一种检测鱼粉中组胺含量的方法

摘要

本发明提供了一种检测鱼粉中组胺的茚三酮柱后衍生化法，包括：待测样品溶液制备、标准曲线建立、利用氨基酸分析仪检测。本发明利用柱后衍生法，通过设定缓冲溶液种类、PH值以及相关参数对组胺含量进行检测，相比现有技术中的柱前衍生法，前处理操作简单，检测耗时短，重复性好，具有良好的推广前景。

说明书

技术领域

本发明涉及分析化学技术领域，具体而言，尤其涉及一种检测鱼粉中组胺含量的柱后衍生化法。

背景技术

鱼粉是全鱼或经过分割的鱼体经过蒸煮、压榨、脱脂、干燥、粉碎获得的产品，蛋白质含量高，作为主要的饲料原料广泛用于饲料生产中。生产鱼粉的原料鱼新鲜度差或在贮藏过程中由于温度、湿度等环境的变化，会出现腐败变质的现象，在这一过程中会产生组胺。组胺为一种生物胺，存在于许多动、植物中，由组氨酸在脱羧酶的作用下形成，组胺含量是评价鱼粉蛋白质新鲜度的一个重要指标。组胺是生物胺中毒性最强的一种，组胺含量过高会对养殖动物产生危害，轻者引起过敏和中毒，并表现出一系列症状，例如呕吐、腹泻、呼吸困难、发热等，重者则会危及生命，严重时可导致死亡。因此，监控鱼粉中组胺的含量，是饲料企业保证饲料原料卫生安全的重要举措。

目前，组胺的检测方法有分光光度法、高效液相色谱法、气相色谱法、薄层色谱法、毛细管电泳法、酶联免疫吸附法等。其中高效液相色谱法应用较为广泛，由于组胺中没有荧光和紫外的发色基团，所以在使用高效液相色谱方法测定时，需要对样品进行衍生化处理。衍生化分为柱前衍生和柱后衍生，目前通常采用柱前衍生，其前处理操作繁琐耗时，衍生过程不易控制，并且衍生试剂都存在一定的弊端，有些衍生物不稳定，检测结果时常会出现平行样品结果不稳定的情况。因此，需要对现有的组胺检测方法进行改进，本发明旨在提供一种用氨基酸自动分析仪检测组胺的方法。

发明内容

根据上述提出的技术问题，本发明主要利用氨基酸自动分析仪对鱼粉中组胺的含量进行检测，此种检测方法前处理简单、耗时短、干扰少，可大大提高检测速度，检测准确度高。

本发明采用的技术手段如下：

一种检测鱼粉中组胺含量的方法，包括以下步骤：

(1)鱼粉样品经过粉碎机粉碎后，装入洁净的自封袋中，冷冻保存；

(2)样品溶液制备：取步骤(1)中粉碎后样品于棕色容量瓶中，加入磺基水杨酸溶液使其完全浸湿后，用磺基水杨酸溶液定容，超声提取后冷却静置至室温；取超声后上清液离心，过0.22μm微孔滤膜，即得待测的样品溶液；

(3)样品溶液检测：将步骤(2)所得样品溶液利用氨基酸自动分析仪分析；

(4)标准曲线建立：采用外标法，以组胺标准品浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线；

(5)结果判定：根据上述步骤获得待测样品的组胺峰面积，带入标准曲线计算得到样品溶液组胺浓度c，通过下述计算公式计算得到待测样品中的组胺含量，

其中，X—样品中组胺的含量，mg/kg；

c—样品溶液中组胺的浓度，μg/mL；

V—样品溶液的体积，mL；

n—稀释倍数；

m—样品的质量，g。

进一步地，磺基水杨酸溶液质量分数浓度为0.25％-3％。

进一步地，超声提取的时间为10-45min，中间每隔5min摇匀一次。

进一步地，离心时间为10min；离心机转速为8000r/min。

进一步地，步骤(3)中，氨基酸自动分析仪的色谱条件为：阳离子分离柱，30mm×4.6mm，进样体积50μL，柱温70℃；紫外检测器波长570nm；反应器温度140℃；衍生剂为茚三酮溶液，所述茚三酮溶液的流速为0.25mL/min；流动相为钾盐缓冲溶液，等度洗脱，流速为0.45mL/min；所述钾盐缓冲溶液包括缓冲液A和缓冲液B；再生液D流速为0.45mL/min；

所述等度洗脱为：

0～12.0min，缓冲液A：30％，缓冲液B：70％，再生液D：0％；

12.1～17.0min，缓冲液A：0％，缓冲液B：0％，再生液D：100％；

17.1～28.0min，缓冲液A：30％，缓冲液B：70％，再生液D：0％。

进一步地，缓冲液A的配制为：无水氢氧化钾11.2g，无水柠檬酸14.0g，无水氯化钾14.9g，辛酸0.1mL，一级水定容至1000mL；缓冲液B的配制为：无水氢氧化钾16.8g，无水柠檬酸16.0g，硼酸10g，无水氯化钾164.0g，辛酸0.1mL，一级水定容至1000mL；

茚三酮溶液的配制为：茚三酮40g，苯酚4g，抗坏血酸0.4g，甲醇1200mL，缓冲液800mL，混合均匀；所述缓冲液的配制为：196.0g醋酸钾，272.0g三水乙酸钠，200mL乙酸，用一级水定容1000mL；

再生液D的配制为：无水氢氧化钾33.7g，EDTA0.2g，一级水定容至1000mL。

进一步地，缓冲液A的pH值为5.45-5.50，所述缓冲液B的pH值为7.80-7.84。

进一步地，步骤(4)具体为：分别配制一系列不同浓度的组胺标准品溶液，利用氨基酸自动分析仪检测，测出一系列不同浓度的组胺标准品对应的峰面积，以组胺的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。

较现有技术相比，本发明具有以下优点：

1、本发明提供一种高效、安全、低成本的检测方法，所用仪器设备少，样品处理简单，检测时间相比于组胺国标检测方法缩减50％以上，单个样品处理费用相对组胺国标检测方法降低60％以上。

2、本发明检测方法所得结果具有良好的重复性和稳定性，相对标准偏差小，精确性高。

3、本发明检测方法操作简单易学，对人员要求较低，实用性更强，具有更好的应用前景。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图做以简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明组胺标准工作曲线；

图2为本发明实施例1检测样品结果谱图；

图3为本发明实施例6中按照实施例1步骤对质控样品检测结果谱图；

图4为本发明对比例1检测样品结果谱图；

图5为本发明对比例2检测样品结果谱图；

图6为本发明组胺标准溶液谱图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明技术方案作进一步描述。

设备及标准品选用如下：

氨基酸自动分析仪选用德国Sykam S433D型；

阳离子分离柱为Cation Separation Column LCA K17/K；

组胺标准品为C

本发明的检测步骤如下：

(1)鱼粉样品经过粉碎机粉碎后，装入洁净的自封袋中，冷冻保存；

(2)样品溶液制备：称取步骤(1)中粉碎后样品1000mg于25mL棕色容量瓶中，加入10mL的0.25％-3％的磺基水杨酸溶液，轻轻摇匀，将样品全部浸湿后，定容至25mL，超声提取10-45min，中间每隔5min摇匀一次，超声完成后冷却静置至室温；取超声后上清液10mL于离心机中离心10min，离心机转速为8000r/min；离心后过0.22μm微孔滤膜，即得待测的样品溶液；

(3)样品溶液检测：将步骤(2)所得样品溶液利用氨基酸自动分析仪分析；

(4)标准曲线建立：采用外标法，以组胺标准品浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，具体步骤如下：

(a)组胺标准储备溶液的配制：用十万分之一的天平准确称取组胺标准品9.96mg于10mL棕色容量瓶中，用一级水定容至刻度，摇匀，此溶液为组胺标准储备溶液，折算浓度是601.4μg/mL；

(b)组胺标准使用液的配制：将组胺标准储备溶液用一级水稀释10倍，至60.14μg/mL；

(c)组胺标准系列溶液的配制：组胺标准使用液稀释50、10、5、3、2.5倍，浓度分别为1.20μg/mL、6.01μg/mL、12.03μg/mL、20.05μg/mL、24.06μg/mL，现用现配；

(d)将组胺标准系列溶液利用氨基酸自动分析仪检测分析，以组胺浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制组胺标准曲线，如图1；

(5)结果判定：根据上述步骤获得待测样品的组胺峰面积，带入标准曲线计算得到样品溶液组胺浓度c，通过下述计算公式计算得到待测样品中的组胺含量，

其中，X—样品中组胺的含量，mg/kg；

c—样品溶液中组胺的浓度，μg/mL；

V—样品溶液的体积，mL；

n—稀释倍数；

m—样品的质量，g。

实施例1

检测鱼粉样品中组胺含量，步骤如下：

(1)称取鱼粉样品996.62mg，置于25mL棕色容量瓶中，加入10mL 0.25％的磺基水杨酸溶液，轻轻摇匀，溶液将样品全部浸湿，继续加入0.25％的磺基水杨酸溶液定容至25mL，超声提取10min，中间每隔5min摇匀一次，超声完成后，取出冷却静置至室温。取上清液10mL倒入50mL离心管中，于离心机中8000r/min，离心10min，将离心后上清液过0.22μm微孔滤膜，供氨基酸自动分析仪分析。

(2)氨基酸自动分析仪测定。色谱条件为：色谱柱：阳离子分离柱，30mm×4.6mm；流动相：缓冲液A+缓冲液B(30:70)，缓冲液A的pH值为5.48，所述缓冲液B的pH值为7.80；进样体积50μL；流速：缓冲泵0.45mL/min，试剂泵0.25mL/min；柱温：70℃；反应器温度：140℃。结果谱图如图2所示。

(3)结果计算。根据标准曲线及计算公式计算出样品中的组胺浓度，结果见表1。

实施例2

检测鱼粉样品中组胺含量，步骤如下：

(1)称取鱼粉样品978.02mg，置于25mL棕色容量瓶中，加入10mL 3％的磺基水杨酸溶液，轻轻摇匀，溶液将样品全部浸湿，继续加入3％的磺基水杨酸溶液定容至25mL，超声提取45min，中间每隔5min摇匀一次，超声完成后，取出冷却静置至室温。取上清液10mL倒入50mL离心管中，于离心机中8000r/min，离心10min，将离心后上清液过0.22μm微孔滤膜，供氨基酸自动分析仪分析。

(2)氨基酸自动分析仪测定。色谱条件：色谱柱：阳离子分离柱，30mm×4.6mm；流动相：缓冲液A+缓冲液B(30:70)，缓冲液A的pH值为5.48，所述缓冲液B的pH值为7.80；进样体积50μL；流速：缓冲泵0.45mL/min，试剂泵0.25mL/min；柱温：70℃；反应器温度：140℃。

(3)结果计算。根据标准曲线及计算公式计算出样品中的组胺浓度，结果见表1。

实施例3

检测鱼粉样品中组胺含量，步骤如下：

(1)称取鱼粉样品970.47mg，置于25mL棕色容量瓶中，加入10mL 1％的磺基水杨酸溶液，轻轻摇匀，溶液将样品全部浸湿，继续加入1％的磺基水杨酸溶液定容至25mL，超声提取30min，中间每隔5min摇匀一次，超声完成后，取出冷却静置至室温。取上清液10mL倒入50mL离心管中，于离心机中8000r/min，离心10min。将离心后上清液过0.22μm微孔滤膜，供氨基酸自动分析仪分析。

(2)氨基酸自动分析仪测定。色谱条件：色谱柱：阳离子分离柱，30mm×4.6mm；流动相：缓冲液A+缓冲液B(30:70)，缓冲液A的pH值为5.48，所述缓冲液B的pH值为7.80；进样体积50μL；流速：缓冲泵0.45mL/min，试剂泵0.25mL/min；柱温：70℃；反应器温度：140℃。

(3)结果计算。根据标准曲线及计算公式计算出样品中的组胺浓度，结果见表1。

表1实施例1-3检测结果(组胺含量mg/kg)

由表1可以看出，按照实施例1-3的方法均可以检测出样品中的组胺含量，且实施例3的提取效果更为彻底，精密度高。

实施例4

按照下列步骤绘制组胺标准曲线：

(a)组胺标准储备溶液的配制：用十万分之一的天平准确称取组胺标准品9.96mg于10mL棕色容量瓶中，用一级水定容至刻度，摇匀，此溶液为组胺标准储备溶液，折算浓度是601.4μg/mL；

(b)组胺标准使用液的配制：将组胺标准储备溶液用一级水稀释10倍，至60.14μg/mL；

(c)组胺标准系列溶液的配制：组胺标准使用液稀释50、10、5、3、2.5倍，浓度分别为1.20μg/mL、6.01μg/mL、12.03μg/mL、20.05μg/mL、24.06μg/mL，现用现配；

(d)将组胺标准系列溶液利用氨基酸自动分析仪检测分析，以组胺浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制组胺标准曲线，如图1；所得曲线方程为y＝441.6X-96.6，R

实施例5检测样品重复性

分别称取鱼粉样品958.87mg、996.66mg、1007.63mg、967.38mg、998.42mg、1040.34mg，按照实施例3的步骤检测样品，得到6次重复的样品含量结果如表2所示。

表2样品重复性

由表2可知，本发明的检测方法有良好的重复性。

实施例6质控样品含量测定

1.购买大连中食国食检测技术有限公司的质控样品，鱼肉粉，编号CFAPA-QC-056B-1，指定值452.8mg/kg，标准差64.9mg/kg。

2.分别按照实施例1-3和现行国标GB 5009.208-2016的步骤检测此样品。

3.时间比对。本发明前处理时间统计，仅需要超声10-45min，离心10min后即可上机检测样品。而国标方法需要提取、净化、衍生三大步骤，还包含3次氮吹步骤，前处理时间至少4小时，因此，本发明大大提高了检测效率。

4.经济成本比对。本发明前处理步骤涉及到的化学试剂少，仅有磺基水杨酸，上机检测用的试剂大部分为实验室常用盐类，无毒，对身体损伤小，试剂成本相对较低；而国标方法涉及到的化学试剂种类繁多，如三氯乙酸、氯化钠、正己烷、氢氧化钠、三氯甲烷、正丁醇、盐酸、氢氧化钠、谷氨酸钠、乙醚等等，大部分为有机试剂，成本高，且对人身体有害。

5.实验结果比对，见表3；按照实施例1的步骤检测质控样品的谱图见图3。

表3对质控样品的检测结果

GB 5009.208-2016中规定，精密度表示为两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10％。比较发现，本申请检测方法的精密度小于现行国标方法，这是由于现行国标方法处理步骤复杂，繁琐的步骤容易带入更多的实验误差，而本发明前处理简单，检测结果更接近指定值，且平行样结果之间的偏差小。

对比例1

(1)称取鱼粉样品1000mg，置于25mL棕色容量瓶中，加入10mL 1％的磺基水杨酸溶液，轻轻摇匀，溶液将样品全部浸湿，继续加入1％的磺基水杨酸溶液定容至25mL，超声提取30min，中间每隔5min摇匀一次，超声完成后，取出冷却静置至室温。取上清液10mL倒入50mL离心管中，于离心机中8000r/min，离心10min。将离心后上清液过0.22μm微孔滤膜，供氨基酸自动分析仪分析。

(2)氨基酸自动分析仪测定。色谱条件：色谱柱：阳离子分离柱，30mm×4.6mm；流动相：缓冲液A+缓冲液B(30:70)，缓冲液A的pH值为5.48，所述缓冲液B的pH值为7.58；进样体积50μL；流速：缓冲泵0.45mL/min，试剂泵0.25mL/min；柱温：70℃；反应器温度：140℃。

(3)上机检测得到谱图，见图4。

由图4可知，与本发明检测方法相比，改变检测条件后，无法得到组胺准确的峰面积，不能实现检测样品内组胺含量的目的。

对比例2

按照实施例3中的方法制备待测的样品溶液，将样品溶液用现行的GB/T18246-2019饲料中氨基酸的检测方法(Na盐缓冲液系统)上机检测，结果图谱无目标峰，见图5，说明用现行检测氨基酸的方法不能检测组胺。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。