/mL的二氯苯丙氨酸，0.5ug/mL的犬尿酸-d5，0.5ug/mL的马尿酸-d5，0.5ug/mL的苯氧基乙酸-d5，0.5ug/mL的L-肉碱-d3，0.5ug/mL的4-氟-2-苯基甘氨酸)，如100μL血浆加入300-500μL冰甲醇，涡旋30s，重复3次，在4℃条件下离心10min，取上清液于新的EP管中，放入-20℃冰箱中冷冻保存；

2.质控混样QCmix与QQmix的制备

分别取等量的3.1.1中制备所得的各样本的提取液，混合均匀后做为混样mix，混样mix等量分装，得QCmix与QQmix样本。

3.空白样本的制备

取一定量的水和乙腈按照1:1的比例混合制备50％的乙腈水溶液做为空白blank样本。

4上机检测

4.1色谱参数设置

进样量：2μL；

色谱柱：C18，2.1*100mm，1.8μm；

流动相A：水(含0.04％的乙酸)；

流动相B：乙腈0.04％的乙酸(含0.04％的乙酸)；

柱温：40℃；

流速：0.35mL/min；

洗脱梯度：0min＝5％B，10min＝95％B，10-11min＝95％B，11.1min＝5％B，11.1-14min＝5％B；

4.2质谱参数设置

喷雾电压(Ion SprayVoltage，IS)：5500V；

雾化温度(Temperature，TEM)：550℃；

气帘气(Curtain Gas，CUR)：35psi；

碰撞气(Colhsion Gas，CAD)：Medium；

雾化气(Ion Source Gasl，GSl)：50psi；

辅助气(Ion Source Gas2，GS2)：60psi；

扫描模式(Scan type)：Schedule MRM；

4.3离子对信息的设置

1)样本与QCmix样本的离子对设置

样本与QCmix的检测使用相同的方法sample method，sample method的部分离子对信息见附表1。

2)QQmix的样本的离子对设置

QQmix的检测分别使用QQmix-A method,QQmix-B method方法，QQmix-A,QQmix-B的部分离子对信息见附表2，3。

QCmix与样本使用sample method的是因为QCmix与样本不需要定性，samplemethod中只有定量的离子对，而QQmix是需要定性的，所以QQmix-A method,QQmix-Bmethod中有定性的离子对。

4.4样本的上机检测

检测样本前，连续重复进样QCmix 3次，计算QCmix中的6个内标的峰面积，发现6个内标的峰面积都在偏离平均值±15％以内，确定仪器设备运行稳定，然后按照如下的进样顺序对样本进行检测，整个检测过程中，要确保QCmix中的6个内标的峰面积都在偏离平均值±15％以内。

表4样本检测的进样顺序

5.样本的数据分析，

1)使用MultiQuan3.03软件建立分析方法对样品数据进行积分处理，获得代谢物峰面积积分表。

2)对检测到的目标代谢物通过QQ mix中的A，B离子对进行定性分析，去除假阳性，对于假阳性代谢物的的判断标准为：

①混样中A，B离子对出峰时间之间偏差超过0.1min，

②混样中A，B离子对的出峰时间与数据库中保留时间偏差超过0.5min，

③混样中A，B离子对的比值R与数据库中的比值R偏差超过50％，

3)通过对检测到的240个代谢物定性分析，发现其中81个代谢物属于假阳性。就是说，血浆样本中共检测出240个物质，我们通过双离子对的方法对这240个物质进行定性分析，发现有81个物质是鉴定错误的，是假阳性数据，是非目标物质。举例鉴定如：如离子对MEDP055数据库中的保留时间是0.85min，R＝59％，物质名称为高瓜氨酸，QQmix混样中的多离子对，定量离子对和定性离子对的保留时间分别是0.86、0.9min，R＝413％，QQmix混样中A，B离子对的比值R与数据库中的比值R偏差超过50％，所以样本中MEDP055离子对检测到的物质不是高瓜氨酸，是假阳性。

表5

表6

表7

6.方法的验证比较

1，为了验证多离子对方法的准确性，对检测到的240个物质使用相应的标品进行核查验证，通过标品的保留时间的比对和标品的二级谱图与样本中物质的二级谱图比较，确定物质的准确性，如下图3所示对240个代谢物使用标准品鉴定验证，发现使用双离子对的方法有227个物质鉴定准确，该方法的准确度为94.5％。

2，将该样本使用传统的方法，高分辨质谱Q-TOF检测分析，通过PeakView2.2，MasterView2.0软件对检测到的代谢物进行鉴定分析(见附图1)，发现只鉴定到了240个代谢物中的200个代谢物，且对检测到的200个代谢物进行核对分析，发现其中的178个物质鉴定准确，鉴定的准确度为89％。关于验证和数据分析及展示见批注。

Q-TOF因为灵敏度低，所以对物质的检出率较低，所以不能对240个物质都检测到。对与Q-TOF检测鉴定到的200个物质通过标品核对发现只有89％的物质是准确的。双离子对的方法鉴定不准确的原因是因为同分异构体物质的影响，如乙酰-谷氨酸的数据库的保留时间是1.16，R＝46.1％，但在检测的过程中QQmix混样在0.89min和1.2min处都有物质出峰，A，B离子对的面积比值R分别为30.5％，56.6％，都是不符合假阳性的判断标准的，故对于此类有同分异构体的物质干扰是无法排除假阳性的。

表8

表9

附表1

附表2

附表3

应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。