重组NcoI限制性内切酶的制备方法

摘要

本发明提供了一种重组NcoI限制性内切酶的制备方法，包括以下步骤：一、合成NcoIM和NcoI的编码基因，分别构建至相应载体中，获得带有NcoIM基因的重组载体和融合了纯化标签的NcoI蛋白表达质粒；二、将带有NcoIM基因的重组载体转入大肠杆菌中，获得具备基底NcoIM表达的重组菌；三、制作成具备基底NcoIM表达的重组菌感受态细胞；四、将融合了纯化标签的NcoI蛋白表达质粒转入具备基底NcoIM表达的重组菌感受态细胞中，获得阳性单克隆，培养进行NcoI限制性内切酶的表达；五、NcoI限制性内切酶的纯化。通过本发明提供的方法可以获得大量的NcoI限制性内切酶，具有广阔的应用场景。

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学和细胞工程领域，具体涉及一种重组NcoI限制性内切酶的制备方法。

背景技术

NcoI是珊瑚红诺卡氏菌(Nocardia corallina)体内的一种二型限制性内切酶，其特点在于它特异性的识别双链DNA中的

发明内容

为了克服现有技术的难以获得大量NcoI蛋白的缺陷，本发明提供了一种重组NcoI限制性内切酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一、合成NcoIM编码基因，构建至原核表达载体，获得NcoIM表达质粒；合成NcoI编码基因，构建至带有纯化标签的原核表达载体，获得融合了纯化标签的NcoI蛋白表达质粒；NcoIM编码基因的DNA序列和NcoI编码基因的DNA序列分别根据NcoIM编码基因的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示和NcoI编码基因的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示优化且排除NcoI酶切位点获得；

步骤二、将NcoIM表达质粒转入不具备NcoIM天然表达特性的大肠杆菌感受态细胞中，获得具备基底NcoIM表达的重组菌；

步骤三、将步骤二获得的具备基底NcoIM表达的重组菌制作成具备基底NcoIM表达的重组菌感受态细胞；

步骤四、将步骤一得到的融合了纯化标签的NcoI蛋白表达质粒转入步骤三获得的具备基底NcoIM表达的重组菌感受态细胞中，获得阳性单克隆，培养进行NcoI限制性内切酶的表达；

步骤五、NcoI限制性内切酶的纯化。

进一步地，NcoIM编码基因的DNA及对应氨基酸序列如SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:3所示；NcoI编码基因的DNA及对应氨基酸序列如SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:4所示。或者NcoIM编码氨基酸序列与SEQ ID NO:3有95％及以上的相似度，NcoI编码氨基酸序列与SEQ IDNO:4有95％及以上的相似度。

进一步地，步骤一中的NcoIM的编码基因构建至原核表达载体pET16B；NcoI的编码基因构建至带有纯化标签的原核表达载体pET28A。

进一步地，步骤一具体为：使用高保真酶扩增NcoIM编码基因，同时以NcoI、BamHI限制性内切酶，双酶切pET16B载体后，通过同源重组方式插入至pET16B，确保读码框正确；使用高保真酶扩增NcoI编码基因，同时以NdeI、NotI限制性内切酶，双酶切pET29A载体后，通过同源重组方式插入至pET29A，确保读码框正确。

进一步地，步骤一中的纯化标签为MBP、GST、6*HIS中的一种或者多种。

进一步地，步骤二中的不具备NcoIM天然表达特性的大肠杆菌感受态细胞为BL21(DE3)感受态细胞。

进一步地，步骤五中采用亲和纯化层析、离子交换层析，或者亲和纯化层析、凝胶色谱层析，或者亲和纯化层析、离子交换层析、凝胶色谱层析进行NcoI限制性内切酶的纯化。

进一步地，还包括步骤六、NcoI限制性内切酶的酶活的测定。

进一步地，步骤六具体为：取不同稀释比的NcoI加入足量单位BamHI，在37℃下一小时，消化1μg鉴定用质粒，最终通过琼脂糖电泳确认酶的比活；鉴定所用质粒具有至少一个NcoI及BamHI识别位点。

进一步地，鉴定所用质粒的DNA序列如SEQ ID NO:9所示。

本发明通过利用表达NcoIM(NcoII甲基化酶)的特殊BL21(DE3)菌种，进行NcoI的表达。大肠杆菌中基底表达的NcoIM特异识别大肠杆菌基因组上的双链序列GAATTC，使两条链上A-3的特异性甲基化，保护基因组DNA不被NcoI内切酶切割，使大肠杆菌能够继续正常生长增殖。

传统方法将NcoI表达的构建质粒直接转入大肠杆菌中进行表达，NcoI限制菌种的正常增殖，无法拿到大量NcoI蛋白。本发明方法先将NcoIM表达基因构建至原核载体，并将其转入菌株，后以此菌株制备感受态细胞。后将NcoI内切酶构建至不同抗性的原核表达载体，转入表达NcoIM的感受态细胞中，进行表达纯化并最终得到高纯度的NcoI蛋白。

该方法利用常规易得的菌种BL21(DE3)，采取亲和纯化方案，操作简单易于实行，表达量高纯度高。

以下将结合附图对本发明作进一步说明，以充分说明本发明的目的、技术特征和技术效果。

附图说明

图1是NcoI限制性内切酶的酶切位点。

图2是本发明所涉及的重组NcoI限制性内切酶的制备方法的一个具体实施方式的操作流程图。

图3是实施例1中本发明构建好pET16b-NcoIM重组质粒的大肠杆菌感受态细胞与普通的BL21(DE3)(购自唯地生物)，转化融合了纯化标签的NcoI蛋白表达质粒涂布平板后的菌种生长效果。该平板为卡那和氨苄双抗性LB平板。左为普通的BL21(DE3)转化融合了纯化标签的NcoI蛋白表达质粒涂布平板后的菌种生长效果；右为pET16b-NcoIM重组质粒的大肠杆菌感受态细胞转化融合了纯化标签的NcoI蛋白表达质粒涂布平板后的菌种生长效果。

图4是金属离子螯合琼脂糖介质亲和纯化及离子交换层析后，经过凝胶色谱层析进一步纯化后的NcoI蛋白，SDS-PAGE胶图。

经凝胶色谱纯化后，蛋白峰不同取样管的跑胶确认。蛋白纯度在95％以上。

图5是构建有基因的商用pFastbac载体经过本发明得到的NcoI,及商用BamHI,NcoI双酶切割后琼脂糖凝胶电泳图。

反应条件为：20μl反应体系，10U NcoI，10U BamHI,反应缓冲体系：100mM NaCl,50mM Tris-HCl,10mM MgCl

具体实施方式

本发明所涉及的试剂和耗材均可以通过商业途径购买，除特别标注的外，均购自上海百赛生物技术股份有限公司。

实施例1

在该实施例中，本发明所涉及的重组NcoI限制性内切酶的制备方法的操作流程如图2所示。

步骤一、使用原核表达载体分别插入构建表达NcoIM的质粒和NcoI的质粒。

基因合成NcoIM编码基因的DNA序列如SEQ ID NO:1所示，和NcoI编码基因的DNA序列如SEQ ID NO:2所示。DNA序列合成设计时排除NcoI酶切位点，基因序列根据氨基酸序列(UniProt ID：NcoIM O85488；NcoI O85489)优化得到。NcoIM编码基因的氨基酸序列如SEQID NO:3所示；NcoI编码基因的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。

NcoIM编码基因(引物对如SEQ ID NO:5所示和如SEQ ID NO:6所示)和NcoI编码基因(引物对如SEQ ID NO:7所示和如SEQ ID NO:8所示)分别通过重组酶(Vazyme)介导的重组反应构建至原核表达载pET16B(NcoI/BamHI之间),pET28A(NdeI/HindIII之间)，并保证氨基酸翻译读码框正确，NcoIM不带有亲和纯化标签，NcoI带有亲和纯化标签，分别得到NcoIM表达质粒和融合了纯化标签的NcoI蛋白表达质粒。

步骤二、构建表达NcoIM蛋白的菌株。向不具备NcoIM天然表达特性的大肠杆菌转入NcoIM表达质粒，使其具备基底的NcoIM表达。

BL21感受态细胞-80℃取出后于冰上放置10min，后加入NcoIM表达质粒，缓慢吹打混匀，于冰上放置15min，后于42℃水浴锅中热激45s，取出在冰上放置10min，后加入1ml LB培养基于37℃摇床220rpm培养1hr。最后10000g离心去上清，菌体于氨苄抗性LB平板上涂布均匀。通过涂布氨苄抗性LB平板筛选出NcoIM成功转化进入的BL21大肠杆菌的克隆，即具备基底NcoIM表达的重组菌(pET16b-NcoIM重组质粒的大肠杆菌)。

步骤三、将步骤二所得到的具备基底NcoIM表达的重组菌通过常规化学处理制备为具有接收外来质粒能力的感受态细胞。

接菌：在已经转入NcoIM的BL21菌种平板上用镊子夹取枪头挑取BL21单克隆，接入装有5ml LB培养基的试管中。

小摇：将接完菌的试管放入摇床中，37℃，220rpm/min，培养8小时左右，待肉眼可见菌液完全浑浊后取出。

大摇：取1ml小摇后的BL21菌液接入装有250ml SOB的2L锥形瓶中，18℃，220rpm/min，培养过夜(此步骤应全程在超净台中进行操作SOB使用前需加入1.25ml 1M MgCl

测OD值：第二天测量OD值，当菌体OD值达到0.3-0.4左右时，将菌体倒入离心瓶中，冰浴30分钟，此时将重悬buffer放在冰上进行预冷，打开离心机进行预冷。

离心：4℃3000g离心10分钟，弃上清。

重悬：取50ml重悬buffer倒入离心瓶中，轻轻摇晃至菌体完全均匀，冰浴10分钟。

离心：4℃3000g离心10分钟，弃上清。

重悬及定量：取5-10ml重悬buffer倒入离心瓶中，轻轻摇晃至菌体完全均匀，将重悬后的菌液倒入一支带刻度的无菌50ml离心管中，取150μl菌液与2.85ml水加入比色皿中测OD值，OD值为0.5左右适宜，若OD值高于0.5可适量再加入重悬buffer，若OD值低于0.5待菌体沉淀后适量吸出重悬buffer。

在50ml离心管中加入体积为终体积7％的DMSO，盖上盖子缓慢颠倒混匀。快速的将菌体悬液快速分装进预冷灭菌的离心管中，然后置于于液氮浴中快速冷冻。将制作好的感受态细胞与-80℃冰箱保存。将1ng卡那抗性质粒通过热激转入制备好的感受态细胞中，涂布平板，次日通过长出的菌斑数量计算转化效率大于5*10^6。

步骤四、向步骤三得到的感受态细胞转入融合了纯化标签的NcoI蛋白表达质粒，并挑取平板上生长的单克隆(见图3中右边平板)进行培养并表达。右边平板上长出来的均是阳性单克隆；左边平板上没有长出单克隆是因为普通的BL21(DE3)不具有基底NcoIM表达的能力，其基因组对应位点没有被保护修饰，所以被NcoI切割使得大肠杆菌不能正常生长增殖，无法形成单克隆。

挑取pET16b-NcoIM重组质粒的大肠杆菌感受态细胞成功转入融合了纯化标签的NcoI蛋白表达质粒的单克隆接种至10ml氨苄(Ampicillin)，卡那(Kanamycin)双抗性的LB培养基中，于过夜摇床培养，次日接种于1L双抗的LB摇瓶中(即以1L表达体系为例)，220rpm37℃，摇床培养至摇至OD0.6-0.8，加入终浓度0.5mM的IPTG进行诱导，表达21小时。

步骤五、NcoI限制性内切酶的纯化

10000rcf离心力离心5min收集菌体，去除上清培养基，使用预冷buffer(100mMKCl,25mM Tris pH7.5)30ml悬浮菌体，后使用高压650bar进行破菌5min，破菌同时加入蛋白酶抑制剂，后14000rcf离心30min去除沉淀，上清加入相应的亲和纯化介质进行结合(Ni,Glutathione,Dextrin等)，以6*HIS标签为例，将50ml离心去沉淀的上清与2ml Ni-NTA(Qiagen)纯化介质混合，4-8℃结合2hr后，将beads滤出，并分别用0,10,15,25mM含咪唑缓冲液洗去杂蛋白，最后用含250mM咪唑缓冲液将目的蛋白洗下。跑SDS-PAGE胶确定纯度。之后将洗脱蛋白进行以AKTA(GE healthcare)介导的洗脱分离过程，进行离子交换层析或者凝胶色谱层析。离子交换层析，蛋白在约在330mM NaCl离子强度下洗出。凝胶色谱层析选用Hiload 16/600superdex 75pg(GE healthcare)型号柱，出峰洗脱柱体积位置约为65ml。最终SDS-PAGE确定纯度如图4所示，蛋白浓缩后通过A280吸光值结合消光系数确定最终蛋白质浓度。NcoIM虽然也过量表达，但由于其无亲和纯化标签，亲和纯化及后面的过柱纯化步骤，基本完全去除了NcoIM的残留。

步骤六、NcoI限制性内切酶的酶活的测定

一个单位被定义为在37℃下1小时内消化1μg线性化质粒DNA(BamHI消化物)，总反应体积为20μl所需的酶量。鉴定所用质粒的DNA序列如SEQ ID NO:9所示。

取不同稀释比的NcoI加入足量单位BamHI，在37℃下一小时，消化1μg质粒DNA，最终通过琼脂糖电泳确认酶的比活。

经过三次过柱(亲和纯化层析、离子交换层析、凝胶色谱层析)纯化去除了杂蛋白及NcoIM的污染，在最终纯化得到的产物中检测不到NcoIM活性。以1L表达体系为例，最终得到的NcoI内切酶总质量在约10mg/l,比活大6*10^6U/mg。

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思做出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

序列表

<110> 上海咏科生物科技有限公司

<120> 重组NcoI限制性内切酶的制备方法

<130> CN100-20003PICN

<160> 9

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1266

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 1

atgtctcaac cactgctgcc tctggatctg ccaatgactg gtcgtggtac gaacaccact 60

actttcgttg acaatatgcg cctgcctgtt caccgttggt tccgttactc cgctggcttt 120

tctgcccaat gggctcagtc cgtcattgca gaatctggtg cgcaacgtgt cctggaccca 180

tactctggca gcggcactac tgttattgct gctgaagaat ccggtgcagc cggtctgggt 240

gtggacgtac atccgttcgt cacccgcgtt gcgaaagcaa aactggcatg gcgcgcggaa 300

ccggatgttt ttctgaagcg tgccaaggct gttcgtatcg aggccgagcg tctgcaaccg 360

gttgaagaac cgccggctcc gctgatcgct aagtgtttcc cggaccgcca ggcactggta 420

gatctgctgc gtatccgtga cgcagttgaa cgtctgcgca ctggtgatca gtacgacgac 480

ctgctgtggc tggctctggt ctctattatt cgtgcatgct ctccagcagg cactgcgcaa 540

tggcagtacg tcctgccgaa caaaaccaaa tcccgtgttg ctgaaccact gtctgcgttc 600

gatattcgca ccgatctgtt cgcacaagat atgtgggcga tgcaggaaca tcacggcgca 660

ccggaggctc gtattatcga agctgatgcg cgcaccctgg atggcgttga agatggttgg 720

gctgacctga tcctgacttc cccgccgtac gcaaacaact tcgactacgc agacgcgact 780

cgtctggaac agagctttct gggcgaaatt agcggttggg gtgatctgaa accgctgcgt 840

aaaaagctga tgaaaagcgc aacccagcat atgggtggtt gggatgcagc agaagctctg 900

gaatctccgc tgctggaacc aatccgtgcg gagctgctgg gtgttttcga agaactgtct 960

caggtgaagc gtaccaaaag cggtaacaaa gcatatgacc tgatggtggc gggttacttt 1020

ctggactccg tacagacgct gtatgcactg cgtcgcgcat ctgctccggg tgttcaagtg 1080

tgttacgtag ttggtgattc cgctccatac ggtgtacacg ttccggttga acgttggctg 1140

ggtgaactgg ctctggcggc aggtttcaaa agctggcgtt ttgaaaaagt gcgtgatcgt 1200

aataccaaat ggaaaaaccg taagcacgac cacccgctgc atgagggtcg tctgtggatt 1260

gaaggc 1266

<210> 2

<211> 867

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 2

atggctactg ccccaggtca cctgctgggt cagatcattg gtaatgtgat ggaagaggct 60

ctgaaaccgg tgctgcagga aatggctgac cgtcacgacc tgtacctgga ctccaaaggt 120

ctgcgtccag gcgttcgttc tggtgccctg gtaacctgga ctgacgatct gggtaacaac 180

catgatctgg acttcgttct ggaacgcggc ggctctgcta ccaaagcggg taacccggct 240

gcgttcatcg aagcagcttg gcgtcgttac accaaacaca gcaaagccaa agcacaggaa 300

atccagggtg cggtactgcc ggttctggct gcttggaaca acgttaaacc gactcctgca 360

gcagttgtag caggccaatg gacggcccca tctctgcagc agatgcgttc caacggcttt 420

gtcgtgctgc acctgcactt cccgaccacc gcacaggtgt ttggtggcaa tggtatcaac 480

atcgaaggca ccggtgaagg taccccagac gccttctggc agcaacaatg cgacgcttac 540

acttctaaaa gcgaggcgga caaagatagc ctggctacgg cactgcgtac ggcacacgca 600

caggaatttc gtaccttcgt ggcagagctg gaacgccgtg tggtacgcgc tattgactat 660

gtcgttgtta ccccactgca tggccacggt tcccagtaca cctctattga aaacgcaatc 720

gaagctgtac gtacctattc ctgcggtgaa gaatctgcac cgttcctgcg tttcgaaatc 780

cgtatttcct atacgaacgg tgacgttatt caggctacct tcggtagctc ttctgacgct 840

attgaattcc tggacacttt caactaa 867

<210> 3

<211> 422

<212> PRT

<213> Nocardia corallina

<400> 3

Met Ser Gln Pro Leu Leu Pro Leu Asp Leu Pro Met Thr Gly Arg Gly

1 5 10 15

Thr Asn Thr Thr Thr Phe Val Asp Asn Met Arg Leu Pro Val His Arg

20 25 30

Trp Phe Arg Tyr Ser Ala Gly Phe Ser Ala Gln Trp Ala Gln Ser Val

35 40 45

Ile Ala Glu Ser Gly Ala Gln Arg Val Leu Asp Pro Tyr Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Thr Thr Val Ile Ala Ala Glu Glu Ser Gly Ala Ala Gly Leu Gly

65 70 75 80

Val Asp Val His Pro Phe Val Thr Arg Val Ala Lys Ala Lys Leu Ala

85 90 95

Trp Arg Ala Glu Pro Asp Val Phe Leu Lys Arg Ala Lys Ala Val Arg

100 105 110

Ile Glu Ala Glu Arg Leu Gln Pro Val Glu Glu Pro Pro Ala Pro Leu

115 120 125

Ile Ala Lys Cys Phe Pro Asp Arg Gln Ala Leu Val Asp Leu Leu Arg

130 135 140

Ile Arg Asp Ala Val Glu Arg Leu Arg Thr Gly Asp Gln Tyr Asp Asp

145 150 155 160

Leu Leu Trp Leu Ala Leu Val Ser Ile Ile Arg Ala Cys Ser Pro Ala

165 170 175

Gly Thr Ala Gln Trp Gln Tyr Val Leu Pro Asn Lys Thr Lys Ser Arg

180 185 190

Val Ala Glu Pro Leu Ser Ala Phe Asp Ile Arg Thr Asp Leu Phe Ala

195 200 205

Gln Asp Met Trp Ala Met Gln Glu His His Gly Ala Pro Glu Ala Arg

210 215 220

Ile Ile Glu Ala Asp Ala Arg Thr Leu Asp Gly Val Glu Asp Gly Trp

225 230 235 240

Ala Asp Leu Ile Leu Thr Ser Pro Pro Tyr Ala Asn Asn Phe Asp Tyr

245 250 255

Ala Asp Ala Thr Arg Leu Glu Gln Ser Phe Leu Gly Glu Ile Ser Gly

260 265 270

Trp Gly Asp Leu Lys Pro Leu Arg Lys Lys Leu Met Lys Ser Ala Thr

275 280 285

Gln His Met Gly Gly Trp Asp Ala Ala Glu Ala Leu Glu Ser Pro Leu

290 295 300

Leu Glu Pro Ile Arg Ala Glu Leu Leu Gly Val Phe Glu Glu Leu Ser

305 310 315 320

Gln Val Lys Arg Thr Lys Ser Gly Asn Lys Ala Tyr Asp Leu Met Val

325 330 335

Ala Gly Tyr Phe Leu Asp Ser Val Gln Thr Leu Tyr Ala Leu Arg Arg

340 345 350

Ala Ser Ala Pro Gly Val Gln Val Cys Tyr Val Val Gly Asp Ser Ala

355 360 365

Pro Tyr Gly Val His Val Pro Val Glu Arg Trp Leu Gly Glu Leu Ala

370 375 380

Leu Ala Ala Gly Phe Lys Ser Trp Arg Phe Glu Lys Val Arg Asp Arg

385 390 395 400

Asn Thr Lys Trp Lys Asn Arg Lys His Asp His Pro Leu His Glu Gly

405 410 415

Arg Leu Trp Ile Glu Gly

420

<210> 4

<211> 288

<212> PRT

<213> Nocardia corallina

<400> 4

Met Ala Thr Ala Pro Gly His Leu Leu Gly Gln Ile Ile Gly Asn Val

1 5 10 15

Met Glu Glu Ala Leu Lys Pro Val Leu Gln Glu Met Ala Asp Arg His

20 25 30

Asp Leu Tyr Leu Asp Ser Lys Gly Leu Arg Pro Gly Val Arg Ser Gly

35 40 45

Ala Leu Val Thr Trp Thr Asp Asp Leu Gly Asn Asn His Asp Leu Asp

50 55 60

Phe Val Leu Glu Arg Gly Gly Ser Ala Thr Lys Ala Gly Asn Pro Ala

65 70 75 80

Ala Phe Ile Glu Ala Ala Trp Arg Arg Tyr Thr Lys His Ser Lys Ala

85 90 95

Lys Ala Gln Glu Ile Gln Gly Ala Val Leu Pro Val Leu Ala Ala Trp

100 105 110

Asn Asn Val Lys Pro Thr Pro Ala Ala Val Val Ala Gly Gln Trp Thr

115 120 125

Ala Pro Ser Leu Gln Gln Met Arg Ser Asn Gly Phe Val Val Leu His

130 135 140

Leu His Phe Pro Thr Thr Ala Gln Val Phe Gly Gly Asn Gly Ile Asn

145 150 155 160

Ile Glu Gly Thr Gly Glu Gly Thr Pro Asp Ala Phe Trp Gln Gln Gln

165 170 175

Cys Asp Ala Tyr Thr Ser Lys Ser Glu Ala Asp Lys Asp Ser Leu Ala

180 185 190

Thr Ala Leu Arg Thr Ala His Ala Gln Glu Phe Arg Thr Phe Val Ala

195 200 205

Glu Leu Glu Arg Arg Val Val Arg Ala Ile Asp Tyr Val Val Val Thr

210 215 220

Pro Leu His Gly His Gly Ser Gln Tyr Thr Ser Ile Glu Asn Ala Ile

225 230 235 240

Glu Ala Val Arg Thr Tyr Ser Cys Gly Glu Glu Ser Ala Pro Phe Leu

245 250 255

Arg Phe Glu Ile Arg Ile Ser Tyr Thr Asn Gly Asp Val Ile Gln Ala

260 265 270

Thr Phe Gly Ser Ser Ser Asp Ala Ile Glu Phe Leu Asp Thr Phe Asn

275 280 285

<210> 5

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 5

ttaactttaa gaaggagata taatgtctca accactgctg 40

<210> 6

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 6

ttcgggcttt gttagcagcc ttagccttca atccacag 38

<210> 7

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 7

ctttaagaag gagatataca atggctactg ccccaggt 38

<210> 8

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 8

ggtgctcgag tgcggccgcg ttgaaagtgt ccaggaatt 39

<210> 9

<211> 7391

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 9

gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg cagcgtgacc 60

gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc ctttctcgcc 120

acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg gttccgattt 180

agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc acgtagtggg 240

ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt ctttaatagt 300

ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc ttttgattta 360

taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta acaaaaattt 420

aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaatttcag gtggcacttt tcggggaaat 480

gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta tccgctcatg 540

agacaataac cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa ggaagagtat gagtattcaa 600

catttccgtg tcgcccttat tccctttttt gcggcatttt gccttcctgt ttttgctcac 660

ccagaaacgc tggtgaaagt aaaagatgct gaagatcagt tgggtgcacg agtgggttac 720

atcgaactgg atctcaacag cggtaagatc cttgagagtt ttcgccccga agaacgtttt 780

ccaatgatga gcacttttaa agttctgcta tgtggcgcgg tattatcccg tattgacgcc 840

gggcaagagc aactcggtcg ccgcatacac tattctcaga atgacttggt tgagtactca 900

ccagtcacag aaaagcatct tacggatggc atgacagtaa gagaattatg cagtgctgcc 960

ataaccatga gtgataacac tgcggccaac ttacttctga caacgatcgg aggaccgaag 1020

gagctaaccg cttttttgca caacatgggg gatcatgtaa ctcgccttga tcgttgggaa 1080

ccggagctga atgaagccat accaaacgac gagcgtgaca ccacgatgcc tgtagcaatg 1140

gcaacaacgt tgcgcaaact attaactggc gaactactta ctctagcttc ccggcaacaa 1200

ttaatagact ggatggaggc ggataaagtt gcaggaccac ttctgcgctc ggcccttccg 1260

gctggctggt ttattgctga taaatctgga gccggtgagc gtgggtctcg cggtatcatt 1320

gcagcactgg ggccagatgg taagccctcc cgtatcgtag ttatctacac gacggggagt 1380

caggcaacta tggatgaacg aaatagacag atcgctgaga taggtgcctc actgattaag 1440

cattggtaac tgtcagacca agtttactca tatatacttt agattgattt aaaacttcat 1500

ttttaattta aaaggatcta ggtgaagatc ctttttgata atctcatgac caaaatccct 1560

taacgtgagt tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa aggatcttct 1620

tgagatcctt tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc accgctacca 1680

gcggtggttt gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt aactggcttc 1740

agcagagcgc agataccaaa tactgtcctt ctagtgtagc cgtagttagg ccaccacttc 1800

aagaactctg tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc agtggctgct 1860

gccagtggcg ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt accggataag 1920

gcgcagcggt cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga gcgaacgacc 1980

tacaccgaac tgagatacct acagcgtgag cattgagaaa gcgccacgct tcccgaaggg 2040

agaaaggcgg acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg cacgagggag 2100

cttccagggg gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca cctctgactt 2160

gagcgtcgat ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa cgccagcaac 2220

gcggcctttt tacggttcct ggccttttgc tggccttttg ctcacatgtt ctttcctgcg 2280

ttatcccctg attctgtgga taaccgtatt accgcctttg agtgagctga taccgctcgc 2340

cgcagccgaa cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga gcgcctgatg 2400

cggtattttc tccttacgca tctgtgcggt atttcacacc gcagaccagc cgcgtaacct 2460

ggcaaaatcg gttacggttg agtaataaat ggatgccctg cgtaagcggg tgtgggcgga 2520

caataaagtc ttaaactgaa caaaatagat ctaaactatg acaataaagt cttaaactag 2580

acagaatagt tgtaaactga aatcagtcca gttatgctgt gaaaaagcat actggacttt 2640

tgttatggct aaagcaaact cttcattttc tgaagtgcaa attgcccgtc gtattaaaga 2700

ggggcgtggc caagggcatg gtaaagacta tattcgcggc gttgtgacaa tttaccgaac 2760

aactccgcgg ccgggaagcc gatctcggct tgaacgaatt gttaggtggc ggtacttggg 2820

tcgatatcaa agtgcatcac ttcttcccgt atgcccaact ttgtatagag agccactgcg 2880

ggatcgtcac cgtaatctgc ttgcacgtag atcacataag caccaagcgc gttggcctca 2940

tgcttgagga gattgatgag cgcggtggca atgccctgcc tccggtgctc gccggagact 3000

gcgagatcat agatatagat ctcactacgc ggctgctcaa acctgggcag aacgtaagcc 3060

gcgagagcgc caacaaccgc ttcttggtcg aaggcagcaa gcgcgatgaa tgtcttacta 3120

cggagcaagt tcccgaggta atcggagtcc ggctgatgtt gggagtaggt ggctacgtct 3180

ccgaactcac gaccgaaaag atcaagagca gcccgcatgg atttgacttg gtcagggccg 3240

agcctacatg tgcgaatgat gcccatactt gagccaccta actttgtttt agggcgactg 3300

ccctgctgcg taacatcgtt gctgctgcgt aacatcgttg ctgctccata acatcaaaca 3360

tcgacccacg gcgtaacgcg cttgctgctt ggatgcccga ggcatagact gtacaaaaaa 3420

acagtcataa caagccatga aaaccgccac tgcgccgtta ccaccgctgc gttcggtcaa 3480

ggttctggac cagttgcgtg agcgcatacg ctacttgcat tacagtttac gaaccgaaca 3540

ggcttatgtc aactgggttc gtgccttcat ccgtttccac ggtgtgcgtc acccggcaac 3600

cttgggcagc agcgaagtcg aggcatttct gtcctggctg gcgaacgagc gcaaggtttc 3660

ggtctccacg catcgtcagg cattggcggc cttgctgttc ttctacggca aggtgctgtg 3720

cacggatctg ccctggcttc aggagatcgg aagacctcgg ccgtcgcggc gcttgccggt 3780

ggtgctgacc ccggatgaag tggttcgcat cctcggtttt ctggaaggcg agcatcgttt 3840

gttcgcccag gactctagct atagttctag tggttggcta cgtatactcc ggaatattaa 3900

tagatcatgg agataattaa aatgataacc atctcgcaaa taaataagta ttttactgtt 3960

ttcgtaacag ttttgtaata aaaaaaccta taaatattcc ggattattca taccgtccca 4020

ccatcgggcg caaggaggcc ttgaatggga ttctccaggg gttcagggtc atctactggg 4080

ccaacctcat agacggagag ctgggcgaga ttaagaacgt caccaccacg cagccttcct 4140

tggagttgga tggactagag aaatacacca actacagtat ccaggtcctg gccttcaccc 4200

gtgcagggga tggcgtccgg agcgagcaga tctttacccg taccaaggag gacgttccag 4260

gtcctcctgc cggtgtcaag gcggcggcag cctcggcctc tatggtcttc gtgtcctggc 4320

tgcccccgct gaagctgaac ggcatcattc ggatccaaag ccaccatcag tcccagaaag 4380

gttaaaagca gcgtgggcag ccaggtctcc ttatcctgca gtgtgacagg aaatgaagac 4440

caggaactct cctggtaccg aaatggcgaa atcctcaacc ctggaaaaaa cgtgaggatc 4500

acaggactca accacgcaaa ccttataatg gatcacatgg tcaagagtga tgggggtgcc 4560

taccagtgct ttgtgcgcaa ggacaagcta tctgctcaag actatgtcca ggtggtcctt 4620

gaagacggaa ctcccaaaat catttctgcc tttagcgaga aagtggtgag cccggcagag 4680

ccagtgtccc tcgtgtgcaa tgtgaagggt acacccttgc ccacggtcac ctggaccctg 4740

gacgatgacc ccatcctcaa gggcagcggt caccgcatca gccaaatgat cacgtccgag 4800

gggaacgtgg tcagctacct gaatatctcc agctcccagg tccgggatgg gggtgtctac 4860

cgctgcactg ccaacaactc ggctggagtc gtcctgtacc aggctcgaat aaacgtaaga 4920

gggcctgcaa gcatcagacc aatgaaaaac atcactgcga tagcggggcg tgacacgtac 4980

atccactgcc gcgtaattgg ctatccgtat tactccatca agtggtacaa gaacgctaac 5040

ctgcttcctt tcaaccaccg ccaggtggcg tttgagaaca atgggactct gaaactctct 5100

gatgtgcaga aagaagttga cgagggagag tacacgtgta atgtgctggt acagccacag 5160

ctctccacca gccagagtgt ccacgtgaca gtgaaagttc cacctttcat ccaacctttt 5220

gagttcccaa gattctccat cgggcagcgg gttttcatcc catgtgtggt ggtctcaggg 5280

gacttaccca tcaccatcac ctggcagaag gatggccggc caattccagc aagcctcgga 5340

gtaaccattg acaacattga cttcaccagc tccctgagga tctccaacct ctccctaatg 5400

cacaatggga attacacctg cattgcgaga aacgaggcag cagccgtgga acaccagagt 5460

cagctgattg tgagagttcc ccctaagttc gtggtacagc cccgggacca ggacgggatc 5520

tatggcaaag cagtgattct caattgctct gcagagggtt atcctgtgcc tacaattgtg 5580

tggaaattct caaaaggtgc tggggtcccc cagttccagc caattgcctt gaatggccga 5640

atccaggtcc tgagtaatgg ctcactcttg atcaagcatg ttgtagaaga agacagtggc 5700

tactacctct gcaaggtcag caacgatgtg ggcgcagacg tcagcaagtc catgtacctc 5760

acagtgaaaa ttcctgccat gataacctct taccccaaca ccaccctggc cactcagggt 5820

caaaggaagg aaatgagctg cacagccaat ggggagaagc ccatcattgt ccgctgggag 5880

aaagaggaca ggatcattaa ccctgaaatg gcccgctacc tggtatccac caaggaggtg 5940

ggagaggaag tgatatctac gctgcagatt ttgccaacag tgagagaaga ttccggtttc 6000

ttctcctgcc atgctatcaa ttcatacggg gaggaccgtg gaataattca actcacagtg 6060

caagaacccc cagatcctcc cgagattgag atcaaagatg tcaaagctcg caccatcacg 6120

ctcaggtgga ctatggggtt tgatggcaac agccccatca caggctatga cattgaatgc 6180

aaaaataaat cagactcctg ggattctgct caaagaacca aagatgtttc ccctcagctg 6240

aactcggcca ccatcattga tatccaccct tcctccacct acagcatccg catgtacgcc 6300

aagaaccgga ttggcaagag tgagcccagc aacgagatca ccatcacggc ggatgaggca 6360

gctcctgatg gtccacctca ggaagttcac ttggaaccca cctcatctca gagtatcagg 6420

gttacctgga aggctcccaa gaaacactta caaaacggga tcattcgcgg ctaccaaata 6480

ggctaccggg agtacagcac ggggggtaac ttccagttca acatcatcag tatcgacacc 6540

accggggaca gcgaagtgta caccctggac aacctgaata agttcacgca gtatggcctg 6600

gtagtacagg cttgcaaccg ggccggcaca ggaccttctt ctcaggagat catccatggc 6660

ggtccgaagc gcgcggaatt caaaggccta cgtcgacgag ctcactagtc gcggccgctt 6720

tcgaatctag acatcaccat caccatcact agagcttgtc gagaagtact agaggatcat 6780

aatcagccat accacatttg tagaggtttt acttgcttta aaaaacctcc cacacctccc 6840

cctgaacctg aaacataaaa tgaatgcaat tgttgttgtt aacttgttta ttgcagctta 6900

taatggttac aaataaagca atagcatcac aaatttcaca aataaagcat ttttttcact 6960

gcattctagt tgtggtttgt ccaaactcat caatgtatct tatcatgtct ggatctgatc 7020

actgcttgag cctaggagat ccgaaccaga taagtgaaat ctagttccaa actattttgt 7080

catttttaat tttcgtatta gcttacgacg ctacacccag ttcccatcta ttttgtcact 7140

cttccctaaa taatccttaa aaactccatt tccacccctc ccagttccca actattttgt 7200

ccgcccacag cggggcattt ttcttcctgt tatgttttta atcaaacatc ctgccaactc 7260

catgtgacaa accgtcatct tcggctactt tttctctgtc acagaatgaa aatttttctg 7320

tcatctcttc gttattaatg tttgtaattg actgaatatc aacgcttatt tgcagcctga 7380

atggcgaatg g 7391