一种耐高温芽孢杆菌超高密度固体发酵方法

摘要

本发明公开了一种耐高温芽孢杆菌超高密度固体发酵方法，包括如下步骤：（1）菌种活化：将耐高温芽孢杆菌在LB固体培养基中培养，得到活化菌种；（2）液体种子液制备：将步骤（1）得到的活化菌种接种到液体LB培养基中培养；（3）固体发酵：将步骤（2）中准备好的液体种子液接种至固体发酵培养基中，发酵，得到高密度芽孢杆菌，其中所述的发酵培养基包括琼脂。本发明通过优化固体培养基中加入琼脂作为保水剂，实现了耐高温芽孢杆菌的超高密度固体发酵，最终菌剂产品的菌落数大大超过菌剂标准，可以达到100亿CFU/g。

说明书

技术领域

本发明涉及厨余废弃物处理技术领域，具体涉及一种耐高温芽孢杆菌超高密度固体发酵方法。

背景技术

厨余垃圾主要指厨余垃圾是指居民日常生活及食品加工、饮食服务、单位供餐等活动中产生的垃圾，包括丢弃不用的剩菜、剩饭、果皮、蛋壳、骨头等，随着居民生活水平的提高以及餐饮业的快速发展，我国的厨余垃圾产量不断的增长。传统的填埋，焚烧以及喂猪等方式无法满足人们对健康，卫生，以及资源循环利用的要求，所以目前可以采用厨余垃圾处理设备进行脱水处理，再通过生物发酵产出有机肥料，进行农业生产，实现资源的可循环利用。但是考虑到厨余垃圾高油脂含量、高含盐率等特点会导致堆肥品质不良的特点，因此我们需要耐盐可降油脂的高温菌来进行生物发酵，高温菌不但在高温环境中代谢能力强，还大大缩短了厨余垃圾生物转化的时间，提高了有机物的降解效率。

目前微生物菌剂发酵的方式主要有液体发酵和固体发酵，液体发酵需要发酵后再进行干燥，耗能较大，提高了生产成本，而且工艺程序比较多，对人员和设备都有较高的要求；固体发酵在发酵后不需要耗费巨大的时间和电量进行干燥，可以直接晾干粉碎使用，工艺相对简单，人工和设备成本都比较少，大大节约了投资成本。

但是对于耐高温微生物的发酵，保持高温条件的同时也要满足发酵培养基的含水率，以保证微生物有相对充足的活动空间以利用培养基中的营养物质。所以我们在固体发酵培养基中加入保水剂，以维持微生物生活的良好环境。

发明内容

发明目的：本发明要解决的技术问题是提供一种耐高温芽孢杆菌超高密度固体发酵方法。

技术方案：为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

一种耐高温芽孢杆菌超高密度固体发酵方法，包括如下步骤：

（1）菌种活化：将耐高温芽孢杆菌在LB固体培养基中培养，得到活化菌种；

（2）液体种子液制备：将步骤（1）得到的活化菌种接种到液体LB培养基中培养；

（3）固体发酵：将步骤（2）中准备好的液体种子液接种至固体发酵培养基中，发酵，得到高密度芽孢杆菌；

其中，所述固体发酵培养基的配置方法如下：按重量份数称取如下物料：麸皮60~70份、豆粕粉20~25份，玉米粉5~10份，碳酸钙为3~5份，将所有原料置于搅拌机中混匀，以1g:1.5 mL的比例加入水，再加入5g/L琼脂粉，用石灰调节pH至7，再灭菌，得到固体发酵培养基。

步骤（1）中，耐高温芽孢杆菌在LB固体培养基中培养的时间为20-25h。

步骤（2）中，在LB培养基中培养的条件为：150~200r/min、37~60℃培养3~5d。

步骤（3）中，种子液的接种量为固体发酵培养基质量的5~7%。

步骤（3）中，所述的发酵，其发酵条件如下：180-200r/min、50-60℃培养3d。

有益效果：

本发明通过优化固体培养基的配方，实现了耐高温芽孢杆菌的超高密度固体发酵，最终菌剂产品的菌落数大大超过菌剂标准，可以达到100亿CFU/g，培养基中加入保水剂琼脂，防止高温发酵过程中水分的过度蒸发，也减少了人工中途不断加水的精力和成，超高密度原料价廉，操作简便，无危险性，适合大规模生产。本发明中琼脂作为一种常见的试剂，其对微生物生长无毒无害，低廉易得，且对环境也没有污染，可以作为超高密度固体发酵的一种保水剂。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1：

1.菌种活化：LB肉汤20g/L，琼脂20g/L，pH为7，制备LB固体培养基，灭菌。提前将保存于-20℃冰箱中的菌种保存管取出，待结冰完全溶解。在无菌超净台中用平板划线法将菌种接种至LB固体培养基，在60℃条件下培养20h，即得到活化菌种，备用。

2.超高密度发酵

（1）液体种子液配制

牛肉膏3g/L，蛋白胨10g/L，NaCl5g/L，pH=7，灭菌备用。将活化好的菌株接种至的50mL液体培养基中，在180r/min、60℃摇床中培养3d，备用。

（2）固体发酵培养基的制备

按重量百分比称取所需的物料：麸皮60份，豆粕粉25份，玉米粉10份，碳酸钙为5份，将所有原料置于干燥的搅拌机中充分混匀，转速为30r/min，正转10min，反转10min，以1:1.5（g/mL）的比例加入一定量的水，再加入一定量的琼脂粉，其浓度为5g/L，添加一定量的石灰调节pH至7。将固体发酵培养基至于高压蒸汽灭菌锅中灭菌20min，参数设置为121℃，1.2kg/cm

（3）固体发酵

将（1）中准备好的种子液接种至（2）中的固体发酵培养基中，种子液的接种量为固体发酵培养基质量的7%，充分搅拌混匀，将固体发酵培养基置于180r/min、60℃摇床中培养3d，在常温下自然晾干，测定其菌落数为128亿CFU/g。

实施例2：

1.菌种活化：LB肉汤20g/L，琼脂25g/L，pH为7，制备LB固体培养基，灭菌。提前将保存于-80℃冰箱中的菌种（ORI-1）保存管取出，待结冰完全溶解。在无菌超净台中用平板划线法将菌种接种至LB固体培养基，在50℃条件下培养24h，即得到活化菌种，备用。

2.超高密度发酵

（1）液体种子液配制

牛肉膏3g/L，蛋白胨10g/L，NaCl5g/L，ph=7，灭菌备用。将活化好的菌株接种至的100mL液体培养基中，在180r/min、50℃摇床中培养5d，备用。

（2）固体培养基的制备

按重量百分比称取所需的物料：麸皮65%，豆粕粉25%，玉米粉7%，碳酸钙为3%，将所有原料置于干燥的搅拌机中充分混匀，转速为30r/min，正转10min，反转10min，以1:2（g/mL）的比例加入一定量的水，再加入一定量的琼脂粉，琼脂浓度为10g/L，添加一定量的石灰调节pH至8。将固体发酵培养基至于高压蒸汽灭菌锅中灭菌30min，参数设置为121℃，1.0kg/cm3。

（3）固体发酵

将（1）中准备好的种子液接种至（2）中的固体发酵培养基中，种子液的接种量为固体发酵培养基质量的5%，充分搅拌混匀，将固体发酵培养基置于180r/min、50℃摇床中培养5d，在常温下自然晾干，测定其菌落数为115亿CFU/g。

对比例1：按实施例2的方案进行实验，不加入琼脂，最后菌落数为3亿CFU/g。

对比例2：按实施例2的方案进行实验，不加入琼脂，最后菌落数为2亿CFU/g。

从实施例1~2与对比例1~2的结果可以看出，加入琼脂后可以有效提升培养基的保水能力，提高发酵密度。