基因缺失型肺炎克雷伯菌减毒活疫苗、制备方法和应用

摘要

本发明属于生物工程技术领域，公开了一种基因缺失型肺炎克雷伯菌减毒活疫苗、制备方法和应用，制备方法包括：制备肺炎克雷伯菌强毒NTUH‑K2044株KP1_RS12260基因缺失菌株；选用肺炎克雷伯菌强毒NTUH‑K2044株KP1_RS12260基因缺失菌株，用LB培养基在细菌摇床上培养增殖过夜；第二天按照1：100稀释至新鲜的LB培养液中培养至OD600＝1.4，离心10min收集离心沉淀物后用生理盐水洗菌2次后以生理盐水重悬至用使细菌浓度达到105CFU/ml。本发明能够有效解决目前肺炎克雷伯菌疫苗成分与亚单位疫苗保护范围有限及保护力低等问题。

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，尤其涉及一种基因缺失型肺炎克雷伯菌减 毒活疫苗、制备方法和应用。

背景技术

目前，肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)是社区获得性感染的重要病原 之一，也可引起医院感染暴发流行，感染后可引起肺炎、菌血症、泌尿系统感 染等。定植在患者肠道的肺炎克雷伯菌高黏菌株(主要为K1、K2血清型， LD

因此疫苗研究是肺炎克雷伯菌防治研究的一个重要方向。总的来说疫苗包 括灭活疫苗、减毒活疫苗、重组疫苗、亚单位疫苗等。对于肺炎克雷伯菌感染 来说，现在研究的疫苗主要包括：1、荚膜多糖疫苗。虽然多价荚膜多糖疫苗能 够提供对多种血清型的肺炎克雷伯菌免疫力，但注射大剂量的荚膜多糖会导致 免疫耐受并且制作工艺复杂，限制了其应用。2、蛋白亚单位疫苗：主要集中在 其外膜蛋白及菌毛蛋白上。3、核糖体疫苗。减毒活疫苗是疫苗研究的一个主要 方向，这种疫苗注射后致病力减弱但能够在机体内增殖充分激活机体免疫系统 而产生免疫保护性。例如鼠疫耶尔森氏菌EV76减毒活疫苗株、布鲁氏菌减毒活 疫苗S2株等。但是目前肺炎克雷伯菌疫苗成分与亚单位疫苗保护范围有限，保 护力低。因此，亟需一种新的肺炎克雷伯菌疫苗。

通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：

(1)注射大剂量的荚膜多糖会导致免疫耐受并且制作工艺复杂，限制了荚 膜多糖疫苗应用。

(2)目前肺炎克雷伯菌疫苗成分与亚单位疫苗保护范围有限，保护力低。

解决以上问题及缺陷的难度为：减毒活疫苗是常见的预防细菌感染性疾病 的疫苗类型，因为其注射后能够在体内繁殖而能有效的激活体内免疫系统，产 生免疫记忆。但在肺炎克雷伯菌一直未能找到既能降低毒性又能保持免疫力的 菌株，该基因的缺失则满足减毒活疫苗的要求，低剂量注射既能产生免疫保护 性。

解决以上问题及缺陷的意义为：K1血清型肺炎克雷伯菌是肺炎克雷伯菌中 能够在正常人引起侵袭性感染等严重感染的常见菌株，感染后死亡率可以达到 10％。该疫苗的研制将能解决亚单位疫苗及蛋白质疫苗需要大剂量接种或免疫保 护力持续时间短等缺点，有效全方位刺激机体免疫系统，接种后将能够减少发 病与死亡率。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种基因缺失型肺炎克雷伯菌减 毒活疫苗、制备方法和应用，旨在解决目前肺炎克雷伯菌疫苗成分与亚单位疫 苗保护范围有限及保护力低等问题。

本发明是这样实现的，一种基因缺失型肺炎克雷伯菌减毒活疫苗的制备方 法，所述基因缺失型肺炎克雷伯菌减毒活疫苗的制备方法包括以下步骤：

步骤一，制备肺炎克雷伯菌强毒NTUH-K2044株KP1_RS12260基因缺失菌 株，并对肺炎克雷伯菌KP1_RS12260基因缺失株不同途径感染小鼠致病性进行 分析；

步骤二，选用肺炎克雷伯菌强毒NTUH-K2044株KP1_RS12260基因缺失菌 株，用LB培养基在37℃220r/min的细菌摇床上培养增殖过夜；

步骤三，于第二天按照1：100稀释至新鲜的LB培养液中培养至OD600＝1.4， 离心10min收集离心沉淀物后用生理盐水洗菌2次后以生理盐水重悬至用使细菌 浓度达到10

步骤四，进行肺炎克雷伯菌KP1_RS12260基因缺失减毒活疫苗功效试验。

进一步，步骤一中，所述肺炎克雷伯菌强毒NTUH-K2044株KP1_RS12260 基因缺失菌株的制备方法，包括：

(1)利用融合PCR的方法获得肺炎克雷伯菌KP1_RS12260基因上下侧翼 序列的一个1669bp的基因片段；

(2)克隆至温度敏感性自杀载休pKO3-Km上获得重组突变盒质粒，电转 至肺炎克雷伯菌野生株(WT株)NTUH-K2044中获得KP1_RS12260基因缺失 株(ΔKP1_RS12260)；

(3)将包含KP1_RS12260基因编码区、启动子结合区及转录终止区的 1876bp片段克隆至pGEM-T-easy载体上转化入KP1_RS12260基因缺失株获得 回补株(C-KP1_RS12260)。

进一步，步骤一中，所述对肺炎克雷伯菌KP1_RS12260基因缺失株不同途 径感染小鼠致病性进行分析的方法，包括：

(1)腹腔感染肺炎克雷伯菌野生株、KP1_RS12260基因缺失株及回补株， 计算不同菌株半数致死量；

(2)通过腹腔感染10

进一步，步骤四中，所述肺炎克雷伯菌KP1_RS12260基因缺失减毒活疫苗 功效试验，包括：

(1)取100ul重悬菌液皮下注射免疫BALB/C小鼠，对照组给与等量PBS 进行注射；

(2)在初次感染14天后再次以同样菌量加强免疫一次；

(3)在初次免疫28天时尾静脉取血，将每3只小鼠血液混合待凝固后分 离血清，利用全菌ELISA方法检测血清中抗肺炎克雷伯菌抗体检测并在巨噬细 胞培养液中加入不同小鼠血清分析肺炎克雷伯菌KP1_RS12260基因缺失减毒活 疫苗组小鼠血清是否能够起到调理吞噬实验而增强吞噬细胞对细菌的吞噬；

(4)在初次免疫后35天用肺炎克雷伯菌强毒NTUH-K2044株10

本发明的另一目的在于提供一种应用所述基因缺失型肺炎克雷伯菌减毒活 疫苗的制备方法制备得到的基因缺失型肺炎克雷伯菌减毒活疫苗。

本发明的另一目的在于提供一种基因缺失型肺炎克雷伯菌减毒活疫苗在防 治肺炎克雷伯菌药物制备中的应用。

结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：本发明提 供的基因缺失型肺炎克雷伯菌减毒活疫苗，能够有效解决目前肺炎克雷伯菌疫 苗成分与亚单位疫苗保护范围有限及保护力低等问题。

实验表明，相对于PBS对照组小鼠，肺炎克雷伯菌KP1_RS12260基因缺失 减毒活疫苗组小鼠血清中抗肺炎克雷伯菌血清抗体滴度明显增加，且其血清能 够明显在体外增强巨噬细胞对肺炎克雷伯菌野生株的吞噬作用，说明血清抗体 能够起到调理吞噬作用，有利于在感染时增强对肺炎克雷伯菌的吞噬杀菌。小 鼠生存率实验结果表明肺炎克雷伯菌KP1_RS12260基因缺失减毒活疫苗组小鼠 生存率较PBS对照组明显提高，表明免疫后抵抗肺炎克雷伯菌感染能力增强。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例中所 需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本发明 的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下 还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例提供的基因缺失型肺炎克雷伯菌减毒活疫苗的制备方 法流程图。

图2是本发明实施例提供的KP1_RS12260基因缺失株的构建示意图。

图3是本发明实施例提供的KP1_RS12260基因缺失株不同途径感染小鼠后 小鼠生存率示意图。

图4是本发明实施例提供的不同条件下巨噬细胞对肺炎克雷伯菌野生、 KP1_RS12260基因缺失株的吞噬能力示意图。

图5是本发明实施例提供的KP1_RS12260基因缺失的肺炎克雷伯菌减毒活 疫苗免疫后小鼠生存率示意图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例， 对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以 解释本发明，并不用于限定本发明。

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种基因缺失型肺炎克雷伯菌减 毒活疫苗、制备方法和应用，下面结合附图对本发明作详细的描述。

如图1所示，本发明实施例提供的基因缺失型肺炎克雷伯菌减毒活疫苗的 制备方法包括以下步骤：

S101，制备肺炎克雷伯菌强毒NTUH-K2044株KP1_RS12260基因缺失菌株， 并对肺炎克雷伯菌KP1_RS12260基因缺失株不同途径感染小鼠致病性进行分 析；

S102，选用肺炎克雷伯菌强毒NTUH-K2044株KP1_RS12260基因缺失菌株， 用LB培养基在37℃220r/min的细菌摇床上培养增殖过夜；

S103，于第二天按照1：100稀释至新鲜的LB培养液中培养至OD600＝1.4， 离心10min收集离心沉淀物后用生理盐水洗菌2次后以生理盐水重悬至用使细菌 浓度达到10

S104，进行肺炎克雷伯菌KP1_RS12260基因缺失减毒活疫苗功效试验。

本发明提供的KP1_RS12260基因缺失型肺炎克雷伯菌减毒活疫苗的制备方 法业内的普通技术人员还可以采用其他的步骤实施，图1的本发明提供的 KP1_RS12260基因缺失型肺炎克雷伯菌减毒活疫苗的制备方法仅仅是一个具体 实施例而已。

下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步的描述。

实施例1：本发明肺炎克雷伯菌KP1_RS12260基因缺失株的制备及评价。

1、肺炎克雷伯菌KP1_RS12260基因缺失株的构建

利用融合PCR的方法获得肺炎克雷伯菌KP1_RS12260基因上下侧翼序列的 一个1669bp的基因片段。克隆至温度敏感性自杀载休pKO3-Km上获得重组突变 盒质粒，电转至肺炎克雷伯菌野生株(WT株)NTUH-K2044中获得KP1_RS12260 基因缺失株(ΔKP1_RS12260)。然后将包含KP1_RS12260基因编码区、启动子 结合区及转录终止区的1876bp片段克隆至pGEM-T-easy载体上转化入 KP1_RS12260基因缺失株获得回补株(C-KP1_RS12260)(见图2)。

减毒疫苗所对应的基因序列为SEQ ID NO：1：

atgactaattttttgttcaatataaaaaatcactatttgcgagtcgctattgctgaactggttgatgaagcgatgaaggc cgccgggcggccacactatcagttttctcaacaatgggatgcaggatcgatggcgcaagctgatgtgatattcacggaaat ggtcgcgggggagtggtacttgtgtcaggatctttttcagcatgccccggaacaatatacgctttttattttcccggacaatga acacgctaccgtagatgagggtttaccgaattgtctgcagcatgcggtatttatgccgcctcacgctcgcgttcagcggctg aaagatgagatagctaacgccatcgagcgtccgctgctaccgcggcaagacccgccgttcaatcgtctgcggcgttgcat taattgcgcctgcaggtcggtcagcgacgcgcaaaccaaagtcatttacgcgttcagtattggcctgagcccgcatgaagt cgccgctgcgctaaatattagtcccaaaacgattcattcacataaaaagaatattatgagtaaatttaatttgaatagccgtca gcagtttaacaaccttgtgcaactgctcgccaaacgctga。

减毒疫苗所对应的蛋白序列为SEQ ID NO：2：

mtnflfniknhylrvaiaelvdeamkaagrphyqfsqqwdagsmaqadvif

temvagewylcqdlfqhapeqytlfifpdnehatvdeglpnclqhavfmpp

harvqrlkdeianaierpllprqdppfnrlrrcincacrsvsdaqtkviyafsi

glsphevaaalnispktihshkknimskfnlnsrqqfnnlvqllakr

2、肺炎克雷伯菌KP1_RS12260基因缺失株不同途径感染小鼠致病性分析

腹腔感染肺炎克雷伯菌野生株、KP1_RS12260基因缺失株及回补株，计算 不同菌株半数致死量，结果显示WTLD50≈500CFU，ΔKP1_RS12260 LD50>5×10

3、巨噬细胞对肺炎克雷伯菌KP1_RS12260基因缺失株的吞噬杀菌能力增强

体外巨噬细胞吞噬实验显示巨噬细胞对肺炎克雷伯菌KP1_RS12260基因缺 失株的吞噬杀菌能力明显增强(见图4)。

实施例2：本发明肺炎克雷伯菌KP1_RS12260基因缺失减毒活疫苗制备及功 效试验。

选用肺炎克雷伯菌强毒NTUH-K2044株KP1_RS12260基因缺失菌株，用LB 培养基在37℃220r/min的细菌摇床上培养增殖过夜，第二天按照1：100稀释至 新鲜的LB培养液中培养至OD600＝1.4左右，离心10min收集离心沉淀物后用生理 盐水洗菌2次后以生理盐水重悬至用使细菌浓度达到约10

结果显示，相对于PBS对照组小鼠，肺炎克雷伯菌KP1_RS12260基因缺失减 毒活疫苗组小鼠血清中抗肺炎克雷伯菌血清抗体滴度明显增加，且其血清能够 明显在体外增强巨噬细胞对肺炎克雷伯菌野生株的吞噬作用，说明血清抗体能 够起到调理吞噬作用，有利于在感染时增强对肺炎克雷伯菌的吞噬杀菌(见图 4)。小鼠生存率实验结果表明肺炎克雷伯菌KP1_RS12260基因缺失减毒活疫苗 组小鼠生存率较PBS对照组明显提高(见图5)，表明免疫后抵抗肺炎克雷伯菌 感染能力增强。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于 此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明 的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的 保护范围之内。

序列表

<110> 湖北医药学院

<120> 基因缺失型肺炎克雷伯菌减毒活疫苗、制备方法和应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 612

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgactaatt ttttgttcaa tataaaaaat cactatttgc gagtcgctat tgctgaactg 60

gttgatgaag cgatgaaggc cgccgggcgg ccacactatc agttttctca acaatgggat 120

gcaggatcga tggcgcaagc tgatgtgata ttcacggaaa tggtcgcggg ggagtggtac 180

ttgtgtcagg atctttttca gcatgccccg gaacaatata cgctttttat tttcccggac 240

aatgaacacg ctaccgtaga tgagggttta ccgaattgtc tgcagcatgc ggtatttatg 300

ccgcctcacg ctcgcgttca gcggctgaaa gatgagatag ctaacgccat cgagcgtccg 360

ctgctaccgc ggcaagaccc gccgttcaat cgtctgcggc gttgcattaa ttgcgcctgc 420

aggtcggtca gcgacgcgca aaccaaagtc atttacgcgt tcagtattgg cctgagcccg 480

catgaagtcg ccgctgcgct aaatattagt cccaaaacga ttcattcaca taaaaagaat 540

attatgagta aatttaattt gaatagccgt cagcagttta acaaccttgt gcaactgctc 600

gccaaacgct ga 612

<210> 2

<211> 203

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Thr Asn Phe Leu Phe Asn Ile Lys Asn His Tyr Leu Arg Val Ala

1 5 10 15

Ile Ala Glu Leu Val Asp Glu Ala Met Lys Ala Ala Gly Arg Pro His

20 25 30

Tyr Gln Phe Ser Gln Gln Trp Asp Ala Gly Ser Met Ala Gln Ala Asp

35 40 45

Val Ile Phe Thr Glu Met Val Ala Gly Glu Trp Tyr Leu Cys Gln Asp

50 55 60

Leu Phe Gln His Ala Pro Glu Gln Tyr Thr Leu Phe Ile Phe Pro Asp

65 70 75 80

Asn Glu His Ala Thr Val Asp Glu Gly Leu Pro Asn Cys Leu Gln His

85 90 95

Ala Val Phe Met Pro Pro His Ala Arg Val Gln Arg Leu Lys Asp Glu

100 105 110

Ile Ala Asn Ala Ile Glu Arg Pro Leu Leu Pro Arg Gln Asp Pro Pro

115 120 125

Phe Asn Arg Leu Arg Arg Cys Ile Asn Cys Ala Cys Arg Ser Val Ser

130 135 140

Asp Ala Gln Thr Lys Val Ile Tyr Ala Phe Ser Ile Gly Leu Ser Pro

145 150 155 160

His Glu Val Ala Ala Ala Leu Asn Ile Ser Pro Lys Thr Ile His Ser

165 170 175

His Lys Lys Asn Ile Met Ser Lys Phe Asn Leu Asn Ser Arg Gln Gln

180 185 190

Phe Asn Asn Leu Val Gln Leu Leu Ala Lys Arg

195 200