用于测定蒸汽或热灭菌过程的效力的生物指示剂及其使用方法

摘要

一种用于确定蒸汽或热灭菌过程的效力的生物指示剂。所述生物指示剂包括一组微生物孢子、微生物孢子外源的传感器蛋白、荧光团和培养基。使用该生物指示剂确定蒸汽或热灭菌过程的效力的方法。

说明书

技术领域

本发明涉及适于确定蒸汽灭菌或热灭菌过程的结果的生物指示剂(biologicalindicator)。

背景技术

灭菌过程旨在提供不含有活力的生命形式的表面或物体(例如实验室或医疗设备、仪器或器具)。此类过程被广泛用于诸如医疗行业或众多科学研究活动的环境中。

此类过程的重要方面是确定灭菌过程是否成功的能力，以确保使用经灭菌的材料和/或表面的所需条件。为此，采用了几种具有不同质量等级的方法。

本领域已知的生物指示剂通常涉及使已知量的微生物孢子(例如细菌孢子)与目标材料和/或表面一起接受灭菌过程的处理。该过程完成之后，立即进行测试以探测剩余的活的和/或有活力的微生物的存在。如果这些测试得出阴性结果，则可以确定灭菌是有效的。

更具体的生物指示剂包括探测某些生物化学反应的发生，已知所述生物化学反应指示存在有活力的生命形式。此类生物化学反应涉及通常存在于微生物生命中的酶和/或催化活性或染料的颜色变化。

专利申请US 2015/0159192 A1公开了一种测定灭菌过程成功的方法，其包括使用分离的酶或者其中该酶是内源的或该酶是通过基因工程表达的微生物。根据本公开内容的指示剂酶是通常存在于形成孢子的微生物中的酶，例如β-D-葡糖苷酶。在将指示剂暴露于灭菌过程之后，进行酶活性测试，以评估灭菌的有效性。

其他生物指示剂是基于能够表达特定报道基因的遗传工程化微生物的使用。

专利申请WO 2018/071732 A1公开了一种利用遗传工程化微生物的生物指示剂，所述遗传工程化微生物能够表达适于进行荧光的筛选的报道基因(例如适于表达荧光蛋白的报道基因)。在指示剂已经经过灭菌过程处理之后，对其进行光学可检测信号的筛选，从而证明存在或不存在有活力的微生物。

类似地，专利申请WO 2017/185738 A1公开了一种基于使用来自表达特定荧光报道基因的遗传工程化微生物的孢子的生物指示剂。灭菌过程之后，对指示剂进行光学可检测信号的筛选，以评估有活力的微生物的存在。

本领域已知的其他生物指示剂包括提供适于表达特定酶的遗传工程化微生物，以便在灭菌之后筛选所述特定酶的酶活性。

专利申请US 2017/0292143 A1公开了适于表达特定酶(如β-内酰胺酶)的遗传工程化微生物，所述特定酶能够水解被设计为通过水解发出荧光的发荧光化合物。因此，光学可检测荧光信号指示存在有活力的微生物。

其他生物指示剂采用替代蛋白的筛选，所述替代蛋白选自对传染原的生长至关重要的蛋白以及病原性或免疫原性蛋白。

专利申请US 2017/0283847 A1公开了一种基于在灭菌过程之后筛选确定的替代蛋白的生物指示剂。所公开的方法需要诸如蛋白质印迹分析的程序以评估靶蛋白的存在。

具有类似特征的其他生物指示剂还采用经遗传修饰的微生物或突变体和/或经标记的蛋白和/或酶，以使得能够在灭菌之后进行有效筛选，例如CA 2667698 C、US 9717812B2、EP 2456882 B1、US 10047334 B2、US 20140370535 A1和JP 2014-060947 A所公开的。

现有技术的生物指示剂通常依赖生产和使用都复杂、昂贵和相当费时的程序，通常会影响生物指示剂本身和灭菌过程的总成本。基于这样的程序的生物指示剂需要大量的孵育和/或读数时间，这也意味着显著的时间和资源上的花费。仅依赖于筛选酶活性的生物指示剂受到所用酶的通常较低的稳定性的限制。酶的固有特性(如其结构和催化活性)对指示剂系统的整体稳定性具有负面影响，增加了假阳性的数量。此外，需要更长的时间段以筛选酶活性。

因此，仍然需要一种既可靠又具有成本效益的、能够减少孵育和/或读数时间并且不涉及昂贵的程序和/或要求的生物指示剂。

本发明不依赖于经遗传工程化的微生物或经修饰的重组蛋白，获得和大量生产所述微生物或重组蛋白是昂贵的。

另外，本发明不需要包括蛋白质印迹分析、蛋白质阵列分析、磁分离分析、质谱分析、肽分析、色谱分析或气相色谱分析的显影阶段(development stage)，这些需要专用设备并且相当耗时。

另一方面，生物指示剂不依赖于酶促反应来间接确定灭菌过程的结果，这一事实提供了更可靠的结果。酶促反应是复杂的物理和化学现象，其需要众多有利条件才能发生。例如，并且如本领域技术人员所知的，酶活性非常依赖酶的活性位点的结构和性质。甚至这些活性位点的任何特征中或酶周围的环境条件中的很小的变化，都可能会对酶的正确进行反应的能力产生重大影响。这种变化的可能性使依赖酶促反应的生物指示剂具有严重的潜在缺陷，因为这些变化可能错误地指示灭菌的成功。

发明内容

本发明仅依赖于两个简单且直接的测试(即荧光强度测试和比色测试)的结果，从而使得与现有技术相比，整个过程明显更具有时间效益和成本效益。

在第一方面，本发明涉及一种用于确定蒸汽或热灭菌过程的效力的自包含的生物指示剂，其在一定的孵育时间之后使用即时荧光信号检测和比色测试。

因此，本申请的一个目的是用于确定蒸汽或热灭菌过程的效力的包括柔性容器的设备，该设备包括：

a)一组微生物孢子，

b)至少一种微生物孢子外源的传感器蛋白，

c)荧光团，和

d)培养基。

e)用于长期的读数确认(extended readout confirmation)的pH指示剂或比色组分。

在本发明的一个实施方案中，a)中的一组微生物孢子是细菌孢子。

在本发明的一个优选实施方案中，a)中的一组微生物孢子是细菌孢子，其选自萎缩芽孢杆菌(B.atrophaeus)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(G.stearothermophilus)和短小芽孢杆菌(B.pumilus)。

在本发明的一个优选实施方案中，微生物孢子包埋在载体中。

在本发明的另一个优选实施方案中，微生物孢子外源的传感器蛋白也包埋在载体中。

在本发明的另一个优选实施方案中，微生物孢子外源的传感器蛋白包含在易碎的安瓿中。

在本发明的另一个实施方案中，微生物孢子外源的传感器蛋白选自：纤维蛋白、弹性蛋白、酪蛋白、胶原蛋白、肌动蛋白、角蛋白、白蛋白。也可以使用酶如溶菌酶、淀粉酶、脂肪酶、胃蛋白酶、葡糖苷酶、磷酸酶、半乳糖苷酶、胰凝乳蛋白酶和脂肪酶，但这仅是由于其结构特征，而与其催化活性无关。

在本发明的一个优选实施方案中，荧光团包含在易碎的安瓿中。

在本发明的一个实施方案中，荧光团c)选自：尼罗红、香豆素6H、香豆素6、香豆素30、香豆素102、香豆素153、7-氨基-4-(三氟甲基)香豆素、8-苯胺基萘-1-磺酸、7-羟基-4-(三氟甲基)香豆素、4,4′-二苯胺基-1,1′-联萘-5,5-二磺酸二钾盐、L-丙氨酸-7-酰氨基-4-甲基香豆素、L-脯氨酸-7-酰氨基-4-甲基香豆素、L-酪氨酸-7-酰氨基-4-甲基香豆素、L-亮氨酸-7-酰氨基-4-甲基香豆素和L-苯丙氨酸-7-酰氨基-4-甲基香豆素。

在本发明的一个优选实施方案中，培养基包含于易碎的安瓿中。

在本发明的另一个实施方案中，培养基组分包含细菌蛋白胨、酵母提取物和氨基酸，优选异亮氨酸、色氨酸或L-缬氨酸。

在本发明的一个优选实施方案中，培养基包含比色组分。

在本发明的一个实施方案中，培养基的比色组分选自溴甲酚紫、溴甲酚绿、酚红、百里酚蓝、溴酚蓝、溴百里酚蓝、6-氯-3-羟基吲哚-α-D-吡喃葡萄糖苷(6-chloro-indoxyl-alpha-D-glucopyranoside)、5-溴-4-氯-3-吲哚基α-D-吡喃葡萄糖苷、6-氯-3-羟基吲哚-β-D-吡喃半乳糖苷、5-溴-4-氯-3-吲哚基β-D-吡喃半乳糖苷、5-溴-4-氯-3-羟基吲哚磷酸盐。

在本发明的另一个更优选实施方案中，微生物孢子外源的传感器蛋白、荧光团和培养基包含于单个易碎的安瓿中，以使由于过度操作或处理生物指示剂导致的污染的可能性最小化。

在本发明的一个优选实施方案中，易碎的安瓿是由具有低热膨胀系数的材料制成，优选硼硅酸盐玻璃。

在本发明的第二方面，另一个目的是使用本发明的前述生物指示剂的方法，所述使用方法通常包括：

a)将生物指示剂与待进行蒸汽或热灭菌的目标材料一起放入蒸汽或热灭菌器中，

b)进行蒸汽或热灭菌过程，

c)将生物指示剂放入培养箱中，

d)筛选生物指示剂的荧光强度的即时可检测的变化，同时在培养箱中孵育生物指示剂，

e)基于步骤d)中进行的筛选确定蒸汽或热灭菌过程的效力，

f)延长步骤d)中获得的生物指示剂的孵育

g)筛选步骤e)中获得的孵育的生物指示剂的光学可检测的颜色变化，以及

h)根据步骤g)中获得的光学可检测的变化，确定蒸汽或热灭菌过程的效力。

在本发明的方法的一个实施方案中，在步骤a)和b)中，将生物指示剂与目标材料一起置于蒸汽或热灭菌器内部的蒸汽或热可透过的包装中。

在本发明的方法的一个优选实施方案中，预先准备的培养箱是市售可得的培养箱，其选自Terragene Incubator Reader

在本发明的方法的另一个实施方案中，在步骤c)中，将预先准备的可用的培养箱设定在55-65℃、优选58-62℃、更优选60℃的温度。

在本发明的方法的一个实施方案中，在步骤c)中，在将生物指示剂置于预先准备的培养箱中之前立即将安瓿压碎。

在本发明的方法的一个实施方案中，在步骤d)期间，在灭菌之后和开始孵育时立即筛选生物指示剂的荧光强度的变化。

在本发明的方法的一个实施方案中，在步骤g)期间，根据从步骤d)和g)获得的结果，确定蒸汽或热灭菌过程的效力。步骤d)或f)中任何一项的阳性结果指示灭菌过程不完整或失败。

附图说明

图1示出了自孵育步骤开始，荧光强度为时间的函数。每条曲线对应于不同的灭菌时间：在相同的132℃的固定灭菌温度下，3、5、7和9分钟。还示出了未灭菌的情况。随着灭菌时间的增加，对应曲线的斜率显著更明显。更久的暴露于高温，可以将更多能量转移至生物指示剂上，这又导致更显著的荧光强度变化。具体而言，更长的暴露时间导致更剧烈的荧光强度降低。

图2示出了本发明的生物指示剂的示意性侧面图。

具体实施方式

该设备包括一组微生物孢子、至少一种微生物孢子外源的传感器蛋白、至少一种荧光团和培养基。

生物指示剂是自包含的设备，这意味着所述一组微生物孢子、一种或多种微生物孢子外源的传感器蛋白、荧光团和培养基包含在单个柔性容器中，这有助于避免由于操作造成的可能的污染。尽管如此，在包含于柔性容器中的易碎安瓿中，将培养基与所述一组微生物孢子分离，这是由于仅在灭菌过程完成之后才需要使这两个单元(element)接触。

在本发明的一个实施方案中，生物指示剂包括如图2所示的柔性容器，其包括用于密封柔性容器的盖2、盖孔1、容器管3、含有培养基的安瓿4和含有微生物孢子的载体5。

在某些实施方案中，柔性容器是半透明的聚丙烯管。

在另一个实施方案中，柔性容器包括可被向下推动以便密封容器的可移动的盖。

在其他实施方案中，微生物孢子包埋于包含在柔性容器内的载体中。

在某些实施方案中，微生物孢子包埋于由多孔材料(例如纤维素、聚丙烯纤维材料、高密度聚乙烯纤维)制成的载体中，或聚丙烯容器本身中。

在一个优选实施方案中，纤维素载体是克重为130至180g/m

在本发明的一个实施方案中，安瓿是由具有低热膨胀系数的易碎材料(例如硼硅酸盐玻璃，优选玻璃)制成并含有0.5至0.9ml的培养基。

在一个优选实施方案中，所述培养基包含0.2至2g/L细菌蛋白胨、0.1至1.5g/L酵母提取物和0.1至1g/L选自异亮氨酸、色氨酸和L-缬氨酸的氨基酸。

在一个优选实施方案中，培养基包含0.03g/L的溴百里酚蓝指示剂作为比色组分。所述培养基具有约7.5的调节后pH。在一个特别优选的实施方案中，pH是用氢氧化钠调节。

在一些实施方案中，可以通过荧光计来实现对荧光强度变化的检测，所述荧光强度变化是由于荧光团与至少一种微生物孢子外源的传感器蛋白之间的相互作用导致的。

在本发明的一个优选实施方案中，将荧光计整合于同一培养箱中，以使生物指示剂的处理和移动降到最少。这样，可以在同一培养箱中直接进行荧光强度变化的检测，而不需要其他步骤来获得荧光读数。

在一些实施方案中，可以通过直接视觉观察或通过照相机及随后的图像分析来实现对由比色测试导致的颜色变化的检测。

至少一种微生物孢子外源的传感器蛋白和荧光团可以包含在纤维素载体或安瓿中。

在本发明的一个优选实施方案中，至少一种微生物孢子外源的传感器蛋白和荧光团包含在安瓿中。

当包含在密封的安瓿中时，至少一种微生物孢子外源的传感器蛋白和荧光团要经受与待灭菌的目标材料相同的温度条件。这是由于灭菌过程对外源传感器蛋白结构的影响是通过加热实现的。外源传感器蛋白不需要与蒸汽或热的直接接触来达到所需温度以经历结构变化。

至少一种微生物孢子外源的传感器蛋白以0.05-0.8g/mL的浓度范围(优选0.5g/mL)存在。所述至少一种微生物孢子外源的传感器蛋白选自纤维蛋白、弹性蛋白、酪蛋白、胶原蛋白、肌动蛋白、角蛋白、白蛋白。也可以使用酶，如溶菌酶、淀粉酶、脂肪酶、胃蛋白酶、葡糖苷酶、磷酸酶、半乳糖苷酶、胰凝乳蛋白酶和脂肪酶，但这仅是由于其结构特征，而与其催化活性无关。该至少一种微生物孢子外源的传感器蛋白可以根据其三维结构与荧光团进行差异性相互作用。所述三维结构与蒸汽或热灭菌过程的条件(例如暴露和湿度)密切相关。暴露于所述条件的时间也是影响所述三维结构的重要因素。

如图1所示，在通常进行蒸汽或热灭菌过程的温度(即132℃)下，由于蛋白三维结构的变化，随后可观察到荧光的变化。在进行较长时间的灭菌之前时，这些变化发生得更快。较长的灭菌时间导致外源传感器蛋白更彻底且更广泛的变性，损害了其结合荧光团的能力。因此，荧光团被释放并与极性水性介质相互作用。这种相互作用产生的荧光信号明显少于其先前与结构完整的蛋白的相互作用。

值得注意的是，由于暴露于高温而导致的蛋白三维结构的变化可能对其结合荧光团的能力产生不同的影响。亲和力可能增加或减少，导致荧光信号增加或减少。所产生的荧光变化取决于选择进行测试的特定蛋白和荧光团。

本领域技术人员将认识到，暴露于高温的蛋白的三维结构的变化必然与经历相同暴露的微生物的死亡有关(因为当微生物的全部或绝大部分组成蛋白变性时，微生物的生命是无法维持的)。因此，本发明的外源传感器蛋白的三维结构的变化指示了任何活的微生物(包括微生物孢子)的死亡。

因此，在本发明的生物指示剂中，微生物孢子外源的传感器蛋白的变性与微生物孢子的死亡直接相关。因此，由传感器蛋白变性引起的荧光变化保证了对生物指示剂中所含孢子种群的死亡的预测。

在本发明的一个实施方案中，荧光团以0.07-0.2mg/mL、优选0.1mg/mL的浓度存在。所述荧光团选自：尼罗红、香豆素6H、香豆素6、香豆素30、香豆素102、香豆素153、7-氨基-4-(三氟甲基)香豆素、8-苯胺基萘-1-磺酸、7-羟基-4-(三氟甲基)香豆素、4,4′-二苯胺基-1,1′-联萘-5,5-二磺酸二钾盐、L-丙氨酸-7-酰氨基-4-甲基香豆素、L-脯氨酸-7-酰氨基-4-甲基香豆素、L-酪氨酸-7-酰氨基-4-甲基香豆素、L-亮氨酸-7-酰氨基-4-甲基香豆素和L-苯丙氨酸-7-酰氨基-4-甲基香豆素。

在一个实施方案中，包含在生物指示剂中的蛋白/荧光团的比值为1:1至10:1。

在另一个实施方案中，包含在生物指示剂中的蛋白/荧光团的比值为2:1至8:1。

在一个优选实施方案中，包含在生物指示剂中的蛋白/荧光团的比值为5:1。

这些荧光团能够与微生物孢子外源的传感器蛋白的不同区域相互作用，这取决于其三维结构和蛋白环境的极性。与蒸汽或热灭菌过程的温度、湿度和暴露时间有关，微生物孢子外源的传感器蛋白显示出不同的三维结构，这又涉及与荧光团的不同相互作用，从而导致不同的荧光发射强度。这是一种可以立即检测到或在非常短的孵育时间内检测到的瞬时现象。

生物指示剂对这种特定现象的依赖使得可以产生即时或瞬时结果。因此，如果需要的话，可立即实现对蒸汽或热灭菌过程的效力的确定，而无需投入长的孵育时间或昂贵的程序。在这种情况下，不需要用于酶催化活性的时间。与测量酶促反应相反，可以立即测量经受高温的蛋白三维结构的可检测变化率。

容器的顶部包括灭菌剂可穿透的医用纸和具有侧向开口的聚丙烯盖。已参照附图2详细描述了该设备。

优选地，在组装之前，将所有单元用800mg/mL的环氧乙烷灭菌2小时。然后，在无菌条件下组装所述单元，其中在无菌条件下组装之前，还用孢子接种含孢子的载体。

生物指示剂的使用方法将描述如下，并且将通过非限制性实施例进行举例说明。

本发明的方法包括

第一步，其中将生物指示剂与待进行蒸汽或热灭菌的目标材料一起放入蒸汽或热灭菌器中，

第二步，其中在50℃-145℃下进行蒸汽或热灭菌过程，

第三步，其中将生物指示剂放入预先准备的培养箱中，所述培养箱的温度设定为55-65℃，优选58-62℃，更优选60℃，并且在将生物指示剂放入培养箱中之后立即通过压碎安瓿使其破裂，

第四步，其中在将生物指示剂放入预先准备的培养箱中之后立即筛选生物指示剂的光学可检测的荧光强度变化，同时继续在预先准备的培养箱中进行生物指示剂的孵育，

第五步，其中根据第四步的荧光强度筛选结果确定蒸汽或热灭菌过程的效力，

第六步，其中将生物指示剂在55-65℃(优选58-62℃、更优选60℃)的温度下孵育24小时-168小时，

第七步，其中用比色组分对在第六步中获得的培养基进行读取，筛选24-168小时中光学可检测的颜色变化；

最后一步，其中根据第七步的比色筛选结果确定蒸汽或热灭菌过程的效力。

在本发明的方法的一个具体实施方案中，将生物指示剂与待灭菌的材料一起放入包装中。除了待灭菌的目标材料之外，所述包装也位于蒸汽或热灭菌器内，以确保生物指示剂经受与目标相同的灭菌条件，这涉及蒸汽或热灭菌器中的位置和温度。

在另一个具体的实施方案中，将生物指示剂放入先前认为灭菌剂更难以接近的区域中。然后，以通常方式进行灭菌。在此步骤期间，生物指示剂容器的盖是松动的(即管未完全被盖密封)。在某些实施方案中，灭菌在50℃-145℃下进行。蒸汽或热灭菌过程完成之后，将生物指示剂从包装中移出，并使其冷却直至其达到室温。预先准备好培养箱用于读数和检测步骤。

在一个优选的实施方案中，培养箱能够通过集成的传感器测量荧光强度。在本发明的一个更优选实施方案中，培养箱选自Terragene Incubator Reader

置于培养箱中之后，处理过的生物指示剂立即产生瞬时可检测的荧光信号。在本发明的一个具体实施方案中，所使用的波长为λ

在本发明的一个具体实施方案中，如果荧光值剧烈地变化(对应于蛋白结构的不可逆修饰)，则证明有效的灭菌。如果在孵育0至120秒之后检测到荧光强度的重要变化，这意味着灭菌是有效的，从而充分影响了微生物孢子外源的传感器蛋白的三维结构并改变了荧光团环境。

继续在55-65℃、58-62℃或60℃的温度下孵育，以允许微生物孢子生长，从而进行24-168小时的比色测试。在本发明的一个具体实施方案中，如果灭菌是无效的，则微生物孢子是有活力的并因此生长，由此培养基改变颜色。如本领域所公知的，该现象是由于由微生物生命的生长引起的变化的培养基pH或具有比色组分的代谢酶活性。

灭菌效力将通过光学上观察到的荧光变化和光学上观察到培养基的变化来确定。在一个具体的实施方案中，应使用阳性对照来观察和比较颜色变化和荧光的存在。

实施例

实施例1

该实施例使用F.&M.

在本实施例期间，将BIONOVA BT224生物指示剂(其是目前市售可得的最快的指示剂)与本发明的生物指示剂一起用于测试以获得比较数据。

使用IC10/20FRLCD培养箱获得快速读数。在60℃下，在相对湿度为80％的湿度箱中进行长期读数(7天)。

包含在本发明的生物指示剂的安瓿中的培养基由1g/L细菌蛋白胨、1g/L酵母提取物和0.5g/LL-缬氨酸组成。

根据本发明的方法，在0-20秒内用本发明的生物指示剂进行荧光读数。

对于每个具体的暴露时间，进行20次本发明的生物指示剂测试和20次对照指示剂测试。

本发明的生物指示剂的安瓿内含物如下：溴百里酚蓝用作培养基的比色组分，且0.1mg/mL的L-酪氨酸-7-酰氨基-4-甲基香豆素用作荧光团。0.5g/mL的酪蛋白用作外源传感器蛋白。

同安瓿一起，将含有2.5×10

在培养基中进行了用氨基酸异亮氨酸和色氨酸进行的实验，得出了相等的结果。

实施例2

除了此处指出的不同，重复实施例1的条件。

本发明的生物指示剂的安瓿内容物如下：溴百里酚蓝用作培养基的比色组分，且0.1mg/mL的8-苯胺基萘-1-磺酸用作荧光团。0.5g/mL的白蛋白用作外源传感器蛋白。

同安瓿一起，将含有2.5×10

实施例3

除了此处指出的不同，重复实施例1的条件。

本发明的生物指示剂的安瓿内容物如下：5-溴-4-氯-3-吲哚基β-D-吡喃半乳糖苷用作培养基的比色组分，且0.1mg/mL的8-苯胺基萘-1-磺酸用作荧光团。0.5g/mL的酪蛋白用作外源传感器蛋白。

同安瓿一起，将含有2.5×10

实施例4

除了此处指出的不同，重复实施例1的条件。

本发明的生物指示剂的安瓿内容物如下：溴百里酚蓝用作培养基的比色组分，且0.1mg/mL的8-苯胺基萘-1-磺酸用作荧光团。

同安瓿一起，将含有2.5×10

实施例5

除了此处指出的不同，重复实施例1的条件。

本发明的生物指示剂的安瓿内容物如下：溴百里酚蓝用作培养基的比色组分，且0.1mg/mL的L-酪氨酸-7-酰氨基-4-甲基香豆素用作荧光团。0.5g/mL的酪蛋白用作外源传感器蛋白。

同安瓿一起，将含有2.5×10

在该实施例中，鉴于BIONOVA BT224指示剂仅适用于高暴露温度，没有将BIONOVABT224生物指示剂与本发明一起用于本实施例中的测试以获得比较数据。

权利要求书(按照条约第19条的修改)

1.一种用于确定蒸汽或热灭菌过程的效力的生物指示剂，其中所述生物指示剂在单个容器中包括：

一组微生物孢子，

至少一种传感器蛋白，

荧光团，和

培养基，

当所述至少一种传感器蛋白没有由于蒸汽或热灭菌过程而处于变性状态时，所述至少一种传感器蛋白能够与所述荧光团相互作用，

根据所述至少一种传感器蛋白的三维结构和环境的极性，

所述荧光团能够与所述至少一种传感器蛋白进行差异性相互作用，所述差异性相互作用产生与所述至少一种传感器蛋白的催化活性无关的光学可检测的信号，并且在蒸汽或热灭菌过程之后，使培养基与所述一组微生物孢子接触，以及

所述培养基能够诱导在蒸汽或热灭菌过程之后存在的任何有活力的微生物生命的生长，以及

所述培养基包含在存在微生物生长的情况下能够经历光学可检测的颜色变化的比色组分。

2.权利要求1的生物指示剂，其中所述微生物孢子是来源于细菌的孢子，所述细菌选自萎缩芽孢杆菌(B.atrophaeus)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(G.stearothermophilus)和短小芽孢杆菌(B.pumilus)。

3.权利要求1的生物指示剂，其中所述一组微生物孢子包埋于由多孔材料制成的载体中。

4.权利要求1的生物指示剂，其中所述一组微生物孢子包埋于容器中。

5.权利要求1的生物指示剂，其中所述一组微生物孢子包埋于载体中，所述载体由选自纤维素、聚丙烯纤维材料和高密度聚乙烯纤维的材料制成。

6.权利要求1的生物指示剂，其中所述至少一种传感器蛋白选自：纤维蛋白、弹性蛋白、酪蛋白、胶原蛋白、肌动蛋白、角蛋白、白蛋白、溶菌酶、淀粉酶、脂肪酶、胃蛋白酶、葡糖苷酶、磷酸酶、半乳糖苷酶和胰凝乳蛋白酶。

7.权利要求1的生物指示剂，其中所述荧光团选自尼罗红、香豆素6H、香豆素6、香豆素30、香豆素102、香豆素153、7-氨基-4-(三氟甲基)香豆素、8-苯胺基萘-1-磺酸、7-羟基-4-(三氟甲基)香豆素、4,4′-二苯胺基-1,1′-联萘-5,5-二磺酸二钾盐、L-丙氨酸-7-酰氨基-4-甲基香豆素、L-脯氨酸-7-酰氨基-4-甲基香豆素、L-酪氨酸-7-酰氨基-4-甲基香豆素、L-亮氨酸-7-酰氨基-4-甲基香豆素和L-苯丙氨酸-7-酰氨基-4-甲基香豆素。

8.权利要求1的生物指示剂，其中所述培养基包含0.03g/L的pH指示剂或比色组分。

9.权利要求1的生物指示剂，其中所述培养基的比色组分选自溴甲酚紫、溴甲酚绿、酚红、百里酚蓝、溴酚蓝、溴百里酚蓝、6-氯-3-羟基吲哚-α-D-吡喃葡萄糖苷、5-溴-4-氯-3-吲哚基α-D-吡喃葡萄糖苷、6-氯-3-羟基吲哚-β-D-吡喃半乳糖苷、5-溴-4-氯-3-吲哚基β-D-吡喃半乳糖苷和5-溴-4-氯-3-羟基吲哚磷酸盐。

10.权利要求1的生物指示剂，其中所述培养基包含在与所述微生物孢子分开的容器中。

11.权利要求1的生物指示剂，其中所述培养基具有6至9的调节后pH。

12.权利要求1的生物指示剂，其中所述至少一种传感器蛋白包含在能够被压碎以在生物指示剂中释放其内容物的单独的安瓿中。

13.权利要求1的生物指示剂，其中所述至少一种传感器蛋白包埋于生物指示剂内的载体中。

14.权利要求1的生物指示剂，其中包含在所述生物指示剂中的蛋白/荧光团的比值范围为1:1至10:1。

15.一种通过自包含的生物指示剂确定蒸汽或热灭菌过程的效力的方法，其中所述生物指示剂在单个容器中包括：

一组微生物孢子，

至少一种传感器蛋白，

荧光团，和

培养基，

当所述至少一种传感器蛋白没有由于蒸汽或热灭菌过程而处于变性状态时，所述至少一种传感器蛋白能够与所述荧光团相互作用，

根据所述至少一种传感器蛋白的三维结构和环境的极性，

所述荧光团能够与所述至少一种传感器蛋白进行差异性相互作用，所述差异性相互作用产生与所述至少一种传感器蛋白的催化活性无关的光学可检测的信号，并且在蒸汽或热灭菌过程之后，使培养基与所述一组微生物孢子接触，以及

所述培养基能够诱导在蒸汽或热灭菌过程之后存在的任何有活力的微生物生命的生长，以及

所述培养基包含在存在微生物生长的情况下能够经历光学可检测的颜色变化的比色组分，

其中所述方法包括以下步骤：

a)将所述生物指示剂与待进行蒸汽或热灭菌的目标材料一起放入蒸汽或热灭菌器中，

b)进行蒸汽或热灭菌过程，

c)将所述生物指示剂放入培养箱中，

d)筛选所述生物指示剂的荧光强度的即时可检测的变化，同时在培养箱中孵育所述生物指示剂，

e)基于步骤d)中进行的筛选确定蒸汽或热灭菌过程的效力，

f)延长步骤d)中获得的生物指示剂的孵育，

g)筛选步骤e)中获得的孵育的生物指示剂的光学可检测的颜色变化，以及

h)根据步骤g)中获得的光学可检测的变化，确定蒸汽或热灭菌过程的效力。