限制性内切酶NcoⅠ的高效重组表达、硒代与结晶条件初步筛选

摘要

来源于珊瑚诺卡氏菌Nocardia corallina的限制性内切酶NcoⅠ是基因工程中常用的工具酶之一.然而目前NcoⅠ蛋白质三维结构尚未被解析,对其基因改造缺乏理论指导.为了解析NcoⅠ的三维结构,采用大肠杆菌表达系统,高效重组表达和纯化,获得了纯度＞95％的NcoⅠ野生型和Se-NcoⅠ硒代蛋白.质谱分析表明,重组Se-NcoⅠ蛋白中所有硫原子成功被硒原子取代.酶切实验表明,硒代蛋白与野生型具有相似的限制酶活性.采用坐滴法筛选重组NcoⅠ蛋白结晶条件,已在3种条件下获得针状晶体,1种条件下获得颗粒状晶体.X射线衍射初步分析晶体分辨率在0.8 nm左右,为下一步解析NcoⅠ三维结构提供了基础.