检测Prader-Willi综合征/Angelman综合征的qMS-PCR试剂盒

摘要

本发明公开一种检测Prader‑Willi综合征/Angelman综合征的qMS‑PCR试剂盒。该试剂盒包括用于检测SNRPN启动子区域甲基化的引物对和TaqMan‑MGB探针、用于检测SNRPN启动子区域非甲基化的引物对和TaqMan‑MGB探针；引物对中的上游引物5’端连接有能够与PCR目的片段形成茎环结构的自身封闭序列。5’端设置独特的自身互补序列的甲基化引物与非特异性结合至非甲基化序列模板上时，该序列能够与模板上的非甲基化序列完全结合并自延伸，进而阻断非特异性扩增，大大提升甲基化转化序列的扩增效率，产生的taqman探针水解信号Ct值更能准确判断SNRPN的甲基化状态。

说明书

技术领域

本发明属于医学检测领域，特别涉及一种检测Prader-Willi综合征/Angelman综合征的qMS-PCR试剂盒。

背景技术

Prader-Willi综合征(Prader-Willi syndrome,PWS)和Angelman综合征(Angelman syndrome,AS)是两种临床上明显不同的神经遗传性疾病。PWS(MIM176270)的特点为：胎动减少、肥胖、婴儿期肌张力减退、智力障碍、身材短小,促性腺激素分泌不足的性腺机能减退和手足异常。AS(MIM105830)的特点是严重运动、智力障碍、共济失调、肌张力低下、癫痫、语言障碍和以巨大下颌及张口吐舌为特征的特殊面容。PWS和AS均为染色体15q11-13区域印记基因功能缺陷导致,其发病率约为1/10000～1/30000，是目前发病率最高的基因印记疾病。PWS是症状性病态肥胖的重要病因之一，早期诊断和合理干预对改善患儿生活质量、预防严重并发症至关重要。

PWS/AS发病有多种分子缺陷类别，其中包括：

1、缺失：染色体15q11-13区域的缺失的是PWS及AS患者发病的主要分子病理类型，PWS为父源染色体15q11-13的缺失，而AS为其母源染色体15q11-13的缺失。西方人群中缺失型患者占65-75％，而中国和亚洲人群该型的比例更高，超过80％。

2、单亲二体(uniparental disomy,UPD)：PWS和AS患者的两条15号染色体均正常，但PWS患者的两条15号染色体均来自母亲，即母亲单亲二体(UPD)；而AS患者的两条15号染色体均来自父亲，即父亲单亲二体(UPD)。PWS的UPD发生率较普遍(20-30％)，而AS的较低(2％)。

3、印记突变：印记中心(Imprinting Center，IC)的微缺失及突变(占1％～3％)。

针对这些不同类型的分子缺陷形式，目前国内外针对PWS/AS综合征开发的遗传学诊断方法包括高分辨染色体核型分析(HRB)、荧光原位杂交(FISH)、微卫星连锁分析和甲基化分析等。HRB是最早应用于PWS/AS研究的细胞遗传学检测方法。该法仅能对缺失型的PWS/AS做出诊断，且不能检出所有的缺失，检出率约为60％。FISH是一种非放射性原位杂交的方法，可对应用常规染色体显带技术难以发现的15q11-13区域内的微小缺失或15q相关区带易位的患者作出诊断，使本病的检出率提高到70-75％。微卫星连锁分析，如短串联重复序列(Short Tandem Repeat，STR)遗传连锁分析，通过比对亲代与子代个体间各受测STR位点的重复次数或长度，并依据UPD造成的PWS在15q11-13区域外仍然存在着父/母源信息的缺失而加以鉴别。印记杂交(Southern Blotting)是根据15q11-13区域印记基因甲基化修饰方式不同的原理，其中基因是目前运用该法对PWS进行基因突变是目前运用该法对PWS进行基因突变研究的最常用候选基因。该法特异性强，诊断结果可靠。但方法繁琐且需要使用同位素标记，难以广泛应用。

SNRPN基因启动子区含有CpG岛，该区域上父源等位基因甲基化而母源等位基因非甲基化。在PWS患者中仅存在甲基化的等位基因，而AS患者中仅存在非甲基化的等位基因，因而可以应用MS-PCR检测SNRPN基因CpG岛的甲基化状态，对PWS及AS进行快速诊断。其原理是：化学试剂如重亚硫酸氢盐能将所有未甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶，而SNRPN基因CpG上的胞嘧啶因甲基化而不变。基于这种差异性，设计甲基化特异性的引物就可将甲基化等位基因化学修饰的DNA序列与非甲基化等位基因区分(如图1)，在PCR反应体系中加同时加入靶向甲基化序列的特异性荧光探针，探针只与甲基化模板特异结合，其结合位点位于两条引物之间，利用荧光信号积累进行实时定量PCR监测整个PCR过程。由此可以精确判断SNRPN的甲基化状态，对几乎全部PWS和大约80％AS患者进行快速有效的基因诊断和产前诊断。

qMS-PCR检测PWS/AS不局限于其发病的分子缺陷类别，具有能够高效检出PWS/AS患者，然而qMS-PCR目前仍在没有在市场上得到大规模应用，这主要是由qMS-PCR的技术特点决定的。qMS-PCR的检测质量高度受限于重亚硫酸盐的转化效率，如果重亚硫酸盐将胞嘧啶转变为尿嘧啶的效率过低，那么在qPCR反应中就容易将非甲基化的CpG位点误判为甲基化CpG位点，从而造成假阳性；同时重亚硫酸盐处理的之后的DNA，片段化严重，胞嘧啶转化为尿嘧啶后DNA序列多样性降低，更容易形成复杂二级结构，进一步影响了qMS-PCR的效率，这些难点限制了qMS-PCR在临床的应用。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种检测Prader-Willi综合征/Angelman综合征的qMS-PCR试剂盒。

本发明的另一目的在于提供上述检测Prader-Willi综合征/Angelman综合征的qMS-PCR试剂盒的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种检测Prader-Willi综合征/Angelman综合征的qMS-PCR试剂盒，包括用于检测SNRPN启动子区域甲基化的引物对、用于检测SNRPN启动子区域非甲基化的引物对、用于检测SNRPN启动子区域甲基化的TaqMan-MGB探针和用于检测SNRPN启动子区域非甲基化的TaqMan-MGB探针；其中，用于检测SNRPN启动子区域甲基化的引物对中的上游引物的5’端连接有能够与PCR目的片段形成茎环结构的5’自身封闭序列，用于检测SNRPN启动子区域非甲基化的引物对中的上游引物的5’端连接有能够与PCR目的片段形成茎环结构的5’自身封闭序列。

所述的5’自身封闭序列的设计是依据与其互补的片段含有尽可能多的甲基化位点。

所述的5’自身封闭序列的长度优选为10～30bp；优选为15～25bp；更优选为15～20bp。

所述的用于检测SNRPN启动子区域甲基化的TaqMan-MGB探针上修饰的荧光标记和所述的用于检测SNRPN启动子区域非甲基化的TaqMan-MGB探针上修饰的荧光标记不同。

所述的用于检测SNRPN启动子区域甲基化的TaqMan-MGB探针上修饰的荧光标记优选为VIC。

所述的用于检测SNRPN启动子区域非甲基化的TaqMan-MGB探针上修饰的荧光标记优选为FAM。

所述的用于检测SNRPN启动子区域甲基化的引物对优选如下：

SNRPN-M-F：5’-AACCACACAAACATACT GAGTTGGGATTTTTGTATTG-3’；

SNRPN-M-R：5’-ACGCCAAACTCGCTACAACAACGA-3’。

所述的用于检测SNRPN启动子区域非甲基化的引物对优选如下：

SNRPN-N-F：5’-GACCGCGCAAACGTACT GAGTTGGGATTTTTGTATTG-3’；

SNRPN-N-R：5’-ACACCAAACTCACTACAACAACAA-3’。

所述的用于检测SNRPN启动子区域甲基化的TAQMAN-MGB探针优选如下：

SNRPN-M-P：5’-VIC-AGGTTGGCGCGTATGTTTA-MGB-3’。

所述的用于检测SNRPN启动子区域非甲基化的TAQMAN-MGB探针优选如下：

SNRPN-N-P：5’-FAM-AGGTTGGTGTGTATGTTTA-MGB-3’。

所述的试剂盒还包括TaqMan PCR试剂。

所述的检测Prader-Willi综合征/Angelman综合征的qMS-PCR试剂盒在非诊断目的的检测Prader-Willi综合征/Angelman综合征中的应用，优选包含如下步骤：

(1)将待测样品的基因组DNA进行重亚硫酸盐转化，得到转化基因组DNA；

(2)以转化基因组DNA为模板，应用上述检测Prader-Willi综合征/Angelman综合征的qMS-PCR试剂盒，进行TaqMan PCR扩增；

(3)对结果进行判读：

A、SNRPN甲基化探针信号为+、SNRPN非甲基化探针信号为+，为正常人；

B、SNRPN甲基化探针信号为+、SNRPN非甲基化探针信号为-，为PWS患者；

C、SNRPN甲基化探针信号为-、SNRPN非甲基化探针信号为+，为AS患者。

所述的非诊断目的可为实验研究目的。

步骤(1)中所述的待测样品优选为外周血。

步骤(2)中所述的TaqMan PCR扩增的条件优选为95℃10min；95℃15s、60℃1min，共40个循环。

步骤(3)中所述的结果优选为通过SDS软件分析得到。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

本发明是用qMS-PCR(Quantitative Methylation-Specific real-time PCR)技术对SNRPN基因启动子区域甲基化状态进行定性、定量检测。

本发明发明人首次应用5’自身封闭引物设置方式，在甲基化引物5’端设置一段独特的自身互补序列，该序列上有一段补充序列，当甲基化引物与非特异性结合至非甲基化序列模板上时，该序列能够与模板上的非甲基化序列完全结合并自延伸，进而阻断非特异性扩增，大大提升甲基化转化序列的扩增效率(如图2)，产生的taqman探针水解信号Ct值更提前，信号值更强，更能准确判断SNRPN的甲基化状态(如图3)。

附图说明

图1是现有技术的qMS-PCR的原理图；其中，A为重亚硫酸盐转化未甲基化的C碱基示意图；B为针对不同甲基化状态的CpG位点设置双探针进行qMS-PCR的设计模式示意图。

图2是本发明应用5’自身封闭引物设计屏蔽非特异性扩增技术原理示意图。

图3是使用不同的引物对PWS综合征待测样本进行qMS-PCR得到的结果图；其中，A使用常规引物，曲线a为非特异性的非甲基化信号，曲线b为特异性甲基化信号；B使用改进后的5’自身封闭引物引物，曲线c为非特异性的非甲基化信号，曲线d为特异性甲基化信号，可见曲线c基本消除，曲线d增强，且Ct值提前了2～3循环。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1用于Prader-Willi综合征/Angelman综合征检测的引物和TaqMan-MGB探针的设计

根据SNRPN基因启动子序列，用Methyl Primer Express v1.0软件得到重亚硫酸盐转化后的甲基化序列和非甲基化序列，同时使用Primer Premier5软件针对甲基化和非甲基化差异序列设计引物以及TaqMan探针，选择好引物后在上游引物适当位置设计5’自身封闭序列，使之能与非特异扩增的非甲基化序列结合而形成stem-loop结构。

以非甲基化序列为例示意引物及探针设计位置：

引物及TaqMan-MGB探针序列如下：

(1)检测SNRPN甲基化的引物对：

SNRPN-M-R：5’-ACGCCAAACTCGCTACAACAACGA-3’。

(2)检测SNRPN非甲基化的引物对：

SNRPN-N-R：5’-ACACCAAACTCACTACAACAACAA-3’。

(3)检测SNRPN甲基化的TaqMan-MGB正义探针：

SNRPN-M-P：5’-VIC-AGGTTGGCGCGTATGTTTA-MGB-3’。

(4)检测SNRPN非甲基化的TaqMan-MGB探针：

SNRPN-N-P：5’-FAM-AGGTTGGTGTGTATGTTTA-MGB-3’。

实施例2、基因组DNA的重亚硫酸盐转化

1)样本基因组DNA的获取

样本提取使用广州赛哲生物科技股份有限公司的磁珠法DNA提取试剂盒，使用200μL外周血，加入200μL裂解液和10μL蛋白酶K，56℃恒温震荡裂解10min；瞬时离心后加入300μL异丙醇和15μL磁珠，混匀后置于磁力架上吸附3min弃上清；加入洗液VW1 400μL重悬磁珠，混匀后置于磁力架上吸附3min弃上清；加入洗液VW2 400μL重悬磁珠，混匀后置于磁力架上吸附3min弃上清，重复此步骤一次；磁力架上吸附晾置5-8min后，加入100μL洗脱液，56℃恒温震荡裂解10min后，将离心管放入磁力架吸附5min，吸取上清即为提取的的血液总DNA。

2)基因组DNA的重亚硫酸盐转化

样本转化使用江苏敬善生物科技股份有限公司的磁珠法DNA提取试剂盒，将融化好的基因组DNA取适量至2.0ml微量离心管中，然后补加洗脱液(Elution buffer)至100μl、涡旋混匀、短暂离心。加入150μl亚硫酸盐溶液和25μl保护液至离心管中；盖紧微量离心管后，涡旋混匀亚硫酸盐反应液，短暂离心微量离心管；将微量离心管置于恒温振荡孵育器中，80℃恒温孵育45±5分钟，不要振荡；孵育45±5分钟后，立即将微量离心管取出；

将恒温振荡孵育器温度调至23±2℃待后续使用；暂短离心微量离心管，加入1000μl洗涤液A和20μl混匀(新鲜重悬)的磁珠，涡旋混匀后置于23±2℃恒温振荡孵育器，孵育45±5min；短暂离心后置于磁性试管架吸附3min弃上清；加入洗液A 800μL重悬磁珠，混匀后置于磁力架上吸附3min弃上清；加入洗液A 800μL重悬磁珠，混匀后置于磁力架上吸附3min弃上清，重复此步骤一次；用10-100μl枪头尽量除去残余液体后干燥约10min，待沉淀干燥；加入100μL洗脱液，56℃恒温震荡10min后，将离心管放入磁力架吸附5min，吸取上清即为重亚硫酸盐转化后的DNA。

实施例3：PCR扩增及结果判读

1)以实施例2得到的重亚硫酸盐转化DNA为模板，在实施例1所述引物及TaqMan-MGB探针的引导下，用ABI 7500实时荧光定量PCR仪(美国应用生物系统公司)进行PCR扩增，并按等位基因鉴别实验操作步骤完成并分析，即依次进行读取等位基因鉴别实验PCR扩增前信号、执行扩增程序及读取、分析扩增后信号。其中，PCR反应体系为20μL反应体系：2×TaqMan通用PCR扩增预混试剂(购自美国应用生物系统公司)10μL，引各物在反应体系中的终浓度分别为900nM，荧光标记的2条TaqMan-MGB探针在反应体系中的终浓度分别为200nM，150ng DNA。PCR反应条件为：先95℃10min；然后95℃15s、60℃1min，共40个循环。

2)得出结果

用SDS软件(美国应用生物系统公司)分析实验结果，得到SNRPN启动子区域甲基化状态，并进一步判断受检者PWS/AS风险。本次实验共取3名受试者样本(来自广东)进行实验，最终的基因型分布见下表1。

表1

注：SDS软件设置Presence/Absence模式，直接判断是否有信号；+为有信号，-为无信号。

实施例4：5’自身封闭引物和常规引物的检测效果比较

实验中选择了10例PWS综合征患者和10例AS综合征患者的样本，检测样本类型为遗传筛查常用的干血片，将干血片在缓冲液中浸泡后依上述步骤提取并转化DNA，进行qMS-PCR检测。干血片中DNA含量较少，对检测方法的灵敏度和特异性要求较高，本实验中使用5’自身封闭引物和常规引物分别检测血片样本，比较检测方法的灵敏度和特异性。常规引物与用5’自身封闭引物的区别仅在于在检测SNRPN甲基化的引物对和检测SNRPN非甲基化的引物对中的上游引物不含方框框住部分，即不含5’自身封闭序列。比较结果如表2所示。从表2的结果可知，在10例PWS患者中，设置了5’自身封闭引物的qMS-PCR反应能精准检出SNRPN启动子的甲基化，准确判断PWS/AS；而普通引物则效果较差，10例样本中有1例被错判为正常，1例没有信号无法判读；AS患者中情况也类似，普通引物检测有1例AS患者被错判为正常。

表2

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 广东省妇幼保健院

<120> 检测Prader-Willi综合征/Angelman综合征的qMS-PCR试剂盒

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 引物SNRPN-M-F

<400> 1

aaccacacaa acatactgag ttgggatttt tgtattg 37

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 引物SNRPN-M-R

<400> 2

acgccaaact cgctacaaca acga 24

<210> 3

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 引物SNRPN-N-F

<400> 3

gaccgcgcaa acgtactgag ttgggatttt tgtattg 37

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 引物SNRPN-N-R

<400> 4

acaccaaact cactacaaca acaa 24

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 探针SNRPN-M-P

<220>

<222> (1)..(1)

<223> VIC修饰

<220>

<222> (19)..(19)

<223> MGB修饰

<400> 5

aggttggcgc gtatgttta 19

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 探针SNRPN-N-P

<220>

<222> (1)..(1)

<223> FAM修饰

<220>

<222> (19)..(19)

<223> MGB修饰

<400> 6

aggttggtgt gtatgttta 19

<210> 7

<211> 405

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tgtttattga ttttaggttg tttatggttt ttagaggttt ttttttattg taatagtgtt 60

gtggggtttt aggggtttag tagttttttt tttttaggtt attttggtga gggagggagt 120

tgggattttt gtattgtggt aaataagtat gtttgtgtgg ttgtagaggt aggttggtgt 180

gtatgtttag gtggggatgt gtgtgaagtt tgttgttgtt gtagtgagtt tggtgtagag 240

tggagtggtt gttggagatg tttgatgtat ttgtttgagg agtggttagt gatgtgatgg 300

agtgggtaag gttagttgtg ttggtggttt tttttaagag atagtttggg gagtggttat 360

ttttatttat tagatatttt aagtttttag gatttggagt attga 405