唇香草协同伽师新梅总黄酮提取物及其制备方法和应用

摘要

本发明公开了唇香草协同伽师新梅的总黄酮提取物及其提取方法和应用，通过预处理伽师新梅和唇香草、优化二者混合比例及提取工艺，确保了唇香草协同伽师新梅总黄酮类物质得率，有效保证了唇香草协同伽师新梅总黄酮类物质的纯度。同时，将本发明提供的唇香草协同伽师新梅的总黄酮提取物应用于抗炎药物的制备中，结果发现，本发明提供的唇香草协同伽师新梅的总黄酮提取物在抗炎方面具有显著的协同增效作用，同时对心肌细胞缺氧‑复氧具有一定的保护作用，因而，在制备炎症性以及心血管疾病的预防和治疗药物领域具有广泛的应用价值。

说明书

技术领域

本发明主要涉及植物有效成份的提取、纯化和应用的技术领域，具体地说，本发明涉及一种唇香草协同伽师新梅的总黄酮提取物及其制备方法和应用。

背景技术

西梅属于蔷薇科李属欧洲李种，其果肉芳香甜美、口感润滑，且富含维生素、抗氧化级、食物纤维素、同时兼含铁和钾等矿物质，不含脂肪和胆固醇，深受消费者青睐，目前对于西梅提取黄酮类物质鲜有报道，究其原因，有其含量低或者提取技术困难等现有技术现状。新疆伽师县的气候特别，主要表现为光热丰富、降水稀少、积温高等，这些特殊的气候特点赋予了西梅最佳品质，伽师新梅已成为特定新品种值得深入研究，研究表明，伽师新梅中可能含有大量抗氧化物质，能中和自由基，对人体有预防细胞病变、延缓衰老的作用，另外，其有效成分对与骨质疏松、动脉硬化、高胆固醇血症以及肝炎均有一定的疗效，具体作用机制有待进一步研究，其有效抗氧化物质的提取和纯化鲜有报道，且在技术上存在一定的难度，现有技术未见有关对于新品种伽师新梅提取总黄酮类物质的报道，也未见有关将伽师新梅与相关协同提取有效成分的报道。

唇香草(Ziziphora clinopodioides Lam)为唇形科新塔花属多年生半灌木草本植物唇香草的干燥地上部分，别名芳香新塔花、小叶薄荷、山薄荷等，维吾尔民族名字为苏则。唇香草全株有强烈的薄荷香气，喜生于低山坡、草地及干旱坡地上，是新疆特有药材，主要分布于我国新疆的阿勒泰山、天山、准噶尔西部山地、帕米尔高原的山地草原及砾石质坡地，中亚的哈萨克斯坦、吉尔吉斯斯坦、蒙古亦有分布。唇香草性味辛、凉、微苦，具有强心利湿、理气化痰、消炎散结的功效，用于治疗心脏病、气短多汗、水肿、咳嗽、气管炎、肺脓肿等疾病，尤其在治疗心脏病和高血压疾病方面有很好的疗效。唇香草主要化学成分为挥发油、黄酮、生物碱、维生素、有机酸、苷类、微量元素等。目前唇香草提取物作为维药的重要组成部分，已经被广泛的应用于医药行业，唇香草用于治疗高血压和冠心病等心血管疾病，疗效确切，黄酮类成分是其代表性成分，具有保护心血管的作用。对于唇香草功能成分的提取，目前主要进行的是总黄酮、挥发油等成分的单独提取，通过提取方法、工艺的优化目前提取率及药效已经没有进一步提升的空间，在实际应用的过程中，唇香草总黄酮的提取率及应用药效还需要进一步提升，而目前的工艺及原料在提取率和药效方面提高的空间是有限的，能否将唇香草与其他植物协同提取相应的有效成分，探索如何将唇香草与其他植物相结合对于总黄酮类物质的提取是否具有增效作用，同时丰富其功能成分，提高其药效，拓展应用的范围，降低成本，目前尚无专利和文献报道。

发明内容

本发明针对伽师新梅抗氧化物质提取存在的问题以及唇香草总黄酮提取效率和实际药效进一步需提升的技术现状，且目前尚无无文献和专利报道有关伽师新梅联合唇香草提取总黄酮的方法及应用，旨在于探索能否将唇香草与其他植物协同提取相应的有效成分，探索如何将唇香草与其他植物相结合对于总黄酮类物质的提取是否具有增效作用，是否具有协同提高其药效，拓展其应用范围。本发明提供一种唇香草协同伽师新梅的总黄酮提取物及其制备方法和应用，通过预处理伽师新梅和唇香草、优化二者混合比例及提取工艺，确保了唇香草协同伽师新梅的总黄酮得率，有效保证了唇香草协同伽师新梅总黄酮类物质的纯度，当乙醇浓度为60％；料液比为1:50时，此时唇香草协同伽师新梅的总黄酮类物质得率可达11.64％；采用X-5大孔树脂进行唇香草协同伽师新梅总黄酮类物质的纯化，当上样液的pH＝3.0，上样液流速为4BV/h，上样量为70mL时，唇香草协同伽师新梅的总黄酮类物质含量由原来21.87％经过分离纯化后为 39.44％，提高了17.57％。同时，将本发明唇香草协同伽师新梅的总黄酮提取物应用于抗炎药物的制备中，结果发现，本发明提供的唇香草协同伽师新梅的总黄酮提取物在抗炎方面具有显著的协同增效作用，同时对心肌细胞缺氧-复氧具有一定的保护作用，因而，在制备炎症性以及心血管疾病的预防和治疗药物领域具有广泛的应用价值。

为了达到以上技术目的，本发明采用的技术方案：

本发明具体提供一种唇香草协同伽师新梅的总黄酮提取物，该提取物的提取方法具体包括如下步骤：

(1)将唇香草唇香草晒干后用粉碎机粉碎，药材粉末过二号筛。

(2)取新鲜的伽师新梅清洗干净，干燥后粉碎，过二号筛。

(3)取唇香草粉与伽师新梅粉按照质量比(4～8)：1混合均匀后置于250ml 锥形瓶中，加入50ml浓度为40-80％的乙醇料液比为1：(40～80)于50℃进行超声30min，功率130W，抽滤，溶解滤饼，提取抽滤两次，合并滤液，减压回收溶剂至干，加30％乙醇溶解，用石油醚萃取除去脂溶性色素，弃去醚层，用石油醚萃取2次，再用30％乙醇定容至50ml容量瓶，作为提取液备用。

(4)将步骤(3)所得提取液与X-5大孔吸附树脂上样液质量浓度为 0.6601mg/mL、上样流速为2-6BV/h，上样量10-100mL，上柱p H值为1.0-5.0 的条件下纯化，用蒸馏水洗脱除杂后，用5BV/h60％乙醇洗脱出黄酮类化合物，收集洗脱液，置于4℃冰箱保存备用，即得唇香草联合伽师新梅总黄酮提取物。

本发明唇香草协同伽师新梅的总黄酮提取物的提取方法中，唇香草粉与伽师新梅粉按照6:1的质量比混合，乙醇浓度为60％，料液比为1:50。

本发明唇香草协同伽师新梅总黄酮提取物的提取方法中，X5大孔树脂纯化中，上样流速为4BV/h，上样量为70mL。

通过实施以上技术方案，本发明获得以下技术效果：

(1)本发明提供的唇香草协同伽师新梅的总黄酮提取物，采用的提取方法确保了唇香草协同伽师新梅总黄酮类物质的得率，有效保证了唇香草协同伽师新梅总黄酮类物质的纯度，当乙醇浓度为60％；料液比为1:50时；此时总黄酮得率可达11.64％；采用X-5大孔树脂，上样液的pH＝3.0，上样液流速为4BV/h，上样量为70mL时，唇香草协同伽师新梅总黄酮类物质的含量由原来21.87％经过分离纯化后为39.44％，提高了17.57％。

(2)利用本发明提供的唇香草协同伽师新梅的总黄酮提取物提提取方法，在保障唇香草黄酮类物质提取率的基础上，同时增加了伽师新梅的抗氧化功能成分，将其应用于制备抗炎和心血管疾病的药物中应用，本发明提供的唇香草联合伽师新梅总黄酮提取物，与单纯唇香草总黄酮提取物相比，在抗炎方面具有显著的协同增效作用，同时对心肌细胞缺氧-复氧具有一定的保护作用，因而，在制备炎症性以及心血管疾病的预防和治疗药物领域具有广泛的应用价值。

(3)本发明提供的唇香草协同伽师新梅的总黄酮提取物，两种原料来源广泛，不仅降低了成本，且提取工艺简单易操作，对于拓展唇香草和伽师新梅的应用领域提供数据支持。

具体实施方式

下面举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下属实施例。

本发明采用的唇香草、伽师新梅、无水乙醇和水均可通过公共渠道购买，工艺中所采用的的设备和仪器均为本领域常见的设备。

本发明中选用的所有材料、实际和仪器的测定方法都为本领域熟知的但不限制本发明的实施，其它本领域熟知的一些试剂和设备都可以适用于本发明以下实施方式的实施。

实施例1：唇香草协同伽师新梅的总黄酮提取物

一种唇香草协同伽师新梅的总黄酮提取物，该提取物的提取方法具体包括如下步骤：

(1)将唇香草唇香草晒干后用粉碎机粉碎，药材粉末过二号筛。

(2)取新鲜的伽师新梅清洗干净，干燥后粉碎，过二号筛。

(3)取唇香草粉与伽师新梅粉按照质量比(4～8)：1混合均匀后置于250ml 锥形瓶中，加入50ml浓度为40-80％的乙醇料液比为1：60于50℃进行超声 30min，功率130W，抽滤，溶解滤饼，提取抽滤两次，合并滤液，减压回收溶剂至干，加30％乙醇溶解，用石油醚萃取除去脂溶性色素，弃去醚层，用石油醚萃取2次，再用30％乙醇定容至50ml容量瓶，作为提取液备用。

(4)将步骤(3)所得提取液与X-5大孔吸附树脂上样液质量浓度为 0.6601mg/mL、上样流速为1-6BV/h，上样量10-100mL，上柱p H值为1.0-5.0 的条件下纯化，用蒸馏水洗脱除杂后，用5BV/h60％乙醇洗脱出黄酮类化合物，收集洗脱液，置于4℃冰箱保存备用，即得唇香草协同伽师新梅的总黄酮提取物。

实施例2：唇香草协同伽师新梅提取总黄酮的提取物

本实施例在实施例1唇香草协同伽师新梅的总黄酮提取物的提取方法的基础上，优先采用香草粉与伽师新梅粉按照6:1的质量比混合，乙醇浓度为60％，料液比为1:40；X-5大孔树脂纯化中，上样流速为4BV/h，上样量为70mL。

实施例3：唇香草协同伽师新梅的总黄酮提取物

本实施例在实施例1唇香草协同伽师新梅的总黄酮提取物的提取方法的基础上，优先采用唇香草与伽师新梅汁的质量比4:1混合，乙醇浓度为40％，料液比为1:40；X-5大孔树脂纯化中，上样流速为2BV/h，上样量为60mL。

实施例4：唇香草协同伽师新梅的总黄酮提取物

本实施例在实施例1唇香草协同伽师新梅的总黄酮提取物的提取方法的基础上，优先采用唇香草与伽师新梅汁的质量比8:1混合，乙醇浓度为80％，料液比为1:60；X-5大孔树脂纯化中，上样流速为6BV/h，上样量为100mL。

实施例5：唇香草协同伽师新梅的总黄酮提取物

本实施例在实施例1唇香草协同伽师新梅的总黄酮提取物的提取方法的基础上，优先采用唇香草与伽师新梅汁的质量比7:1混合，乙醇浓度为60％，料液比为1:50；X-5大孔树脂纯化中，上样流速为4BV/h，上样量为70mL。

实施例6：唇香草协同伽师新梅的总黄酮提取物的提取方法的优化

本实施例在实施例1-5提供的唇香草协同伽师新梅的总黄酮提取物提取方法的基础上，对唇香草联合伽师新梅总黄酮提取物的提取方法的参数进行优化，主要考察唇香草粉与伽师新梅粉(A)、乙醇浓度(B)、纯化上样量(C)对总黄酮的提取率的影响进行试验。

本试验分别探究唇香草粉与伽师新梅粉(A)、乙醇浓度(B)、纯化上样量 (C)对总黄酮的提取率的影响，在单因素试验的基础上进行三因素三水平正交试验，正交试验因素与水平表见表1。

表1：正交试验因素与水平表

正交优化提取条件下制备的唇香草协同伽师新梅的总黄酮提取物对提取率的影响，每个试验组做3个平行，试验结果及分析参见表2所示。

表2：正交试验结果及分析

在试验设计的范围内，结合表2可以看出，唇香草粉与伽师新梅粉(A)、料液比(C)和乙醇浓度(B)对总黄酮的提取率的影响依次降低，得到最佳优化条件为A

实施例7：唇香草协同伽师新梅的总黄酮提取物的应用

本实施例在实施例1-6提供的唇香草协同伽师新梅的总黄酮提取物提取方法的基础上，将提取的唇香草协同伽师新梅的总黄酮提取物应用于制备抗炎药物中。

建立肉芽肿炎症小鼠模型，以阳性药为对照(DMX，5mg/kg)，给药剂量为 20mg/kg，模型组给予相同剂量的生理盐水，每天灌胃1次，连续给药7d，分别考察本发明实施例2提取方法得到的唇香草联合伽师新梅总黄酮提取物(A)、唇香草总黄酮提取物(B)、本发明实施例2-5提供的提取方法获得的唇香草联合伽师新梅总黄酮提取物的抗炎活性，结果见表4。

表4：本发明提取方法获得总黄酮提取物对肉芽肿指数的影响

注：△与模型组比较，P<0.05；△△与模型组比较，P<0.01；*与C1/C2组比较，P<0.05。

由表4数据可知，与模型组比较，阳性药DMX可明显降低棉球肉芽肿指数 (P<0.01)。唇香草总黄酮提取物也可显著降低肉芽肿指数(P<0.05)，而本发明唇香草联合伽师新梅总黄酮提取物均可极显著降低棉球肉芽肿指数(P<0.01)，表明本发明提供的唇香草协同伽师新梅的总黄酮提取物在抗炎方面具有显著的增效作用，且当本发明按照实施例2的工艺参数提取获得的唇香草协同伽师新梅的总黄酮提取物的效果最佳。

表5：本发明不同比例组合物对组胺和5-羟色胺的影响

注：△与模型组比较，P<0.05；△△与模型组比较，P<0.01

由表5数据可知，与模型组比较，阳性药DMX显著降低组胺和5-羟色胺含量(P<0.05)。唇香草总黄酮提取物仅对5-羟色胺的作用有显著性差异(P<0.05)，而本发明唇香草协同伽师新梅的总黄酮提取物均可显著降低组胺含量 (P<0.05)，极显著降低5-羟色胺含量(P<0.01)。进一步证明了本发明提供的唇香草协同伽师新梅的总黄酮提取物在抗炎方面的增效作用。

实施例8：唇香草协同伽师新梅的总黄酮提取物的应用

本实施例在实施例1-6提供的唇香草协同伽师新梅的总黄酮提取物提取方法的基础上，将提取的唇香草协同伽师新梅的总黄酮提取物应用于制备心血管疾病治疗的药物中。

(1)心肌细胞原代培养

出生1～3天的SD大鼠乳鼠，无菌取出心脏，冷PBS溶液清洗后剪碎成约 1～3mm

(2)细胞存活率试验

心肌细胞与不同浓度的药物共育24小时后，弃去培养液，每孔加无血清的DMEM180μl和MTT20μl，培养4小时，除去上清，每孔加DMSO150μl，混合均匀后，10min内在570nm处测吸光度(A)值。心肌细胞培养72小时后，用缺氧液(预先用高浓度氮气饱和的培养液)置换正常的培养液，放入缺氧培养箱(氮气99.99％)，缺氧120分钟，再用模拟再灌注液置换复氧液(预先用纯氧饱和培养液)于5％CO

(3)试药对乳鼠心肌细胞缺氧-复氧的影响

由细胞存活率实验测定ZCF实验剂量，并将实验分为6组：正常细胞培养组(培养板置培养箱中持续孵育3小时结束实验)；缺氧-复氧损伤模型组(缺氧 2小时，复氧1小时)；缺氧-复氧损伤+ZCF各剂量组(缺氧2小时，复氧1小时，缺氧-复氧时均给药)。以不加试药的细胞培养液孔的吸光度值之比作为抑制率，取2次测定的抑制率的平均值作为最终抑制率。

表6：本发明总黄酮与唇香草总黄酮对心肌细胞的抑制率

表7：本发明总黄酮与唇香草总黄酮对心肌细胞缺氧-复氧损伤后MDA的影响

由表6-7的数据可知，MTT测定结果表明，唇香草协同伽师新梅的总黄酮提取物的剂量为8μg/mL时，其对心肌细胞缺氧-臭氧损伤的抑制率为67.43％，明显高于相同剂量条件的唇香草总黄酮提取物试验组；与模型组比较，本发明提供的唇香草协同伽师新梅的总黄酮提取物和唇香草总黄酮提取物各剂量组 MDA的量均下降且呈剂量依赖关系，高、中、低三个剂量组MDA与模型组的差异非常显著(P﹤0.01)，相比与唇香草总黄酮提取物，本发明提供的唇香草协同伽师新梅的总黄酮提取物加入后，MDA含量下降明显，表明其提高心肌细胞抗氧化能力更强，对心肌细胞缺氧-复氧具有更好的保护作用。

综上实施例所述，本发明提供的一种唇香草协同伽师新梅的总黄酮提取物及其提取方法和应用，通过对原料的预处理、按照不同的比例混合，优化提取工艺，采用X-5大孔树脂进行总黄酮的纯化，上样液的pH＝3.0，上样液流速为 4BV/h，上样量为70mL时，唇香草协同伽师新梅的总黄酮提取物含量由原来 21.87％经过分离纯化后到为39.44％，提高了17.57％。同时，将本发明提供的提取方法获得的总黄酮提取物应用于抗炎药物的制备中，结果发现，本发明提供的唇香草协同伽师新梅的总黄酮提取物在抗炎和心血管疾病方面具有显著的增效作用，因而，在制备炎症性疾病和心血管疾病的预防和治疗药物领域具有广泛的应用价值。

上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所延伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。