重组表达载体系统、重组工程菌及其制备方法和用途

摘要

本发明提供一种重组表达载体系统、重组工程菌及其制备方法和用途，所述重组表达载体系统至少包含两个重组表达载体，每个所述重组表达载体上含有一个或多个核酸表达盒，每个核酸表达盒包含目的基因，以及与目的基因可操作地连接的启动子，每个所述目的基因分别独立选自HPV6 L1、HPV11 L1、HPV16 L1、HPV18 L1、HPV31 L1、HPV33 L1、HPV35 L1、HPV39 L1、HPV45 L1、HPV51 L1、HPV52 L1、HPV53 L1、HPV56 L1、HPV58 L1、HPV59 L1、HPV66 L1或HPV68 L1中的一种，且所有目的基因都互不相同。将重组表达载体系统转化至工程菌可以获得重组工程菌。重组工程菌可以同时表达多种HPV L1蛋白，用来制备HPV疫苗。

说明书

技术领域

本发明涉及一种生物工程技术，特别是涉及一种重组表达载体系统、重组工程菌及其制备方法和用途。

背景技术

人乳头瘤病毒(Human papillomavirus，HPV)主要感染人上皮细胞，引起上皮细胞损伤，从而导致包括生殖器疣、宫颈癌等一系列疾病，近年来，越来越多的研究表明HPV感染还可以引起其他肛门与生殖器相关癌症，如阴道癌、肛门癌、阴茎癌等，甚至还与口咽癌有关。其中关注度最高、HPV致病机理最清楚的是宫颈癌，作为世界第三大女性癌症，宫颈癌每年夺走25万人的生命，而99％以上的宫颈癌都是由于HPV感染引起的。

HPV的主要传播途径为性传播，其进入人体的主要机理与上皮细胞的微损伤有关。

目前已发现至少两百多种基因型的HPV，根据其感染后是否具有致癌性，可分为高危型和低危型两种，其中高危型HPV主要与各种恶性肿瘤相关，低危型HPV主要引起尖锐湿疣、呼吸系统刺瘤等良性肿瘤。虽然在不同的国家和地区的HPV流行病学数据有一定的差异，但总体来讲，目前世界范围内流行程度最广的高危型HPV型别为HPV16和HPV18，这两种型别与70％的宫颈癌有关，其他流行程度较高的的高危型HPV型别为HPV31、HPV33、HPV45、HPV52、HPV58等。低危型HPV的主要流行型别为HPV6和HPV11。基于以上的流行病学趋势，目前已有三种HPV预防性疫苗上市，分别是葛兰素史克的

HPV属双链DNA病毒，环状基因组全长约7900～8000bp，编码7个非结构蛋白E1～E7和2个衣壳蛋白L1、L2。其中L1蛋白为主要衣壳蛋白，360拷贝的L1蛋白组成72个五聚体，形成T＝7的病毒粒子；L2蛋白为次要衣壳蛋白，不承担结构骨架的功能，但与受体结合后的病毒DNA释放有关。HPV主要的中和表位存在于L1蛋白上，基于这些中和表位的中和抗体可有效预防HPV的感染。

基于多种重组表达系统的研究已证明单独表达L1蛋白即可形成构象接近于天然病毒粒子的病毒样颗粒(Virus-like particles,VLPs)，这些HPV-VLP保留了天然HPV的中和表位，同时缺少病毒复制必须的DNA，其安全性和可靠性已通过基于这些VLP的HPV预防性疫苗

发明内容

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种重组表达载体系统、重组工程菌及其制备方法和用途，用于解决现有技术中制备HPV抗体工艺复杂、繁琐、成本高、可控性差的问题。

本发明的第一方面提供了一种重组表达载体系统，所述重组表达载体系统至少包含两个重组表达载体，每个所述重组表达载体上含有一个或多个核酸表达盒，每个核酸表达盒包含目的基因，以及与目的基因可操作地连接的启动子，每个所述目的基因分别独立选自HPV6 L1、HPV11 L1、HPV16 L1、HPV18 L1、HPV31 L1、HPV33 L1、HPV35 L1、HPV39 L1、HPV45 L1、HPV51 L1、HPV52 L1、HPV53 L1、HPV56 L1、HPV58 L1、HPV59 L1、HPV66 L1或HPV68 L1中的一种，且所有目的基因都互不相同。

所述多个可以是两个。所述多个可以是三个。所述多个可以是四个。

一种实施方式中，所述HPV6 L1如SEQ ID NO：1所示。

一种实施方式中，所述HPV11 L1如SEQ ID NO：2所示。

一种实施方式中，所述HPV16 L1如SEQ ID NO：3所示。

一种实施方式中，所述HPV18 L1如SEQ ID NO：4所示。

一种实施方式中，所述HPV31 L1的序列为AEI60965.1。

一种实施方式中，所述HPV33 L1的序列为AAA46964.1。

一种实施方式中，所述HPV35 L1的序列为ARQ82609.1。

一种实施方式中，所述HPV39 L1的序列为AGU90477.1。

一种实施方式中，所述HPV45 L1的序列为CAA52578.1。

一种实施方式中，所述HPV51 L1的序列为AMK51256.1。

一种实施方式中，所述HPV52 L1的序列为ACX32362.1。

一种实施方式中，所述HPV53 L1的序列为ABU54083.1。

一种实施方式中，所述HPV56 L1的序列为ABO76795.1。

一种实施方式中，所述HPV58 L1的序列为ACL12325.1。

一种实施方式中，所述HPV59 L1的序列为ALT54908.1。

一种实施方式中，所述HPV66 L1的序列为ABO76872.1。

一种实施方式中，所述HPV68L1的序列为AGU90680.1。

HPV6 L1 DNA编码序列(SEQ ID NO：1)

atgtggagaccatctgactcgactgtctacgttcctccacctaacccagtctctaaggttgtggctaccgacgcctacgtgactagaaccaacatcttctaccacgcatcgtcctctagattgctggccgttggacatccttacttctccatcaagagagccaacaaaaccgtcgtgccaaaggtttctggctaccagtatagagtcttcaaggtggttctgcctgaccctaacaagtttgccctgccagactcgtccttgttcgatcctacgactcaaagactcgtttgggcctgcactggtcttgaggttggcagaggacagccactcggagtcggcgtttctggtcatcctttcctgaacaagtacgacgatgttgagaactctggttccggaggcaatcctggacaggacaacagagtcaatgttggcatggactacaagcaaactcagctctgtatggtgggatgcgcacctccactgggtgagcattggggaaaaggcaagcagtgcaccaacactccagttcaggcaggtgactgccctccattggagctgattacctcggtcatccaggacggtgatatggttgacaccggattcggtgccatgaacttcgctgacctgcagaccaacaagtccgatgtgccaatcgacatctgcggaacgacctgtaaataccctgactacttgcagatggcagccgatccatacggcgacagactcttcttctttctgagaaaggagcagatgtttgctagacactttttcaacagagccggagaggtcggtgagcctgttccagacaccctgatcattaagggctcgggaaacagaacttctgtcggctcctcgatctacgtgaacaccccttccggttcgttggtgtcgtccgaggctcaactgttcaacaagccatactggctccagaaagcccaaggtcacaacaatggcatctgctggggtaaccagctgttcgttactgtcgtggacaccacgagatcgaccaacatgactctgtgtgcctccgttaccacatcttcgacttacaccaactccgactataaggagtacatgagacacgttgaagagtacgacttgcaattcatctttcagctctgctcgattaccctgtccgcagaagtcatggcctacatccacactatgaatccatcggtgcttgaggactggaactttggcttgtccccacctccaaacggaactctggaagacacctatagatacgtgcagtcgcaagccatcacgtgccagaagccaacccctgagaaggaaaagccagatccttacaagaacctgtccttctgggaggtcaatctcaaggagaagttctcgtccgaactggaccagtacccattgggtagaaagttcctgctccagtctggataccgtggtagatcgtccatcagaaccggagtgaagagaccagcagtttccaaggcttctgccgcacctaagcgtaaaagagccaagaccaagagataatag

HPV11 L1 DNA编码序列(SEQ ID NO：2)

atgtggagaccatctgactcgaccgtctacgttcctccacctaacccagtctccaaagtggttgctactgatgcctacgtcaagagaaccaacatcttctaccacgcctcttcgtccagattgctggcagttggacatccttactattccatcaagaaagttaacaagaccgtggtccctaaggtttcgggctatcagtacagagtgttcaaggtcgttctgccagaccctaacaagtttgccttgccagattcctcgctgttcgaccctaccactcaaagactggtttgggcttgcacgggtttggaagtgggcagaggacaaccactgggtgtcggagtttccggccatccattgctgaacaagtacgacgatgttgagaactcgggtggatacggtggcaatccaggacaagacaacagagtgaatgtcggcatggactacaagcaaacccagctgtgcatggttggttgtgcaccacctctgggtgaacattggggaaagggcactcagtgctccaacacctctgttcagaatggtgactgtcctccactggagctgatcacctcggttattcaggatggagacatggtggacactggcttcggtgcaatgaactttgccgacttgcagaccaacaagtccgatgttccattggacatttgcggcactgtgtgcaaatatcctgactacctgcagatggctgcagatccatacggtgacagactcttcttctacctgagaaaggagcagatgttcgccagacacttctttaacagagctggcaccgttggtgagcctgttccagatgacctgttggtgaagggtggaaacaatagatcctctgttgcctcgtccatctacgtccacaccccatcgggctctctggtgtcctcggaggcccaactgttcaacaagccttactggctccagaaggcccaaggacacaacaatggcatctgctggggaaaccacctgttcgtcaccgttgtggacacgactagatccaccaacatgactttgtgtgcctctgtttccaagtcggctacctacacgaactcggactataaggagtacatgagacatgttgaagagttcgacctgcagtttatcttccagctctgctccattaccttgtcggcagaagtgatggcctacatccacacgatgaacccatccgtcttggaagactggaacttcggtctgtctccacctccaaatggcaccctggaagacacgtacagatatgtgcagtcgcaagccatcacctgtcagaaaccaactcctgaaaaggagaaacaggacccatacaaggatatgtcgttctgggaggtcaacctgaaggagaagttctcttcggaactggaccagttcccattgggaagaaagttcctgctccagtctggttatagaggaagaacctccgcaagaactggcatcaagagacctgccgtgtcgaagccatccaccgctcctaagagaaagagaacgaagaccaaaaagtaatag

HPV16 L1 DNA编码序列(SEQ ID NO：3)

atgtctctttggttgccatccgaggctactgtttacttgccacctgtcccagtttctaaggtcgtgtcaactgatgaatacgttgctagaaccaacatctattaccacgctggaacttctagattgcttgctgttggtcatccatacttccctatcaagaaacctaacaataacaagatccttgttccaaaggtctctggattgcagtacagagttttcagaatccacttgcctgacccaaacaagttcggttttcctgacacctccttctacaacccagatactcaaagattggtgtgggcctgtgttggtgtcgaggttggacgtggtcaaccattgggagttggtatttctggacatcctttgcttaacaagttggatgacactgaaaatgcttctgcctacgcagccaacgctggtgttgacaacagagagtgtatctctatggattacaaacagacccaattgtgtcttattggttgcaagccacctattggtgaacactggggtaagggatctccatgtaccaacgttgctgtcaatccaggtgattgtcctccattggagcttatcaacactgttattcaagatggtgacatggttgatactggatttggtgctatggacttcactaccttgcaagctaacaagtccgaggttccattggacatttgtacttctatctgcaagtatccagactacattaagatggtctctgaaccatacggtgactccttgtttttctaccttcgtagagagcaaatgtttgttagacacttgttcaacagagctggtgccgttggtgagaatgtcccagacgatttgtacatcaagggatctggttccactgcaaacttggcctcttccaactacttcccaactccttcaggttctatggttacctccgatgctcaaatcttcaacaagccttactggttgcaaagagcacagggtcacaacaatggaatttgttggggtaaccaacttttcgttactgtcgttgataccacaagatccaccaacatgtccttgtgtgctgccatttctacttcagaaaccacatacaagaatactaacttcaaggagtaccttagacatggtgaggaatacgacttgcagttcatctttcaattgtgcaagattaccttgactgctgacgttatgacctacatccactctatgaactccactatccttgaagattggaacttcggattgcaaccacctccaggtggaaccttggaagatacttacagatttgtcacatcccaagccattgcttgtcagaagcacactcctccagctcctaaggaagatccacttaagaaatacaccttctgggaagtcaacttgaaagagaagttctctgctgaccttgatcagtttcctttgggtagaaagttcttacttcaagctggattgaaggccaaaccaaagttcaccttgggtaaaagaaaggctactccaaccacatcatctacttccacaaccgccaaacgtaagaagagaaaactgtaatag

HPV18 L1 DNA编码序列(SEQ ID NO：4)

atggctctgtggagaccatctgacaacaccgtctacttgccacctccatctgttgccagagtcgttaacaccgacgattacgtcactagaacatccatcttctaccacgctggttcctctagattgcttactgttggtaatccatacttcagagttccagctggtggaggtaataagcaagacattcctaaggtttctgcttaccaatatagagtctttagagttcagttgcctgacccaaacaagttcggtttgcctgatacttctatctacaacccagagactcaaagattggtttgggcctgtgctggtgtcgagatcggtagaggacaacctttgggagttggtctttctggacacccattctacaacaagttggatgacactgaatcttcacatgctgccacttccaatgtttctgaggatgttcgtgacaacgtctctgttgattacaagcaaactcagttgtgtatccttggatgtgcccctgctattggtgaacactgggctaaaggtactgcctgtaagtccagaccattgtctcaaggtgactgcccacctttggagcttaagaacactgttttggaagatggtgacatggttgatactggatatggtgctatggacttctctaccctgcaggatactaagtgtgaggttccattggacatctgtcaatctatttgtaagtaccctgattatcttcagatgtctgctgacccatacggtgattctatgttcttttgcttgagacgtgagcaacttttcgctagacacttttggaacagagcaggtactatgggtgacaccgttccacaatctttgtatatcaaaggaactggtatgagagcttctcctggatcctgtgtttactcaccatctccttccggttctattgttacctcagactctcaattgtttaacaagccatactggttacacaaggctcagggtcataacaatggtgtttgctggcacaaccaattgttcgttactgtcgttgacaccactagatccaccaatttgacaatttgtgcttctactcagtcccctgttccaggtcaatatgatgctaccaaattcaagcaatactctagacacgttgaggaatatgacttgcagtttatcttccaattgtgtactattaccttgactgccgatgttatgtcttacattcattccatgaactcttcaatcttggaggattggaactttggtgttccaccacctccaacaacttctttggttgacacctacagattcgtccaatctgttgctattacctgtcagaaggatgccgcaccagctgaaaacaaggatccatacgacaagttgaagttttggaatgtcgatttgaaggagaagttctcccttgacttggatcaatacccacttggtagaaagttcttggttcaggctggtttgagacgtaagccaactatcggtccaagaaaacgttctgctccatcagccactacctcttccaaacctgctaagagagttcgtgtcagagctagaaagtaatag

进一步地，每个所述核酸表达盒内的启动子选自MOX。所述MOX的序列如SEQ IDNO：5所示。

进一步地，每个所述核酸表达盒内的终止序列选自AOXTT。所述AOXTT的序列如SEQID NO：6所示。

MOX DNA序列(SEQ ID NO：5)

gtcgacgcggagaacgatctcctcgagctgctcgcggatcagcttgtggcccggtaatggaaccaggccgacggcacgctccttgcggaccacggtggctggcgagcccagtttgtgaacgaggtcgtttagaacgtcctgcgcaaagtccagtgtcagatgaatgtcctcctcggaccaattcagcatgttctcgagcagccatctgtctttggagtagaagcgtaatctctgctcctcgttactgtaccggaagaggtagtttgcctcgccgcccataatgaacaggttctctttctggtggcctgtgagcagcggggacgtctggacggcgtcgatgaggcccttgaggcgctcgtagtacttgttcgcgtcgctgtagccggccgcggtgacgatacccacatagaggtccttggccattagtttgatgaggtggggcaggatgggcgactcggcatcgaaatttttgccgtcgtcgtacagtgtgatgtcaccatcgaatgtaatgagctgcagcttgcgatctcggatggttttggaatggaagaaccgcgacatctccaacagctgggccgtgttgagaatgagccggacgtcgttgaacgagggggccacaagccggcgtttgctgatggcgcggcgctcgtcctcgatgtagaaggccttttccagaggcagtctcgtgaagaagctgccaacgctcggaaccagctgcacgagccgagacaattcgggggtgccggctttggtcatttcaatgttgtcgtcgatgaggagttcgaggtcgtggaagatttccgcgtagcggcgttttgcctcagagtttaccatgaggtcgtccactgcagagatgccgttgctcttcaccgcgtacaggacgaacggcgtggccagcaggcccttgatccattctatgaggccatctcgacggtgttccttgagtgcgtactccactctgtagcgactggacatctcgagactgggcttgctgtgctggatgcaccaattaattgttgccgcatgcatccttgcaccgcaagtttttaaaacccactcgctttagccgtcgcgtaaaacttgtgaatctggcaactgagggggttctgcagccgcaaccgaacttttcgcttcgaggacgcagctggatggtgtcatgtgaggctctgtttgctggcgtagcctacaacgtgaccttgcctaaccggacggcgctacccactgctgtctgtgcctgctaccagaaaatcaccagagcagcagagggccgatgtggcaactggtggggtgtcggacaggctgtttctccacagtgcaaatgcgggtgaaccggccagaaagtaaattcttatgctaccgtgcagtgactccgacatccccagtttttgccctacttgatcacagatggggtcagcgctgccgctaagtgtacccaaccgtccccacacggtccatctataaatactgctgccagtgcacggtggtgacatcaatctaaagtacaaaaacaaa

AOXTT DNA序列(SEQ ID NO：6)

gtttgtagccttagacatgactgttcctcagttcaagttgggcacttacgagaagaccggtcttgctagattctaatcaagaggatgtcagaatgccatttgcctgagagatgcaggcttcatttttgatacttttttatttgtaacctatatagtataggattttttttgtcattttgtttcttctcgtacgagcttgctcctgatcagcctatctcgcagctgatgaatatcttgtggtaggggtttgggaaaatcattcgagtttgatgtttttcttggtatttcccactcctcttcagagtacagaagattaagtgagaccttcgtttgtgcggatc

进一步地，每个所述重组表达载体还包含一个或者多个含有选择物标记基因的核酸表达盒。

进一步地，所述选择物标记基因选自抗生素抗性基因。所述抗生素抗性基因可以是Zeocin抗性基因、G418抗性基因或者其他目前常用的抗生素抗性基因。

进一步地，所述启动子选自酵母表达片段。所述启动子基因可选自MOX、GAPDH、DAS或者其他酵母可用的启动子。

进一步地，所述重组表达载体通过将目的基因插入质粒获得。例如质粒可以是pPICZB。

进一步地，所述重组表达载体系统包含两个重组表达载体，每个重组表达载体上包含两个核酸表达盒，两个核酸表达盒的目的基因分别独立的选自HPV6 L1、HPV11 L1、HPV16 L1、HPV18 L1、HPV31 L1、HPV33 L1、HPV35 L1、HPV39 L1、HPV45 L1、HPV51 L1、HPV52L1、HPV53 L1、HPV56 L1、HPV58 L1、HPV59 L1、HPV66 L1或HPV68 L1中的一种，且所选目的基因都互不相同。

本发明的第二方面提供了一种重组工程菌，其包含如上所述的重组表达载体系统。

进一步地，所述重组工程菌是酵母。

进一步地，所述酵母选自酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)、脆壁克鲁维氏酵母(Kluyveromyces fragilis)、乳酸克鲁维氏酵母(Kluyveromyces lactis)，或栗酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)中的任一种或多种。

本发明的第三方面提供了一种上述重组表达载体系统的制备方法，所述方法为通过改造原始质粒获得，具体包括以下步骤：将目的基因的启动子和终止序列分别替换两个原始质粒的启动子和终止序列；再将目的基因分别插入启动子和终止序列之间。

进一步地，所述方法为：将质粒pPICZB改造获得，具体包括以下步骤：

(1)质粒pMMZ的构建：采用第一启动子MOX插入片段和第一终止序列AOXTT分别替换质粒pPICZB中的启动子和终止序列，获得质粒pMOXZ-1；采用第二启动子MOX插入片段和第二终止序列AOXTT分别替换质粒pPICZB中的启动子和终止序列，获得质粒pMOXZ-2；连接质粒pMOXZ-1和质粒pMOXZ-2；

(2)替换质粒上的选择标记物基因，获得与步骤(1)中的质粒具有不同选择标记物基因的质粒；

(3)将目的基因分别插入步骤(1)和步骤(2)构建的质粒中获得重组表达载体。

进一步地，所述目的基因分别独立选自HPV6 L1、HPV11 L1、HPV16 L1、HPV18 L1、HPV31 L1、HPV33 L1、HPV35 L1、HPV39 L1、HPV45 L1、HPV51 L1、HPV52 L1、HPV53L1、HPV58L1、HPV59 L1、HPV66 L1或HPV68 L1中的至少一种。

进一步地，所述第一启动子MOX插入片段为采用SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8所示序列为引物，汉逊酵母基因组DNA为模板，扩增得到。

进一步地，所述第一终止序列AOXTT采用SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11所示序列为引物，pPICZB质粒为模板，扩增得到。

更进一步地，质粒pMOXZ-1为采用BglII+NdeI联合酶切处理MOX启动子插入片段，NdeI+BamHI处理AOXTT终止序列片段，BglII+BamHI处理pPICZB，再用小牛肠碱性磷酸酶处理pPICZB-BglII+BamHI片段，三片段连接后得到。

进一步地，所述第二启动子MOX插入片段为采用SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9所示序列为引物，汉逊酵母基因组DNA为模板，扩增得到。

进一步地，所述第二终止序列AOXTT为采用SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12所示序列为引物，pPICZB质粒为模板，扩增得到。

更进一步地，质粒pMOXZ-2为采用BglII+HindIII联合酶切处理MOX启动子插入片段，HindIII+BamHI处理AOXTT终止序列片段，BglII+BamHI处理pPICZB，再用小牛肠碱性磷酸酶处理pPICZB-BglII+BamHI片段，三片段连接后得到。

本发明的第四方面提供了一种重组工程菌的制备方法，所述方法为将上述重组表达载体系统转化至工程菌中获得。

本发明的第五方面提供了上述重组表达载体系统或重组工程菌在制备HPVL1蛋白中的用途。

本发明的第六方面提供了一种制备HPVL1蛋白的方法，所述选自以下两种的任意一种：

a.将如上所述的重组表达载体系统转化至重组工程菌中，利用重组工程菌表达HPVL1蛋白；

b.利用如上所述的重组工程菌表达HPVL1蛋白获得。

利用上述方法获得的HPVL1蛋白至少有两种亚型。

本发明的第七方面提供了一种蛋白，所述蛋白采用如上所述的制备HPVL1蛋白的方法制备获得。

如上所述，本发明的多基因重组表达片段、表达载体系统、重组工程菌及其制备方法和用途，具有以下有益效果：

本发明制备的重组工程菌可以用来制备HPV疫苗。重组工程菌可以同时表达多种HPVL1蛋白。实验结果显示，Quadri-L1免疫后血清可诱导HPV抗体，抗体滴度水平相近，具有一定的量效关系。

附图说明

图1显示为本发明酵母双表达质粒pMMZ结构示意图。

图2显示为本发明酵母双表达质粒pMMG结构示意图。

图3显示为本发明HPV6 L1/HPV11 L1双表达质粒结构示意图。

图4显示为本发明HPV16 L1/HPV18 L1双表达质粒结构示意图。

图5显示为本发明6L1-11L1-pMMG、16L1-18L1-pMMZ酶切鉴定结构示意图。

其中1.6L1-11L1-pMMG未酶切；2.6L1-11L1-pMMG NheI+NotI酶切鉴定；3.6L1-11L1-pMMG BstBI+SbfI酶切鉴定；4.16L1-18L1-pMMZ未酶切；5.16L1-18L1-pMMZ NheI+NotI酶切鉴定；6.16L1-18L1-pMMZ BstBI+SbfI酶切鉴定；7.250bp DNAMarker(Takara).

图6显示为本发明型别特异性中和单抗检测HPV16 L1/HPV18 L1双表达菌株破菌上清。

A1～A6、B1～B2：H16.V5检测16L1-18L1-CBS4732-1～8#；B3：H16.V5检测阳性对照(HPV16 L1标准品)；C1～C6、D1～D2：H18.J4检测16L1-18L1-CBS4732-1～8#；D3：H18.J4检测阳性对照(HPV18 L1标准品)。

图7显示为本发明型别特异性中和单抗检测HPV6 L1/HPV11 L1/HPV16 L1/HPV18L1四表达菌株破菌上清。

A1～A10、B7：H6.M48检测6L1-11L1-16L1-18L1-CBS4732-1～11#；B1、B8：H6.M48检测阳性对照(HPV6 L1标准品)；

C1～C10、D7：H11.H3检测6L1-11L1-16L1-18L1-CBS4732-1～11#；D1、D8：H11.H3检测阳性对照(HPV11 L1标准品)；

E1～E10、F7：H16.V5检测6L1-11L1-16L1-18L1-CBS4732-1～11#；F1、F8：H16.V5检测阳性对照(HPV16 L1标准品)；

A1～A10、H7：H18.J4检测6L1-11L1-16L1-18L1-CBS4732-1～11#；H1、H8：H18.J4检测阳性对照(HPV18 L1标准品)；

图8显示为本发明Quadri-L1-VLP透射电子显微镜图。

图9显示为本发明Quadri-L1鼠血清几何抗体平均滴度(GMT)。

具体实施方式

术语“多核苷酸”和“核酸”在本文中可互换使用，并且通常是指基本上由核苷酸，例如脱氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸组成的任何长度的聚合物。核酸可包含嘌呤和/或嘧啶碱基，和/或其他天然的、化学或生物化学修饰的(例如甲基化的)、非天然的或衍生化的核苷酸碱基。核酸的主链可以包含糖和磷酸基团，如通常可以在RNA或DNA中发现的，和/或一种或多种修饰的或取代的(例如，2'-O-烷基化，例如，2'-O-甲基化或2'-O-乙基化；或2'-O,4'-C-炔基化，例如2'-O,4'-C-乙基化)糖或一个或多个修饰或取代的磷酸基团。

术语“核酸表达盒”指包含一种或多种转录控制元件(例如但不限于启动子、增强子、多腺苷酸化序列和内含子)的核酸分子，所述转录控制元件指导与它们可操作地连接的(转)基因表达。

术语“可操作地连接”是指各种核酸分子元件相对于每一种的排列，使得元件功能性连接并且能够在基因表达的背景下彼此相互作用。此类元件可以包括但不限于启动子、增强子、多腺苷酸化序列、一个或多个内含子、以及待表达的感兴趣基因的编码序列(例如目的基因)。当适当取向或可操作地连接时，核酸序列元件一起起作用以确保或调节编码序列的表达。调节是指增加、降低或维持特定元件的活性水平。每个元件相对于其他元件的位置可以以每个元件的5'末端和3'末端而言表示，并且任何特定元件之间的距离可以通过元件之间的居间核苷酸或碱基对的数目来表示。

术语“目的基因”是指要在导入有核酸序列的宿主细胞中表达的编码多肽或多肽的一部分的特定核酸序列。如何将核酸序列导入宿主细胞中不是必需的，例如它可以通过整合到基因组中或作为附加型质粒。

术语“启动子”是指能够结合RNA聚合酶并且启动与其可操作连接的一个或多个核酸编码序列(例如目的基因)的转录的核酸序列。启动子通常位于同一链上的基因的转录起始位点附近和核苷酸编码序列的上游(有义链中的5')。启动子可以单独发挥功能以调节转录或可以通过一个或多个调节序列(例如增强子或沉默子)进一步调节。

术语“转录终止序列”包括转录单元末端的控制序列，其表示转录的3'加工和终止。

术语“选择标志物基因”包括赋予表达它的宿主细胞表型以促进鉴定和/或选择用转基因转染或转化的宿主细胞的任何基因。

术语“载体”是指可以接受多核苷酸插入或克隆的多核苷酸分子，优选源自例如质粒、噬菌体或植物病毒的DNA分子。载体优选含有一个或多个独特的限制性内切酶位点，并且可以能够在确定的宿主细胞中自主复制，或者可以整合在确定的宿主的基因组内，使得克隆的序列是可复制的。载体的选择通常取决于载体与要导入载体的宿主细胞的相容性。

术语“重组工程菌”是指用于转化的那些细胞，即用于表达目的基因的细胞。重组工程菌可以是分离的细胞或培养物中培养的细胞系，或者是存在于活组织或生物体中的细胞。在本发明的上下文中，宿主细胞优选是能够在培养物中生长的细胞。

术语“转化”是指将外源核酸导入生物体中，使得核酸可作为染色体外元件或通过染色体整合而复制。

本文提供的表达片段包含至少第一核酸表达盒和第二核酸表达盒，其中所述第一核酸表达盒和所述第二核酸表达盒不是彼此的拷贝，并且其中每个表达盒包含可操作地连接到一个或更多个目的基因的启动子。每个表达盒上连接在每个目的基因上的启动子可以相同也可以不同。在优选的实施例中为采用相同的启动子。

其他序列可以掺入根据本发明的核酸表达盒中。更具体地，核酸表达盒包括进一步增加或稳定转基因产物表达的序列(例如内含子和/或转录终止序列)。

优选地，本文涵盖的表达片段包含选择标志物基因。所述选择标志物基因优选不包含在表达片段的核酸表达盒中。因此，在实施方案中，本文涵盖的表达片段还包含一个或多个包含选择标志物基因的核酸表达盒。选择标志物基因的表达可以指示宿主细胞的核酸表达盒已经转化，因此，允许选择经转化的宿主细胞。选择标志物基因盒通常还包括启动子和转录终止子序列，其可操作地连接到选择标志物基因。

合适的标志物可以选自赋予抗生素抗性、视觉标志物或互补宿主细胞营养缺陷的标志物。例如，选择标志物可以赋予对抗生素如潮霉素B(如hph基因)、zeocin/腐草霉素(如ble基因)、卡那霉素或G418(如nptII或aphVIII基因)、壮观霉素(如aadA基因)、新霉素(如aphVIII基因)、杀稻瘟素(如bsd基因)、诺尔丝菌素(如natR基因)、嘌呤霉素(如pac基因)和巴龙霉素(如aphVIII基因)的抗性。也可以使用视觉标志物并包括例如β-葡糖醛酸酶(GUS)、萤光素酶和荧光蛋白，如绿色荧光蛋白(GFP)、黄色荧光蛋白等。营养缺陷的两个突出实例是氨基酸亮氨酸缺陷(例如LEU2基因)或尿嘧啶缺陷(例如URA3基因)。乳清苷-5'-磷酸脱羧酶阴性(ura3-)的细胞不能在缺乏尿嘧啶的培养基上生长。因此，功能性URA3基因可以在具有尿嘧啶缺陷的宿主细胞上用作选择标志物，并且可以在缺乏尿嘧啶的培养基上选择成功的转化体。仅用功能性URA3基因转化的细胞能够合成尿嘧啶并在此类培养基上生长。如果野生型菌株不具有尿嘧啶缺陷，则必须制备具有缺陷的营养缺陷型突变体，以便使用URA3作为菌株的选择标志物。实现这点的方法是本领域公知的。

本文涵盖的表达盒可以原样使用，或者通常，它们可以是核酸载体的一部分(即导入核酸载体)。本文公开的表达片段的核酸表达盒可以位于相同载体上或在不同载体上。本发明特别涵盖包含至少两个载体的载体系统，其中每个载体至少包括两个核酸表达盒。本文涵盖的载体系统的载体可以相同或不同。

本文教导的载体可以进一步含有用于线性化或片段化的各种类型的限制性位点。

许多载体是本领域技术人员已知的，并且可以使用任何此类载体。选择合适的载体是一个选择问题。载体可以是非病毒载体或病毒载体。非病毒载体包括但不限于质粒、阳离子脂质、脂质体、纳米颗粒、PEG、PEI等。病毒载体源自病毒，包括但不限于：逆转录病毒、慢病毒、腺相关病毒、腺病毒、疱疹病毒、肝炎病毒等。

本文用于转化重组工程菌的方法是技术人员所公知的。例如，可以使用如本领域已知的电穿孔和/或化学(例如基于氯化钙或乙酸锂的)转化方法或根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的转化方法。

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。

实施例1酵母双表达质粒的构建与改造

为同时在酵母中表达HPV6 L1、HPV11 L1、HPV16 L1和HPV 18L1，需要改造得到两种可同时表达两种蛋白的表达质粒，每一种质粒都含有两个独立的表达盒，同时两种质粒含有的筛选标记不同，以便于通过两次转化、筛选的方法将两种不同的双表达质粒导入酵母。具体的质粒构建方案如下：

1.1酵母双表达质粒pMMZ的构建

通过PCR方式，采用SEQ ID NO：7-8所示序列为引物，汉逊酵母全基因组DNA为模板，扩增得到MOX启动子插入片段(SEQ ID NO：26)；采用SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：12所示序列为引物，pPICZB质粒为模板，扩增得到含AOXTT终止序列(SEQ ID NO：27)的片段。BglII+NdeI联合酶切处理MOX启动子插入片段，NdeI+BamHI处理AOXTT终止序列片段，BglII+BamHI处理pPICZB，再用小牛肠碱性磷酸酶处理pPICZB-BglII+BamHI片段，三片段连接后得到质粒pMOXZ-1(SEQ ID NO：28)。

引物序列(SEQ ID NO：7)

5’-accaaaagatctgtcgacgcggag-3；

引物序列(SEQ ID NO：8)

5’-cttggctacatatgatcgatcgtgtacacgtttcgaatttgtttttgtacttt-3’；

引物序列(SEQ ID NO：10)

5’-gcccgatcatatgcctgcaggcagctttctagaacaa-3’

引物序列(SEQ ID NO：12)

5’-tgggggatccgcacaaacgaa-3’

PCR序列(SEQ ID NO：26)

accaaaagatctgtcgacgcggagaacgatctcctcgagctgctcgcggatcagcttgtggcccggtaatggaaccaggccgacggcacgctccttgcggaccacggtggctggcgagcccagtttgtgaacgaggtcgtttagaacgtcctgcgcaaagtccagtgtcagatgaatgtcctcctcggaccaattcagcatgttctcgagcagccatctgtctttggagtagaagcgtaatctctgctcctcgttactgtaccggaagaggtagtttgcctcgccgcccataatgaacaggttctctttctggtggcctgtgagcagcggggacgtctggacggcgtcgatgaggcccttgaggcgctcgtagtacttgttcgcgtcgctgtagccggccgcggtgacgatacccacatagaggtccttggccattagtttgatgaggtggggcaggatgggcgactcggcatcgaaatttttgccgtcgtcgtacagtgtgatgtcaccatcgaatgtaatgagctgcagcttgcgatctcggatggttttggaatggaagaaccgcgacatctccaacagctgggccgtgttgagaatgagccggacgtcgttgaacgagggggccacaagccggcgtttgctgatggcgcggcgctcgtcctcgatgtagaaggccttttccagaggcagtctcgtgaagaagctgccaacgctcggaaccagctgcacgagccgagacaattcgggggtgccggctttggtcatttcaatgttgtcgtcgatgaggagttcgaggtcgtggaagatttccgcgtagcggcgttttgcctcagagtttaccatgaggtcgtccactgcagagatgccgttgctcttcaccgcgtacaggacgaacggcgtggccagcaggcccttgatccattctatgaggccatctcgacggtgttccttgagtgcgtactccactctgtagcgactggacatctcgagactgggcttgctgtgctggatgcaccaattaattgttgccgcatgcatccttgcaccgcaagtttttaaaacccactcgctttagccgtcgcgtaaaacttgtgaatctggcaactgagggggttctgcagccgcaaccgaacttttcgcttcgaggacgcagctggatggtgtcatgtgaggctctgtttgctggcgtagcctacaacgtgaccttgcctaaccggacggcgctacccactgctgtctgtgcctgctaccagaaaatcaccagagcagcagagggccgatgtggcaactggtggggtgtcggacaggctgtttctccacagtgcaaatgcgggtgaaccggccagaaagtaaattcttatgctaccgtgcagtgactccgacatccccagtttttgccctacttgatcacagatggggtcagcgctgccgctaagtgtacccaaccgtccccacacggtccatctataaatactgctgccagtgcacggtggtgacatcaatctaaagtacaaaaacaaattcgaaacgtgtacacgatcgatcatatgtagccaag

PCR序列(SEQ ID NO：27)

gcccgatcatatgcctgcaggcagctttctagaacaaaaactcatctcagaagaggatctgaatagcgccgtcgaccatcatcatcatcatcattgagtttgtagccttagacatgactgttcctcagttcaagttgggcacttacgagaagaccggtcttgctagattctaatcaagaggatgtcagaatgccatttgcctgagagatgcaggcttcatttttgatacttttttatttgtaacctatatagtataggattttttttgtcattttgtttcttctcgtacgagcttgctcctgatcagcctatctcgcagctgatgaatatcttgtggtaggggtttgggaaaatcattcgagtttgatgtttttcttggtatttcccactcctcttcagagtacagaagattaagtgagaccttcgtttgtgcggatccccca

pMOXZ-1序列(SEQ ID NO：28)

agatctgtcgacgcggagaacgatctcctcgagctgctcgcggatcagcttgtggcccggtaatggaaccaggccgacggcacgctccttgcggaccacggtggctggcgagcccagtttgtgaacgaggtcgtttagaacgtcctgcgcaaagtccagtgtcagatgaatgtcctcctcggaccaattcagcatgttctcgagcagccatctgtctttggagtagaagcgtaatctctgctcctcgttactgtaccggaagaggtagtttgcctcgccgcccataatgaacaggttctctttctggtggcctgtgagcagcggggacgtctggacggcgtcgatgaggcccttgaggcgctcgtagtacttgttcgcgtcgctgtagccggccgcggtgacgatacccacatagaggtccttggccattagtttgatgaggtggggcaggatgggcgactcggcatcgaaatttttgccgtcgtcgtacagtgtgatgtcaccatcgaatgtaatgagctgcagcttgcgatctcggatggttttggaatggaagaaccgcgacatctccaacagctgggccgtgttgagaatgagccggacgtcgttgaacgagggggccacaagccggcgtttgctgatggcgcggcgctcgtcctcgatgtagaaggccttttccagaggcagtctcgtgaagaagctgccaacgctcggaaccagctgcacgagccgagacaattcgggggtgccggctttggtcatttcaatgttgtcgtcgatgaggagttcgaggtcgtggaagatttccgcgtagcggcgttttgcctcagagtttaccatgaggtcgtccactgcagagatgccgttgctcttcaccgcgtacaggacgaacggcgtggccagcaggcccttgatccattctatgaggccatctcgacggtgttccttgagtgcgtactccactctgtagcgactggacatctcgagactgggcttgctgtgctggatgcaccaattaattgttgccgcatgcatccttgcaccgcaagtttttaaaacccactcgctttagccgtcgcgtaaaacttgtgaatctggcaactgagggggttctgcagccgcaaccgaacttttcgcttcgaggacgcagctggatggtgtcatgtgaggctctgtttgctggcgtagcctacaacgtgaccttgcctaaccggacggcgctacccactgctgtctgtgcctgctaccagaaaatcaccagagcagcagagggccgatgtggcaactggtggggtgtcggacaggctgtttctccacagtgcaaatgcgggtgaaccggccagaaagtaaattcttatgctaccgtgcagtgactccgacatccccagtttttgccctacttgatcacagatggggtcagcgctgccgctaagtgtacccaaccgtccccacacggtccatctataaatactgctgccagtgcacggtggtgacatcaatctaaagtacaaaaacaaattcgaaacgtgtacacgatcgatcatatgcctgcaggcagctttctagaacaaaaactcatctcagaagaggatctgaatagcgccgtcgaccatcatcatcatcatcattgagtttgtagccttagacatgactgttcctcagttcaagttgggcacttacgagaagaccggtcttgctagattctaatcaagaggatgtcagaatgccatttgcctgagagatgcaggcttcatttttgatacttttttatttgtaacctatatagtataggattttttttgtcattttgtttcttctcgtacgagcttgctcctgatcagcctatctcgcagctgatgaatatcttgtggtaggggtttgggaaaatcattcgagtttgatgtttttcttggtatttcccactcctcttcagagtacagaagattaagtgagaccttcgtttgtgcggatcccccacacaccatagcttcaaaatgtttctactccttttttactcttccagattttctcggactccgcgcatcgccgtaccacttcaaaacacccaagcacagcatactaaattttccctctttcttcctctagggtgtcgttaattacccgtactaaaggtttggaaaagaaaaaagagaccgcctcgtttctttttcttcgtcgaaaaaggcaataaaaatttttatcacgtttctttttcttgaaatttttttttttagtttttttctctttcagtgacctccattgatatttaagttaataaacggtcttcaatttctcaagtttcagtttcatttttcttgttctattacaactttttttacttcttgttcattagaaagaaagcatagcaatctaatctaaggggcggtgttgacaattaatcatcggcatagtatatcggcatagtataatacgacaaggtgaggaactaaaccatggccaagttgaccagtgccgttccggtgctcaccgcgcgcgacgtcgccggagcggtcgagttctggaccgaccggctcgggttctcccgggacttcgtggaggacgacttcgccggtgtggtccgggacgacgtgaccctgttcatcagcgcggtccaggaccaggtggtgccggacaacaccctggcctgggtgtgggtgcgcggcctggacgagctgtacgccgagtggtcggaggtcgtgtccacgaacttccgggacgcctccgggccggccatgaccgagatcggcgagcagccgtgggggcgggagttcgccctgcgcgacccggccggcaactgcgtgcacttcgtggccgaggagcaggactgacacgtccgacggcggcccacgggtcccaggcctcggagatccgtcccccttttcctttgtcgatatcatgtaattagttatgtcacgcttacattcacgccctccccccacatccgctctaaccgaaaaggaaggagttagacaacctgaagtctaggtccctatttatttttttatagttatgttagtattaagaacgttatttatatttcaaatttttcttttttttctgtacagacgcgtgtacgcatgtaacattatactgaaaaccttgcttgagaaggttttgggacgctcgaaggctttaatttgcaagctggagaccaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcaatgctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaaggacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagatc

通过PCR方式，采用SEQ ID NO：7,9所示序列为引物，汉逊酵母基因组DNA为模板，扩增得到MOX启动子插入片段(SEQ ID NO：29)；采用SEQ ID NO：11-12所示序列为引物，pPICZB质粒为模板，扩增得到含AOXTT终止序列(SEQ ID NO：30)的片段。BglII+HindIII联合酶切处理MOX启动子插入片段，HindIII+BamHI处理AOXTT终止序列片段，BglII+BamHI处理pPICZB，再用小牛肠碱性磷酸酶处理pPICZB-BglII+BamHI片段，三片段连接后得到质粒pMOXZ-2(SEQ ID NO：31)。

引物序列(SEQ ID NO：9)

5’-tcaagtcaagcttcacgtggctagctttgtttttgtacttt-3’；

引物序列(SEQ ID NO：11)

5’-aaacgtgaagcttgaattcgcggccgccagctttct-3’；

PCR序列(SEQ ID NO：29)

accaaaagatctgtcgacgcggagaacgatctcctcgagctgctcgcggatcagcttgtggcccggtaatggaaccaggccgacggcacgctccttgcggaccacggtggctggcgagcccagtttgtgaacgaggtcgtttagaacgtcctgcgcaaagtccagtgtcagatgaatgtcctcctcggaccaattcagcatgttctcgagcagccatctgtctttggagtagaagcgtaatctctgctcctcgttactgtaccggaagaggtagtttgcctcgccgcccataatgaacaggttctctttctggtggcctgtgagcagcggggacgtctggacggcgtcgatgaggcccttgaggcgctcgtagtacttgttcgcgtcgctgtagccggccgcggtgacgatacccacatagaggtccttggccattagtttgatgaggtggggcaggatgggcgactcggcatcgaaatttttgccgtcgtcgtacagtgtgatgtcaccatcgaatgtaatgagctgcagcttgcgatctcggatggttttggaatggaagaaccgcgacatctccaacagctgggccgtgttgagaatgagccggacgtcgttgaacgagggggccacaagccggcgtttgctgatggcgcggcgctcgtcctcgatgtagaaggccttttccagaggcagtctcgtgaagaagctgccaacgctcggaaccagctgcacgagccgagacaattcgggggtgccggctttggtcatttcaatgttgtcgtcgatgaggagttcgaggtcgtggaagatttccgcgtagcggcgttttgcctcagagtttaccatgaggtcgtccactgcagagatgccgttgctcttcaccgcgtacaggacgaacggcgtggccagcaggcccttgatccattctatgaggccatctcgacggtgttccttgagtgcgtactccactctgtagcgactggacatctcgagactgggcttgctgtgctggatgcaccaattaattgttgccgcatgcatccttgcaccgcaagtttttaaaacccactcgctttagccgtcgcgtaaaacttgtgaatctggcaactgagggggttctgcagccgcaaccgaacttttcgcttcgaggacgcagctggatggtgtcatgtgaggctctgtttgctggcgtagcctacaacgtgaccttgcctaaccggacggcgctacccactgctgtctgtgcctgctaccagaaaatcaccagagcagcagagggccgatgtggcaactggtggggtgtcggacaggctgtttctccacagtgcaaatgcgggtgaaccggccagaaagtaaattcttatgctaccgtgcagtgactccgacatccccagtttttgccctacttgatcacagatggggtcagcgctgccgctaagtgtacccaaccgtccccacacggtccatctataaatactgctgccagtgcacggtggtgacatcaatctaaagtacaaaaacaaagctagccacgtgaagcttgacttga

PCR序列(SEQ ID NO：30)

aaacgtgaagcttgaattcgcggccgccagctttctagaacaaaaactcatctcagaagaggatctgaatagcgccgtcgaccatcatcatcatcatcattgagtttgtagccttagacatgactgttcctcagttcaagttgggcacttacgagaagaccggtcttgctagattctaatcaagaggatgtcagaatgccatttgcctgagagatgcaggcttcatttttgatacttttttatttgtaacctatatagtataggattttttttgtcattttgtttcttctcgtacgagcttgctcctgatcagcctatctcgcagctgatgaatatcttgtggtaggggtttgggaaaatcattcgagtttgatgtttttcttggtatttcccactcctcttcagagtacagaagattaagtgagaccttcgtttgtgcggatccccca

pMOXZ-2序列(SEQ ID NO：31)

agatctgtcgacgcggagaacgatctcctcgagctgctcgcggatcagcttgtggcccggtaatggaaccaggccgacggcacgctccttgcggaccacggtggctggcgagcccagtttgtgaacgaggtcgtttagaacgtcctgcgcaaagtccagtgtcagatgaatgtcctcctcggaccaattcagcatgttctcgagcagccatctgtctttggagtagaagcgtaatctctgctcctcgttactgtaccggaagaggtagtttgcctcgccgcccataatgaacaggttctctttctggtggcctgtgagcagcggggacgtctggacggcgtcgatgaggcccttgaggcgctcgtagtacttgttcgcgtcgctgtagccggccgcggtgacgatacccacatagaggtccttggccattagtttgatgaggtggggcaggatgggcgactcggcatcgaaatttttgccgtcgtcgtacagtgtgatgtcaccatcgaatgtaatgagctgcagcttgcgatctcggatggttttggaatggaagaaccgcgacatctccaacagctgggccgtgttgagaatgagccggacgtcgttgaacgagggggccacaagccggcgtttgctgatggcgcggcgctcgtcctcgatgtagaaggccttttccagaggcagtctcgtgaagaagctgccaacgctcggaaccagctgcacgagccgagacaattcgggggtgccggctttggtcatttcaatgttgtcgtcgatgaggagttcgaggtcgtggaagatttccgcgtagcggcgttttgcctcagagtttaccatgaggtcgtccactgcagagatgccgttgctcttcaccgcgtacaggacgaacggcgtggccagcaggcccttgatccattctatgaggccatctcgacggtgttccttgagtgcgtactccactctgtagcgactggacatctcgagactgggcttgctgtgctggatgcaccaattaattgttgccgcatgcatccttgcaccgcaagtttttaaaacccactcgctttagccgtcgcgtaaaacttgtgaatctggcaactgagggggttctgcagccgcaaccgaacttttcgcttcgaggacgcagctggatggtgtcatgtgaggctctgtttgctggcgtagcctacaacgtgaccttgcctaaccggacggcgctacccactgctgtctgtgcctgctaccagaaaatcaccagagcagcagagggccgatgtggcaactggtggggtgtcggacaggctgtttctccacagtgcaaatgcgggtgaaccggccagaaagtaaattcttatgctaccgtgcagtgactccgacatccccagtttttgccctacttgatcacagatggggtcagcgctgccgctaagtgtacccaaccgtccccacacggtccatctataaatactgctgccagtgcacggtggtgacatcaatctaaagtacaaaaacaaagctagccacgtgaagcttgaattcgcggccgccagctttctagaacaaaaactcatctcagaagaggatctgaatagcgccgtcgaccatcatcatcatcatcattgagtttgtagccttagacatgactgttcctcagttcaagttgggcacttacgagaagaccggtcttgctagattctaatcaagaggatgtcagaatgccatttgcctgagagatgcaggcttcatttttgatacttttttatttgtaacctatatagtataggattttttttgtcattttgtttcttctcgtacgagcttgctcctgatcagcctatctcgcagctgatgaatatcttgtggtaggggtttgggaaaatcattcgagtttgatgtttttcttggtatttcccactcctcttcagagtacagaagattaagtgagaccttcgtttgtgcggatcccccacacaccatagcttcaaaatgtttctactccttttttactcttccagattttctcggactccgcgcatcgccgtaccacttcaaaacacccaagcacagcatactaaattttccctctttcttcctctagggtgtcgttaattacccgtactaaaggtttggaaaagaaaaaagagaccgcctcgtttctttttcttcgtcgaaaaaggcaataaaaatttttatcacgtttctttttcttgaaatttttttttttagtttttttctctttcagtgacctccattgatatttaagttaataaacggtcttcaatttctcaagtttcagtttcatttttcttgttctattacaactttttttacttcttgttcattagaaagaaagcatagcaatctaatctaaggggcggtgttgacaattaatcatcggcatagtatatcggcatagtataatacgacaaggtgaggaactaaaccatggccaagttgaccagtgccgttccggtgctcaccgcgcgcgacgtcgccggagcggtcgagttctggaccgaccggctcgggttctcccgggacttcgtggaggacgacttcgccggtgtggtccgggacgacgtgaccctgttcatcagcgcggtccaggaccaggtggtgccggacaacaccctggcctgggtgtgggtgcgcggcctggacgagctgtacgccgagtggtcggaggtcgtgtccacgaacttccgggacgcctccgggccggccatgaccgagatcggcgagcagccgtgggggcgggagttcgccctgcgcgacccggccggcaactgcgtgcacttcgtggccgaggagcaggactgacacgtccgacggcggcccacgggtcccaggcctcggagatccgtcccccttttcctttgtcgatatcatgtaattagttatgtcacgcttacattcacgccctccccccacatccgctctaaccgaaaaggaaggagttagacaacctgaagtctaggtccctatttatttttttatagttatgttagtattaagaacgttatttatatttcaaatttttcttttttttctgtacagacgcgtgtacgcatgtaacattatactgaaaaccttgcttgagaaggttttgggacgctcgaaggctttaatttgcaagctggagaccaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcaatgctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaaggacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagatc

将pMOXZ-2质粒表达盒通过BglII和BamHI酶切后连接的方式(参见InvitrogenpPICZB操作手册提到的体外多拷贝质粒构建方案)插入BglII处理的pMOXZ-1质粒，得到带有Zeocin抗性的汉逊酵母双表达质粒pMMZ(SEQ ID NO：32)(图1)。

pMMZ序列(SEQ ID NO：32)

agatctgtcgacgcggagaacgatctcctcgagctgctcgcggatcagcttgtggcccggtaatggaaccaggccgacggcacgctccttgcggaccacggtggctggcgagcccagtttgtgaacgaggtcgtttagaacgtcctgcgcaaagtccagtgtcagatgaatgtcctcctcggaccaattcagcatgttctcgagcagccatctgtctttggagtagaagcgtaatctctgctcctcgttactgtaccggaagaggtagtttgcctcgccgcccataatgaacaggttctctttctggtggcctgtgagcagcggggacgtctggacggcgtcgatgaggcccttgaggcgctcgtagtacttgttcgcgtcgctgtagccggccgcggtgacgatacccacatagaggtccttggccattagtttgatgaggtggggcaggatgggcgactcggcatcgaaatttttgccgtcgtcgtacagtgtgatgtcaccatcgaatgtaatgagctgcagcttgcgatctcggatggttttggaatggaagaaccgcgacatctccaacagctgggccgtgttgagaatgagccggacgtcgttgaacgagggggccacaagccggcgtttgctgatggcgcggcgctcgtcctcgatgtagaaggccttttccagaggcagtctcgtgaagaagctgccaacgctcggaaccagctgcacgagccgagacaattcgggggtgccggctttggtcatttcaatgttgtcgtcgatgaggagttcgaggtcgtggaagatttccgcgtagcggcgttttgcctcagagtttaccatgaggtcgtccactgcagagatgccgttgctcttcaccgcgtacaggacgaacggcgtggccagcaggcccttgatccattctatgaggccatctcgacggtgttccttgagtgcgtactccactctgtagcgactggacatctcgagactgggcttgctgtgctggatgcaccaattaattgttgccgcatgcatccttgcaccgcaagtttttaaaacccactcgctttagccgtcgcgtaaaacttgtgaatctggcaactgagggggttctgcagccgcaaccgaacttttcgcttcgaggacgcagctggatggtgtcatgtgaggctctgtttgctggcgtagcctacaacgtgaccttgcctaaccggacggcgctacccactgctgtctgtgcctgctaccagaaaatcaccagagcagcagagggccgatgtggcaactggtggggtgtcggacaggctgtttctccacagtgcaaatgcgggtgaaccggccagaaagtaaattcttatgctaccgtgcagtgactccgacatccccagtttttgccctacttgatcacagatggggtcagcgctgccgctaagtgtacccaaccgtccccacacggtccatctataaatactgctgccagtgcacggtggtgacatcaatctaaagtacaaaaacaaagctagccacgtgaagcttgaattcgcggccgccagctttctagaacaaaaactcatctcagaagaggatctgaatagcgccgtcgaccatcatcatcatcatcattgagtttgtagccttagacatgactgttcctcagttcaagttgggcacttacgagaagaccggtcttgctagattctaatcaagaggatgtcagaatgccatttgcctgagagatgcaggcttcatttttgatacttttttatttgtaacctatatagtataggattttttttgtcattttgtttcttctcgtacgagcttgctcctgatcagcctatctcgcagctgatgaatatcttgtggtaggggtttgggaaaatcattcgagtttgatgtttttcttggtatttcccactcctcttcagagtacagaagattaagtgagaccttcgtttgtgcggatctgtcgacgcggagaacgatctcctcgagctgctcgcggatcagcttgtggcccggtaatggaaccaggccgacggcacgctccttgcggaccacggtggctggcgagcccagtttgtgaacgaggtcgtttagaacgtcctgcgcaaagtccagtgtcagatgaatgtcctcctcggaccaattcagcatgttctcgagcagccatctgtctttggagtagaagcgtaatctctgctcctcgttactgtaccggaagaggtagtttgcctcgccgcccataatgaacaggttctctttctggtggcctgtgagcagcggggacgtctggacggcgtcgatgaggcccttgaggcgctcgtagtacttgttcgcgtcgctgtagccggccgcggtgacgatacccacatagaggtccttggccattagtttgatgaggtggggcaggatgggcgactcggcatcgaaatttttgccgtcgtcgtacagtgtgatgtcaccatcgaatgtaatgagctgcagcttgcgatctcggatggttttggaatggaagaaccgcgacatctccaacagctgggccgtgttgagaatgagccggacgtcgttgaacgagggggccacaagccggcgtttgctgatggcgcggcgctcgtcctcgatgtagaaggccttttccagaggcagtctcgtgaagaagctgccaacgctcggaaccagctgcacgagccgagacaattcgggggtgccggctttggtcatttcaatgttgtcgtcgatgaggagttcgaggtcgtggaagatttccgcgtagcggcgttttgcctcagagtttaccatgaggtcgtccactgcagagatgccgttgctcttcaccgcgtacaggacgaacggcgtggccagcaggcccttgatccattctatgaggccatctcgacggtgttccttgagtgcgtactccactctgtagcgactggacatctcgagactgggcttgctgtgctggatgcaccaattaattgttgccgcatgcatccttgcaccgcaagtttttaaaacccactcgctttagccgtcgcgtaaaacttgtgaatctggcaactgagggggttctgcagccgcaaccgaacttttcgcttcgaggacgcagctggatggtgtcatgtgaggctctgtttgctggcgtagcctacaacgtgaccttgcctaaccggacggcgctacccactgctgtctgtgcctgctaccagaaaatcaccagagcagcagagggccgatgtggcaactggtggggtgtcggacaggctgtttctccacagtgcaaatgcgggtgaaccggccagaaagtaaattcttatgctaccgtgcagtgactccgacatccccagtttttgccctacttgatcacagatggggtcagcgctgccgctaagtgtacccaaccgtccccacacggtccatctataaatactgctgccagtgcacggtggtgacatcaatctaaagtacaaaaacaaattcgaaacgtgtacacgatcgatcatatgcctgcaggcagctttctagaacaaaaactcatctcagaagaggatctgaatagcgccgtcgaccatcatcatcatcatcattgagtttgtagccttagacatgactgttcctcagttcaagttgggcacttacgagaagaccggtcttgctagattctaatcaagaggatgtcagaatgccatttgcctgagagatgcaggcttcatttttgatacttttttatttgtaacctatatagtataggattttttttgtcattttgtttcttctcgtacgagcttgctcctgatcagcctatctcgcagctgatgaatatcttgtggtaggggtttgggaaaatcattcgagtttgatgtttttcttggtatttcccactcctcttcagagtacagaagattaagtgagaccttcgtttgtgcggatcccccacacaccatagcttcaaaatgtttctactccttttttactcttccagattttctcggactccgcgcatcgccgtaccacttcaaaacacccaagcacagcatactaaattttccctctttcttcctctagggtgtcgttaattacccgtactaaaggtttggaaaagaaaaaagagaccgcctcgtttctttttcttcgtcgaaaaaggcaataaaaatttttatcacgtttctttttcttgaaatttttttttttagtttttttctctttcagtgacctccattgatatttaagttaataaacggtcttcaatttctcaagtttcagtttcatttttcttgttctattacaactttttttacttcttgttcattagaaagaaagcatagcaatctaatctaaggggcggtgttgacaattaatcatcggcatagtatatcggcatagtataatacgacaaggtgaggaactaaaccatggccaagttgaccagtgccgttccggtgctcaccgcgcgcgacgtcgccggagcggtcgagttctggaccgaccggctcgggttctcccgggacttcgtggaggacgacttcgccggtgtggtccgggacgacgtgaccctgttcatcagcgcggtccaggaccaggtggtgccggacaacaccctggcctgggtgtgggtgcgcggcctggacgagctgtacgccgagtggtcggaggtcgtgtccacgaacttccgggacgcctccgggccggccatgaccgagatcggcgagcagccgtgggggcgggagttcgccctgcgcgacccggccggcaactgcgtgcacttcgtggccgaggagcaggactgacacgtccgacggcggcccacgggtcccaggcctcggagatccgtcccccttttcctttgtcgatatcatgtaattagttatgtcacgcttacattcacgccctccccccacatccgctctaaccgaaaaggaaggagttagacaacctgaagtctaggtccctatttatttttttatagttatgttagtattaagaacgttatttatatttcaaatttttcttttttttctgtacagacgcgtgtacgcatgtaacattatactgaaaaccttgcttgagaaggttttgggacgctcgaaggctttaatttgcaagctggagaccaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcaatgctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaaggacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagatc

1.2酵母双表达质粒pMMG的构建

通过PCR方式，采用SEQ ID NO:13-14所示序列为引物，pPICZB质粒为模板，扩增得到TEF启动子+EM7启动子片段(SEQ ID NO：33)；采用SEQ ID NO:15-16所示序列为引物，pPIC9K质粒为模板，扩增得到G418抗性基因片段(SEQ ID NO：34)；BglII+AflII联合酶切处理TEF启动子+EM7启动子片段，AflII+SacII联合酶切处理G418抗性基因片段，BglII+SacII联合酶切处理pMOXZ-1质粒，三片段连接后得到pMOXZG质粒(SEQ ID NO：35)；

引物序列(SEQ ID NO：13)

5’-cccttagatctcccacacaccatagct-3’

引物序列(SEQ ID NO：14)

5’-tgcggtcttaaggtttagttcctcacc-3’

引物序列(SEQ ID NO：15)

5’-tattggcttaagatgagccatattcaac-3’

引物序列(SEQ ID NO：16)

5’-gggtatcgtcaccgcggccggctacagcacttgaagtcggacag-3’

PCR序列(SEQ ID NO：33)

cccttagatctcccacacaccatagcttcaaaatgtttctactccttttttactcttccagattttctcggactccgcgcatcgccgtaccacttcaaaacacccaagcacagcatactaaattttccctctttcttcctctagggtgtcgttaattacccgtactaaaggtttggaaaagaaaaaagagaccgcctcgtttctttttcttcgtcgaaaaaggcaataaaaatttttatcacgtttctttttcttgaaatttttttttttagtttttttctctttcagtgacctccattgatatttaagttaataaacggtcttcaatttctcaagtttcagtttcatttttcttgttctattacaactttttttacttcttgttcattagaaagaaagcatagcaatctaatctaaggggcggtgttgacaattaatcatcggcatagtatatcggcatagtataatacgacaaggtgaggaactaaaccttaagaccgca

PCR序列(SEQ ID NO：34)

gggtatcgtcaccgcggccggctacagcacttgaagtcggacagtgagtgtagtcttgagaaattctgaagccgtatttttattatcagtgagtcagtcatcaggagatcctctacgccggacgcatcgtggccgacctgcagggggggggggggcgctgaggtctgcctcgtgaagaaggtgttgctgactcataccaggcctgaatcgccccatcatccagccagaaagtgagggagccacggttgatgagagctttgttgtaggtggaccagttggtgattttgaacttttgctttgccacggaacggtctgcgttgtcgggaagatgcgtgatctgatccttcaactcagcaaaagttcgatttattcaacaaagccgccgtcccgtcaagtcagcgtaatgctctgccagtgttacaaccaattaaccaattctgattagaaaaactcatcgagcatcaaatgaaactgcaatttattcatatcaggattatcaataccatatttttgaaaaagccgtttctgtaatgaaggagaaaactcaccgaggcagttccataggatggcaagatcctggtatcggtctgcgattccgactcgtccaacatcaatacaacctattaatttcccctcgtcaaaaataaggttatcaagtgagaaatcaccatgagtgacgactgaatccggtgagaatggcaaaagcttatgcatttctttccagacttgttcaacaggccagccattacgctcgtcatcaaaatcactcgcatcaaccaaaccgttattcattcgtgattgcgcctgagcgagacgaaatacgcgatcgctgttaaaaggacaattacaaacaggaatcgaatgcaaccggcgcaggaacactgccagcgcatcaacaatattttcacctgaatcaggatattcttctaatacctggaatgctgttttcccggggatcgcagtggtgagtaaccatgcatcatcaggagtacggataaaatgcttgatggtcggaagaggcataaattccgtcagccagtttagtctgaccatctcatctgtaacatcattggcaacgctacctttgccatgtttcagaaacaactctggcgcatcgggcttcccatacaatcgatagattgtcgcacctgattgcccgacattatcgcgagcccatttatacccatataaatcagcatccatgttggaatttaatcgcggcctcgagcaagacgtttcccgttgaatatggctcatcttaagccaata

pMOXZG序列(SEQ ID NO：35)

agatctcccacacaccatagcttcaaaatgtttctactccttttttactcttccagattttctcggactccgcgcatcgccgtaccacttcaaaacacccaagcacagcatactaaattttccctctttcttcctctagggtgtcgttaattacccgtactaaaggtttggaaaagaaaaaagagaccgcctcgtttctttttcttcgtcgaaaaaggcaataaaaatttttatcacgtttctttttcttgaaatttttttttttagtttttttctctttcagtgacctccattgatatttaagttaataaacggtcttcaatttctcaagtttcagtttcatttttcttgttctattacaactttttttacttcttgttcattagaaagaaagcatagcaatctaatctaaggggcggtgttgacaattaatcatcggcatagtatatcggcatagtataatacgacaaggtgaggaactaaaccttaagatgagccatattcaacgggaaacgtcttgctcgaggccgcgattaaattccaacatggatgctgatttatatgggtataaatgggctcgcgataatgtcgggcaatcaggtgcgacaatctatcgattgtatgggaagcccgatgcgccagagttgtttctgaaacatggcaaaggtagcgttgccaatgatgttacagatgagatggtcagactaaactggctgacggaatttatgcctcttccgaccatcaagcattttatccgtactcctgatgatgcatggttactcaccactgcgatccccgggaaaacagcattccaggtattagaagaatatcctgattcaggtgaaaatattgttgatgcgctggcagtgttcctgcgccggttgcattcgattcctgtttgtaattgtccttttaacagcgatcgcgtatttcgtctcgctcaggcgcaatcacgaatgaataacggtttggttgatgcgagtgattttgatgacgagcgtaatggctggcctgttgaacaagtctggaaagaaatgcataagcttttgccattctcaccggattcagtcgtcactcatggtgatttctcacttgataaccttatttttgacgaggggaaattaataggttgtattgatgttggacgagtcggaatcgcagaccgataccaggatcttgccatcctatggaactgcctcggtgagttttctccttcattacagaaacggctttttcaaaaatatggtattgataatcctgatatgaataaattgcagtttcatttgatgctcgatgagtttttctaatcagaattggttaattggttgtaacactggcagagcattacgctgacttgacgggacggcggctttgttgaataaatcgaacttttgctgagttgaaggatcagatcacgcatcttcccgacaacgcagaccgttccgtggcaaagcaaaagttcaaaatcaccaactggtccacctacaacaaagctctcatcaaccgtggctccctcactttctggctggatgatggggcgattcaggcctggtatgagtcagcaacaccttcttcacgaggcagacctcagcgccccccccccccctgcaggtcggccacgatgcgtccggcgtagaggatctcctgatgactgactcactgataataaaaatacggcttcagaatttctcaagactacactcactgtccgacttcaagtgctgtagccggccgcggtgacgatacccacatagaggtccttggccattagtttgatgaggtggggcaggatgggcgactcggcatcgaaatttttgccgtcgtcgtacagtgtgatgtcaccatcgaatgtaatgagctgcagcttgcgatctcggatggttttggaatggaagaaccgcgacatctccaacagctgggccgtgttgagaatgagccggacgtcgttgaacgagggggccacaagccggcgtttgctgatggcgcggcgctcgtcctcgatgtagaaggccttttccagaggcagtctcgtgaagaagctgccaacgctcggaaccagctgcacgagccgagacaattcgggggtgccggctttggtcatttcaatgttgtcgtcgatgaggagttcgaggtcgtggaagatttccgcgtagcggcgttttgcctcagagtttaccatgaggtcgtccactgcagagatgccgttgctcttcaccgcgtacaggacgaacggcgtggccagcaggcccttgatccattctatgaggccatctcgacggtgttccttgagtgcgtactccactctgtagcgactggacatctcgagactgggcttgctgtgctggatgcaccaattaattgttgccgcatgcatccttgcaccgcaagtttttaaaacccactcgctttagccgtcgcgtaaaacttgtgaatctggcaactgagggggttctgcagccgcaaccgaacttttcgcttcgaggacgcagctggatggtgtcatgtgaggctctgtttgctggcgtagcctacaacgtgaccttgcctaaccggacggcgctacccactgctgtctgtgcctgctaccagaaaatcaccagagcagcagagggccgatgtggcaactggtggggtgtcggacaggctgtttctccacagtgcaaatgcgggtgaaccggccagaaagtaaattcttatgctaccgtgcagtgactccgacatccccagtttttgccctacttgatcacagatggggtcagcgctgccgctaagtgtacccaaccgtccccacacggtccatctataaatactgctgccagtgcacggtggtgacatcaatctaaagtacaaaaacaaattcgaaacgtgtacacgatcgatcatatgcctgcaggcagctttctagaacaaaaactcatctcagaagaggatctgaatagcgccgtcgaccatcatcatcatcatcattgagtttgtagccttagacatgactgttcctcagttcaagttgggcacttacgagaagaccggtcttgctagattctaatcaagaggatgtcagaatgccatttgcctgagagatgcaggcttcatttttgatacttttttatttgtaacctatatagtataggattttttttgtcattttgtttcttctcgtacgagcttgctcctgatcagcctatctcgcagctgatgaatatcttgtggtaggggtttgggaaaatcattcgagtttgatgtttttcttggtatttcccactcctcttcagagtacagaagattaagtgagaccttcgtttgtgcggatcccccacacaccatagcttcaaaatgtttctactccttttttactcttccagattttctcggactccgcgcatcgccgtaccacttcaaaacacccaagcacagcatactaaattttccctctttcttcctctagggtgtcgttaattacccgtactaaaggtttggaaaagaaaaaagagaccgcctcgtttctttttcttcgtcgaaaaaggcaataaaaatttttatcacgtttctttttcttgaaatttttttttttagtttttttctctttcagtgacctccattgatatttaagttaataaacggtcttcaatttctcaagtttcagtttcatttttcttgttctattacaactttttttacttcttgttcattagaaagaaagcatagcaatctaatctaaggggcggtgttgacaattaatcatcggcatagtatatcggcatagtataatacgacaaggtgaggaactaaaccatggccaagttgaccagtgccgttccggtgctcaccgcgcgcgacgtcgccggagcggtcgagttctggaccgaccggctcgggttctcccgggacttcgtggaggacgacttcgccggtgtggtccgggacgacgtgaccctgttcatcagcgcggtccaggaccaggtggtgccggacaacaccctggcctgggtgtgggtgcgcggcctggacgagctgtacgccgagtggtcggaggtcgtgtccacgaacttccgggacgcctccgggccggccatgaccgagatcggcgagcagccgtgggggcgggagttcgccctgcgcgacccggccggcaactgcgtgcacttcgtggccgaggagcaggactgacacgtccgacggcggcccacgggtcccaggcctcggagatccgtcccccttttcctttgtcgatatcatgtaattagttatgtcacgcttacattcacgccctccccccacatccgctctaaccgaaaaggaaggagttagacaacctgaagtctaggtccctatttatttttttatagttatgttagtattaagaacgttatttatatttcaaatttttcttttttttctgtacagacgcgtgtacgcatgtaacattatactgaaaaccttgcttgagaaggttttgggacgctcgaaggctttaatttgcaagctggagaccaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcaatgctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaaggacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagatc

通过PCR方式，采用SEQ ID NO:17-18所示序列为引物，pMOXZG为模板，扩增得到pUC复制子+TEF1启动子+EM7启动子+G418抗性基因片段(SEQ ID NO：36)；BamHI酶切处理pUC复制子+TEF启动子+EM7启动子+G418抗性基因片段，BamHI+BglII联合酶切处理pMMZ质粒(剔除原pMMZ质粒的Zeocin抗性表达盒和pUC复制子)，两片段连接后得到带有G418抗性的汉逊酵母双表达质粒pMMG(SEQ ID NO：37)(图2)。

引物序列(SEQ ID NO：17)

5’-gttggatcctcgatcacatgtgagc-3’

引物序列(SEQ ID NO：18)

5’-aaaggatcctgaggtctgcctcgt-3’

PCR序列(SEQ ID NO：36)

gttggatcctcgatcacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcaatgctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaaggacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagatcagatctcccacacaccatagcttcaaaatgtttctactccttttttactcttccagattttctcggactccgcgcatcgccgtaccacttcaaaacacccaagcacagcatactaaattttccctctttcttcctctagggtgtcgttaattacccgtactaaaggtttggaaaagaaaaaagagaccgcctcgtttctttttcttcgtcgaaaaaggcaataaaaatttttatcacgtttctttttcttgaaatttttttttttagtttttttctctttcagtgacctccattgatatttaagttaataaacggtcttcaatttctcaagtttcagtttcatttttcttgttctattacaactttttttacttcttgttcattagaaagaaagcatagcaatctaatctaaggggcggtgttgacaattaatcatcggcatagtatatcggcatagtataatacgacaaggtgaggaactaaaccttaagatgagccatattcaacgggaaacgtcttgctcgaggccgcgattaaattccaacatggatgctgatttatatgggtataaatgggctcgcgataatgtcgggcaatcaggtgcgacaatctatcgattgtatgggaagcccgatgcgccagagttgtttctgaaacatggcaaaggtagcgttgccaatgatgttacagatgagatggtcagactaaactggctgacggaatttatgcctcttccgaccatcaagcattttatccgtactcctgatgatgcatggttactcaccactgcgatccccgggaaaacagcattccaggtattagaagaatatcctgattcaggtgaaaatattgttgatgcgctggcagtgttcctgcgccggttgcattcgattcctgtttgtaattgtccttttaacagcgatcgcgtatttcgtctcgctcaggcgcaatcacgaatgaataacggtttggttgatgcgagtgattttgatgacgagcgtaatggctggcctgttgaacaagtctggaaagaaatgcataagcttttgccattctcaccggattcagtcgtcactcatggtgatttctcacttgataaccttatttttgacgaggggaaattaataggttgtattgatgttggacgagtcggaatcgcagaccgataccaggatcttgccatcctatggaactgcctcggtgagttttctccttcattacagaaacggctttttcaaaaatatggtattgataatcctgatatgaataaattgcagtttcatttgatgctcgatgagtttttctaatcagaattggttaattggttgtaacactggcagagcattacgctgacttgacgggacggcggctttgttgaataaatcgaacttttgctgagttgaaggatcagatcacgcatcttcccgacaacgcagaccgttccgtggcaaagcaaaagttcaaaatcaccaactggtccacctacaacaaagctctcatcaaccgtggctccctcactttctggctggatgatggggcgattcaggcctggtatgagtcagcaacaccttcttcacgaggcagacctcaggatccttt

pMMG序列(SEQ ID NO：37)

ggatctgtcgacgcggagaacgatctcctcgagctgctcgcggatcagcttgtggcccggtaatggaaccaggccgacggcacgctccttgcggaccacggtggctggcgagcccagtttgtgaacgaggtcgtttagaacgtcctgcgcaaagtccagtgtcagatgaatgtcctcctcggaccaattcagcatgttctcgagcagccatctgtctttggagtagaagcgtaatctctgctcctcgttactgtaccggaagaggtagtttgcctcgccgcccataatgaacaggttctctttctggtggcctgtgagcagcggggacgtctggacggcgtcgatgaggcccttgaggcgctcgtagtacttgttcgcgtcgctgtagccggccgcggtgacgatacccacatagaggtccttggccattagtttgatgaggtggggcaggatgggcgactcggcatcgaaatttttgccgtcgtcgtacagtgtgatgtcaccatcgaatgtaatgagctgcagcttgcgatctcggatggttttggaatggaagaaccgcgacatctccaacagctgggccgtgttgagaatgagccggacgtcgttgaacgagggggccacaagccggcgtttgctgatggcgcggcgctcgtcctcgatgtagaaggccttttccagaggcagtctcgtgaagaagctgccaacgctcggaaccagctgcacgagccgagacaattcgggggtgccggctttggtcatttcaatgttgtcgtcgatgaggagttcgaggtcgtggaagatttccgcgtagcggcgttttgcctcagagtttaccatgaggtcgtccactgcagagatgccgttgctcttcaccgcgtacaggacgaacggcgtggccagcaggcccttgatccattctatgaggccatctcgacggtgttccttgagtgcgtactccactctgtagcgactggacatctcgagactgggcttgctgtgctggatgcaccaattaattgttgccgcatgcatccttgcaccgcaagtttttaaaacccactcgctttagccgtcgcgtaaaacttgtgaatctggcaactgagggggttctgcagccgcaaccgaacttttcgcttcgaggacgcagctggatggtgtcatgtgaggctctgtttgctggcgtagcctacaacgtgaccttgcctaaccggacggcgctacccactgctgtctgtgcctgctaccagaaaatcaccagagcagcagagggccgatgtggcaactggtggggtgtcggacaggctgtttctccacagtgcaaatgcgggtgaaccggccagaaagtaaattcttatgctaccgtgcagtgactccgacatccccagtttttgccctacttgatcacagatggggtcagcgctgccgctaagtgtacccaaccgtccccacacggtccatctataaatactgctgccagtgcacggtggtgacatcaatctaaagtacaaaaacaaagctagccacgtgaagcttgaattcgcggccgccagctttctagaacaaaaactcatctcagaagaggatctgaatagcgccgtcgaccatcatcatcatcatcattgagtttgtagccttagacatgactgttcctcagttcaagttgggcacttacgagaagaccggtcttgctagattctaatcaagaggatgtcagaatgccatttgcctgagagatgcaggcttcatttttgatacttttttatttgtaacctatatagtataggattttttttgtcattttgtttcttctcgtacgagcttgctcctgatcagcctatctcgcagctgatgaatatcttgtggtaggggtttgggaaaatcattcgagtttgatgtttttcttggtatttcccactcctcttcagagtacagaagattaagtgagaccttcgtttgtgcggatctgtcgacgcggagaacgatctcctcgagctgctcgcggatcagcttgtggcccggtaatggaaccaggccgacggcacgctccttgcggaccacggtggctggcgagcccagtttgtgaacgaggtcgtttagaacgtcctgcgcaaagtccagtgtcagatgaatgtcctcctcggaccaattcagcatgttctcgagcagccatctgtctttggagtagaagcgtaatctctgctcctcgttactgtaccggaagaggtagtttgcctcgccgcccataatgaacaggttctctttctggtggcctgtgagcagcggggacgtctggacggcgtcgatgaggcccttgaggcgctcgtagtacttgttcgcgtcgctgtagccggccgcggtgacgatacccacatagaggtccttggccattagtttgatgaggtggggcaggatgggcgactcggcatcgaaatttttgccgtcgtcgtacagtgtgatgtcaccatcgaatgtaatgagctgcagcttgcgatctcggatggttttggaatggaagaaccgcgacatctccaacagctgggccgtgttgagaatgagccggacgtcgttgaacgagggggccacaagccggcgtttgctgatggcgcggcgctcgtcctcgatgtagaaggccttttccagaggcagtctcgtgaagaagctgccaacgctcggaaccagctgcacgagccgagacaattcgggggtgccggctttggtcatttcaatgttgtcgtcgatgaggagttcgaggtcgtggaagatttccgcgtagcggcgttttgcctcagagtttaccatgaggtcgtccactgcagagatgccgttgctcttcaccgcgtacaggacgaacggcgtggccagcaggcccttgatccattctatgaggccatctcgacggtgttccttgagtgcgtactccactctgtagcgactggacatctcgagactgggcttgctgtgctggatgcaccaattaattgttgccgcatgcatccttgcaccgcaagtttttaaaacccactcgctttagccgtcgcgtaaaacttgtgaatctggcaactgagggggttctgcagccgcaaccgaacttttcgcttcgaggacgcagctggatggtgtcatgtgaggctctgtttgctggcgtagcctacaacgtgaccttgcctaaccggacggcgctacccactgctgtctgtgcctgctaccagaaaatcaccagagcagcagagggccgatgtggcaactggtggggtgtcggacaggctgtttctccacagtgcaaatgcgggtgaaccggccagaaagtaaattcttatgctaccgtgcagtgactccgacatccccagtttttgccctacttgatcacagatggggtcagcgctgccgctaagtgtacccaaccgtccccacacggtccatctataaatactgctgccagtgcacggtggtgacatcaatctaaagtacaaaaacaaattcgaaacgtgtacacgatcgatcatatgcctgcaggcagctttctagaacaaaaactcatctcagaagaggatctgaatagcgccgtcgaccatcatcatcatcatcattgagtttgtagccttagacatgactgttcctcagttcaagttgggcacttacgagaagaccggtcttgctagattctaatcaagaggatgtcagaatgccatttgcctgagagatgcaggcttcatttttgatacttttttatttgtaacctatatagtataggattttttttgtcattttgtttcttctcgtacgagcttgctcctgatcagcctatctcgcagctgatgaatatcttgtggtaggggtttgggaaaatcattcgagtttgatgtttttcttggtatttcccactcctcttcagagtacagaagattaagtgagaccttcgtttgtgcggatcctcgatcacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcaatgctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaaggacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagatcagatctcccacacaccatagcttcaaaatgtttctactccttttttactcttccagattttctcggactccgcgcatcgccgtaccacttcaaaacacccaagcacagcatactaaattttccctctttcttcctctagggtgtcgttaattacccgtactaaaggtttggaaaagaaaaaagagaccgcctcgtttctttttcttcgtcgaaaaaggcaataaaaatttttatcacgtttctttttcttgaaatttttttttttagtttttttctctttcagtgacctccattgatatttaagttaataaacggtcttcaatttctca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实施例2构建6L1-11L1-pMMG双表达质粒和16L1-18L1-pMMZ双表达质粒

2.1HPVL1双表达质粒构建

编码HPV6 L1、HPV11 L1、HPV16 L1、HPV18 L1的DNA序列如SEQ ID NO：1-4，由苏州金唯智公司合成，密码子使用频率参考酵母偏爱性密码子，连接在金唯智公司提供的通用克隆质粒pUC57上，分别得到HPV6L1-pUC57、HPV11L1-pUC57、HPV16L1-pUC57、HPV18L1-pUC57。分别将HPV6 L1、HPV11 L1插入pMMG质粒，将HPV16 L1、HPV18 L1基因插入pMMZ质粒。

2.2 HPV6 L1/HPV11 L1双表达质粒构建

通过PCR方式，采用SEQ ID NO:19-20所示序列为引物，HPV11L1-pUC57质粒为模板，扩增得到HPV11 L1片段(SEQ ID NO：38)；BstBI+SbfI联合酶切处理HPV11 L1片段和pMMG质粒，两片段连接后得到11L1-pMMG(SEQ ID NO：39)。

通过PCR方式，采用SEQ ID NO:21-22所示序列为引物，HPV6L1-pUC57质粒为模板，扩增得到HPV6 L1片段(SEQ ID NO：40)，NheI+NotI联合酶切处理HPV6 L1片段和11L1-pMMG质粒，两片段连接后得到6L1-11L1-pMMG(SEQ ID NO：41)(图3)。

2.3 HPV16 L1/HPV18 L1双表达质粒构建

通过PCR方式，采用SEQ ID NO:19、23所示序列为引物，HPV16L1-pUC57质粒为模板，扩增得到HPV16 L1片段(SEQ ID NO：42)；BstBI+SbfI联合酶切处理HPV16 L1片段和pMMZ质粒，两片段连接后得到16L1-pMMZ(SEQ ID NO：43)。

通过PCR方式，采用SEQ ID NO:24-25所示序列为引物，HPV18L1-pUC57质粒为模板，扩增得到HPV18 L1片段(SEQ ID NO：44)，NheI+NotI联合酶切处理HPV18 L1片段和16L1-pMMZ质粒，两片段连接后得到16L1-18L1-pMMZ(SEQ ID NO：45)(图4)。

引物序列(SEQ ID NO：19)

5’-cggacaaattcgaaacgatgt-3’

引物序列(SEQ ID NO：20)

5’-acagaaacctgcaggctattactttttggtc-3’

引物序列(SEQ ID NO：21)

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引物序列(SEQ ID NO：22)

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引物序列(SEQ ID NO：23)

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引物序列(SEQ ID NO：24)

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引物序列(SEQ ID NO：25)

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PCR序列(SEQ ID NO：38)

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11L1-pMMG序列(SEQ ID NO：39)

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PCR序列(SEQ ID NO：40)

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6L1-11L1-pMMG序列(SEQ ID NO：41)

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PCR序列(SEQ ID NO：42)

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16L1-pMMZ序列(SEQ ID NO：43)

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PCR序列(SEQ ID NO：44)

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16L1-18L1-pMMZ序列(SEQ ID NO：45)

agatctgtcgacgcggagaacgatctcctcgagctgctcgcggatcagcttgtggcccggtaatggaaccaggccgacggcacgctccttgcggaccacggtggctggcgagcccagtttgtgaacgaggtcgtttagaacgtcctgcgcaaagtccagtgtcagatgaatgtcctcctcggaccaattcagcatgttctcgagcagccatctgtctttggagtagaagcgtaatctctgctcctcgttactgtaccggaagaggtagtttgcctcgccgcccataatgaacaggttctctttctggtggcctgtgagcagcggggacgtctggacggcgtcgatgaggcccttgaggcgctcgtagtacttgttcgcgtcgctgtagccggccgcggtgacgatacccacatagaggtccttggccattagtttgatgaggtggggcaggatgggcgactcggcatcgaaatttttgccgtcgtcgtacagtgtgatgtcaccatcgaatgtaatgagctgcagcttgcgatctcggatggttttggaatggaagaaccgcgacatctccaacagctgggccgtgttgagaatgagccggacgtcgttgaacgagggggccacaagccggcgtttgctgatggcgcggcgctcgtcctcgatgtagaaggccttttccagaggcagtctcgtgaagaagctgccaacgctcggaaccagctgcacgagccgagacaattcgggggtgccggctttggtcatttcaatgttgtcgtcgatgaggagttcgaggtcgtggaagatttccgcgtagcggcgttttgcctcagagtttaccatgaggtcgtccactgcagagatgccgttgctcttcaccgcgtacaggacgaacggcgtggccagcaggcccttgatccattctatgaggccatctcgacggtgttccttgagtgcgtactccactctgtagcgactggacatctcgagactgggcttgctgtgctggatgcaccaattaattgttgccgcatgcatccttgcaccgcaagtttttaaaacccactcgctttagccgtcgcgtaaaacttgtgaatctggcaactgagggggttctgcagccgcaaccgaacttttcgcttcgaggacgcagctggatggtgtcatgtgaggctctgtttgctggcgtagcctacaacgtgaccttgcctaaccggacggcgctacccactgctgtctgtgcctgctaccagaaaatcaccagagcagcagagggccgatgtggcaactggtggggtgtcggacaggctgtttctccacagtgcaaatgcgggtgaaccggccagaaagtaaattcttatgctaccgtgcagtgactccgacatccccagtttttgccctacttgatcacagatggggtcagcgctgccgctaagtgtacccaaccgtccccacacggtccatctataaatactgctgccagtgcacggtggtgacatcaatctaaagtacaaaaacaaagctagcatggctctgtggagaccatctgacaacaccgtctacttgccacctccatctgttgccagagtcgttaacaccgacgattacgtcactagaacatccatcttctaccacgctggttcctctagattgcttactgttggtaatccatacttcagagttccagctggtggaggtaataagcaagacattcctaaggtttctgcttaccaatatagagtctttagagttcagttgcctgacccaaacaagttcggtttgcctgatacttctatctacaacccagagactcaaagattggtttgggcctgtgctggtgtcgagatcggtagaggacaacctttgggagttggtctttctggacacccattctacaacaagttggatgacactgaatcttcacatgctgccacttccaatgtttctgaggatgttcgtgacaacgtctctgttgattacaagcaaactcagttgtgtatccttggatgtgcccctgctattggtgaacactgggctaaaggtactgcctgtaagtccagaccattgtctcaaggtgactgcccacctttggagcttaagaacactgttttggaagatggtgacatggttgatactggatatggtgctatggacttctctaccctgcaggatactaagtgtgaggttccattggacatctgtcaatctatttgtaagtaccctgattatcttcagatgtctgctgacccatacggtgattctatgttcttttgcttgagacgtgagcaacttttcgctagacacttttggaacagagcaggtactatgggtgacaccgttccacaatctttgtatatcaaaggaactggtatgagagcttctcctggatcctgtgtttactcaccatctccttccggttctattgttacctcagactctcaattgtttaacaagccatactggttacacaaggctcagggtcataacaatggtgtttgctggcacaaccaattgttcgttactgtcgttgacaccactagatccaccaatttgacaatttgtgcttctactcagtcccctgttccaggtcaatatgatgctaccaaattcaagcaatactctagacacgttgaggaatatgacttgcagtttatcttccaattgtgtactattaccttgactgccgatgttatgtcttacattcattccatgaactcttcaatcttggaggattggaactttggtgttccaccacctccaacaacttctttggttgacacctacagattcgtccaatctgttgctattacctgtcagaaggatgccgcaccagctgaaaacaaggatccatacgacaagttgaagttttggaatgtcgatttgaaggagaagttctcccttgacttggatcaatacccacttggtagaaagttcttggttcaggctggtttgagacgtaagccaactatcggtccaagaaaacgttctgctccatcagccactacctcttccaaacctgctaagagagttcgtgtcagagctagaaagtaatagcggccgccagctttctagaacaaaaactcatctcagaagaggatctgaatagcgccgtcgaccatcatcatcatcatcattgagtttgtagccttagacatgactgttcctcagttcaagttgggcacttacgagaagaccggtcttgctagattctaatcaagaggatgtcagaatgccatttgcctgagagatgcaggcttcatttttgatacttttttatttgtaacctatatagtataggattttttttgtcattttgtttcttctcgtacgagcttgctcctgatcagcctatctcgcagctgatgaatatcttgtggtaggggtttgggaaaatcattcgagtttgatgtttttcttggtatttcccactcctcttcagagtacagaagattaagtgagaccttcgtttgtgcggatctgtcgacgcggagaacgatctcctcgagctgctcgcggatcagcttgtggcccggtaatggaaccaggccgacggcacgctccttgcggaccacggtggctggcgagcccagtttgtgaacgaggtcgtttagaacgtcctgcgcaaagtccagtgtcagatgaatgtcctcctcggaccaattcagcatgttctcgagcagccatctgtctttggagtagaagcgtaatctctgctcctcgttactgtaccggaagaggtagtttgcctcgccgcccataatgaacaggttctctttctggtggcctgtgagcagcggggacgtctggacggcgtcgatgaggcccttgaggcgctcgtagtacttgttcgcgtcgctgtagccggccgcggtgacgatacccacatagaggtccttggccattagtttgatgaggtggggcaggatgggcgactcggcatcgaaatttttgccgtcgtcgtacagtgtgatgtcaccatcgaatgtaatgagctgcagcttgcgatctcggatggttttggaatggaagaaccgcgacatctccaacagctgggccgtgttgagaatgagccggacgtcgttgaacgagggggccacaagccggcgtttgctgatggcgcggcgctcgtcctcgatgtagaaggccttttccagaggcagtctcgtgaagaagctgccaacgctcggaaccagctgcacgagccgagacaattcgggggtgccggctttggtcatttcaatgttgtcgtcgatgaggagttcgaggtcgtggaagatttccgcgtagcggcgttttgcctcagagtttaccatgaggtcgtccactgcagagatgccgttgctcttcaccgcgtacaggacgaacggcgtggccagcaggcccttgatccattctatgaggccatctcgacggtgttccttgagtgcgtactccactctgtagcgactggacatctcgagactgggcttgctgtgctggatgcaccaattaattgttgccgcatgcatccttgcaccgcaagtttttaaaacccactcgctttagccgtcgcgtaaaacttgtgaatctggcaactgagggggttctgcagccgcaaccgaacttttcgcttcgaggacgcagctggatggtgtcatgtgaggctctgtttgctggcgtagcctacaacgtgaccttgcctaaccggacggcgctacccactgctgtctgtgcctgctaccagaaaatcaccagagcagcagagggccgatgtggcaactggtggggtgtcggacaggctgtttctccacagtgcaaatgcgggtgaaccggccagaaagtaaattcttatgctaccgtgcagtgactccgacatccccagtttttgccctacttgatcacagatggggtcagcgctgccgctaagtgtacccaaccgtccccacacggtccatctataaatactgctgccagtgcacggtggtgacatcaatctaaagtacaaaaacaaattcgaaacgatg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6L1-11L1-pMMG与16L1-18L1-pMMZ酶切鉴定结果见图5，从结果可知，6L1-11L1-pMMG经NheI+NotI酶切处理后可得到约7719bp+1513bp片段，经BstBI+SbfI酶切处理后可得到约7710bp+1522bp片段；16L1-18L1-pMMZ经NheI+NotI酶切处理后可得到约7322bp+1533bp片段，经BstBI+SbfI酶切处理后可得到约4496+2825+1534bp片段。酶切结果与理论条带相符。

实施例3四表达菌株构建与筛选

基于实施例2中构建的6L1-11L1-pMMG双表达质粒和16L1-18L1-pMMZ双表达质粒，通过两次转化、两次筛选(两种筛选标记)的方法将两种双表达质粒整合于汉逊酵母宿主菌CBS4732(ATCC 34438)，得到同时表达HPV6 L1、HPV11 L1、HPV16 L1、HPV18 L1的重组工程酵母菌株，具体步骤如下：

3.1 HPV16 L1/HPV18 L1双表达菌株构建与筛选

将重组构建的16L1-18L1-pMMZ质粒由BglII酶线性化，电转汉逊酵母CBS4732，电转条件为1500V，120Ω，50μF。电转后菌液涂布YPD平板(200μg/ml Zeocin)，37℃过夜倒置培养。挑取部分克隆划线YPD平板(1500μg/ml Zeocin)，37℃倒置培养2天。挑取生长情况较好的数株接种于YPD液体培养基，37℃振荡培养一天，离心收集菌体后弃去YPD培养基，加入BMMY培养基(0.5％甲醇)，37℃振荡诱导培养48小时。收集菌体，玻璃珠剧烈振荡破碎后收集破菌上清，通过斑点杂交法检测分别检测HPV16 L1和HPV18 L1表达情况(图6)，检测用抗体分别为HPV16 L1型别特异性中和单抗H16.V5和HPV18 L1型别特异性中和单抗H18.J4中和单抗(宾夕法尼亚州立大学Neil Christensen实验室提供)。挑取HPV16 L1和HPV18 L1表达情况均较理想的一株保存并用于进一步构建，该菌株命名为Dual-L1-HP。

3.2 HPV6 L1/HPV11 L1/HPV16 L1/HPV18 L1四表达菌株构建与筛选

将重组构建的6L1-11L1-pMMG质粒由BglII酶线性化，电转实施例3.1构建得到的Dual-L1-HP，电转条件为1500V，120Ω，50μF。电转后菌液涂布YPD平板(200μg/ml G418)，37℃过夜倒置培养。挑取部分克隆划线YPD平板(1200μg/ml G418)，37℃倒置培养2天。挑取生长情况较好的数株接种于YPD液体培养基，37℃振荡培养一天，离心收集菌体后弃去YPD培养基，加入BMMY培养基(0.5％甲醇)，37℃振荡诱导培养48小时。收集菌体，玻璃珠剧烈振荡破碎后收集破菌上清，通过斑点杂交法检测分别检测HPV6 L1、HPV11 L1、HPV16 L1、HPV18L1表达情况(图7)，检测用抗体分别为HPV6 L1型别特异性中和单抗H6.M48、HPV11 L1型别特异性中和单抗H11.H3中和单抗、HPV16 L1型别特异性中和单抗H16.V5中和单抗、HPV18L1型别特异性中和单抗H18.J4中和单抗。挑取HPV6 L1、HPV11L1、HPV16 L1、HPV18 L1表达情况均较理想的一株保存，该菌株命名为Quadri-L1-HP。

实施例4 HPV6 L1/HPV11 L1/HPV16 L1/HPV18 L1抗原制备

将Quadri-L1-HP接种于500ml YPD培养基，37℃振荡培养16～20小时，培养后菌液作为发酵种子菌液以1：15的比例接种于BIOTECH-7JG-7000A发酵罐(保兴生物)，培养基为基础盐BSM。发酵初始温度设定37℃，初始pH 5～6，转速300rpm，通气量0.5vvm，DO值100％，添加PTM1痕量盐类。初始增殖阶段培养20～24小时左右，通过调节搅拌转速、空气流量、罐压和补加纯氧维持溶氧值20～40％。当菌体湿重达到60～90g/L时，补加50％甘油或葡萄糖溶液。维持溶氧值20～40％，补加4～8小时。检测菌体湿重增加到100～200g/L时，停止补料。将温度设定在30～37℃，pH值控制调为6～7，开始加入甲醇诱导，甲醇的补加速度为50～100mL/min。维持溶氧值>20％，温度设定在30～37℃，pH值控制为6～7，诱导40小时发酵结束。4℃，8000rpm，离心10分钟收集菌泥，-20℃冻存。按1：3加入破菌缓冲液，1200bar，高压匀浆破碎4次。破碎后悬浊液以4℃，8000rpm，离心30min收集上清液。破菌上清液使用20％～50％蔗糖梯度超离，4℃，40000rpm，超离4小时，收集40％梯度样品，超滤去除蔗糖，得到Quadri-L1纯化样品。

实施例5 HPV6 L1/HPV11 L1/HPV16 L1/HPV18 L1抗原含量检测

夹心法ELISA检测Quadri-L1中HPV6 L1、HPV11 L1、HPV16 L1和HPV18 L1含量，包被抗体为自制兔多抗，检测抗体为型别特异性中和单抗：使用HPV6 L1兔多抗和H6.M48中和单抗对HPV6 L1含量进行定量；使用HPV11 L1兔多抗(和H11.H3中和单抗对HPV11 L1含量进行定量；使用HPV16 L1兔多抗和H16.V5中和单抗对HPV16 L1含量进行定量；使用HPV18 L1兔多抗和H18.J4中和单抗对HPV18 L1含量进行定量。

操作步骤简述如下：向96孔酶标板中分别加入不同型别的自制兔多抗，4℃包被过夜；弃去包被液，洗涤，37℃封闭2小时；加入Quadri-L1纯化样品和对应的HPV6 L1、HPV11L1、HPV16 L1和HPV18 L1标准品(对倍稀释6～12个梯度)，37℃放置1小时；对应兔多抗型别，分别加入不同的型别特异性中和单抗，37℃放置1小时；加入HRP标记的羊抗鼠IgG，37℃1小时；加入TMB显色液，37℃放置5～20分钟；加入终止液终止显色反应，酶标仪测定450nm吸收值。根据HPV6 L1、HPV11 L1、HPV16 L1和HPV18 L1标准品的读数制作标准曲线，确定Quadri-L1纯化样品中相应的抗原含量(表1)。

表1Quadri-L1纯化样品中HPV6 L1、HPV11 L1、HPV16 L1和HPV18 L1抗原含量检测(夹心法ELISA)

实施例6 HPV6 L1/HPV11 L1/HPV16 L1/HPV18 L1颗粒结构确证

透射电子显微镜(TEM)观察Quadri-L1纯化样品，结果如图8，Quadri-L1纯化样品形成了颗粒直径约55～70nm的VLP。

实施例7 HPV6 L1/HPV11 L1/HPV16 L1/HPV18 L1疫苗制备

将Quadri-L1纯化样品吸附磷酸铝佐剂，制备得到Quadri-L1疫苗。

实施例8 HPV6 L1/HPV11 L1/HPV16 L1/HPV18 L1疫苗免疫原性测定

取6～8周龄的BALB/c小鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司，SCXK(京)2016-0011),每组8只，分为6组，分别对应5μg、2μg和0.5μg HPV16 L1的Quadri-L1，另取1组免疫未吸附抗原蛋白的空白氢氧化铝佐剂。免疫程序：0天、14天、28天三次免疫(皮下注射)，42天处死小鼠，眼球取血，4000g离心10分钟，取血清-20℃冻存。

ELISA检测鼠血清转阳率，方法简述如下：向96孔酶标板中分别加入HPV6 L1、HPV11L1、HPV16 L1和HPV18 L1标准品，4℃包被过夜；弃去包被液，洗涤，37℃封闭2小时；加入对倍稀释的鼠血清，37℃放置1小时；弃去鼠血清，洗涤，加入HRP标记的羊抗鼠IgG，37℃1小时；加入TMB显色液，37℃放置5～20分钟；加入终止液终止显色反应，酶标仪测定450nm吸收值，以8个阴性对照血清(免疫铝佐剂的鼠血清)的450nm吸收值的平均值加上3倍标准差(SD)设定为Cutoff值。稀释后待检血清的OD450值大于Cutoff值的为阳性，否则为阴性。取所有待检血清最高的阳性稀释倍数作为血清抗体滴度值，分别计算各组的抗体几何平均滴度(GMT)，结果如图9。

结果显示，Quadri-L1免疫后血清可诱导HPV6 L1、HPV11 L1、HPV16 L1和HPV18 L1抗体，抗体滴度水平相近，具有一定的量效关系。

以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法、组合物的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。

序列表

<110> 重庆博唯佰泰生物制药有限公司

上海博唯生物科技有限公司

<120> 重组表达载体系统、重组工程菌及其制备方法和用途

<160> 45

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1506

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgtggagac catctgactc gactgtctac gttcctccac ctaacccagt ctctaaggtt 60

gtggctaccg acgcctacgt gactagaacc aacatcttct accacgcatc gtcctctaga 120

ttgctggccg ttggacatcc ttacttctcc atcaagagag ccaacaaaac cgtcgtgcca 180

aaggtttctg gctaccagta tagagtcttc aaggtggttc tgcctgaccc taacaagttt 240

gccctgccag actcgtcctt gttcgatcct acgactcaaa gactcgtttg ggcctgcact 300

ggtcttgagg ttggcagagg acagccactc ggagtcggcg tttctggtca tcctttcctg 360

aacaagtacg acgatgttga gaactctggt tccggaggca atcctggaca ggacaacaga 420

gtcaatgttg gcatggacta caagcaaact cagctctgta tggtgggatg cgcacctcca 480

ctgggtgagc attggggaaa aggcaagcag tgcaccaaca ctccagttca ggcaggtgac 540

tgccctccat tggagctgat tacctcggtc atccaggacg gtgatatggt tgacaccgga 600

ttcggtgcca tgaacttcgc tgacctgcag accaacaagt ccgatgtgcc aatcgacatc 660

tgcggaacga cctgtaaata ccctgactac ttgcagatgg cagccgatcc atacggcgac 720

agactcttct tctttctgag aaaggagcag atgtttgcta gacacttttt caacagagcc 780

ggagaggtcg gtgagcctgt tccagacacc ctgatcatta agggctcggg aaacagaact 840

tctgtcggct cctcgatcta cgtgaacacc ccttccggtt cgttggtgtc gtccgaggct 900

caactgttca acaagccata ctggctccag aaagcccaag gtcacaacaa tggcatctgc 960

tggggtaacc agctgttcgt tactgtcgtg gacaccacga gatcgaccaa catgactctg 1020

tgtgcctccg ttaccacatc ttcgacttac accaactccg actataagga gtacatgaga 1080

cacgttgaag agtacgactt gcaattcatc tttcagctct gctcgattac cctgtccgca 1140

gaagtcatgg cctacatcca cactatgaat ccatcggtgc ttgaggactg gaactttggc 1200

ttgtccccac ctccaaacgg aactctggaa gacacctata gatacgtgca gtcgcaagcc 1260

atcacgtgcc agaagccaac ccctgagaag gaaaagccag atccttacaa gaacctgtcc 1320

ttctgggagg tcaatctcaa ggagaagttc tcgtccgaac tggaccagta cccattgggt 1380

agaaagttcc tgctccagtc tggataccgt ggtagatcgt ccatcagaac cggagtgaag 1440

agaccagcag tttccaaggc ttctgccgca cctaagcgta aaagagccaa gaccaagaga 1500

taatag 1506

<210> 2

<211> 1509

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgtggagac catctgactc gaccgtctac gttcctccac ctaacccagt ctccaaagtg 60

gttgctactg atgcctacgt caagagaacc aacatcttct accacgcctc ttcgtccaga 120

ttgctggcag ttggacatcc ttactattcc atcaagaaag ttaacaagac cgtggtccct 180

aaggtttcgg gctatcagta cagagtgttc aaggtcgttc tgccagaccc taacaagttt 240

gccttgccag attcctcgct gttcgaccct accactcaaa gactggtttg ggcttgcacg 300

ggtttggaag tgggcagagg acaaccactg ggtgtcggag tttccggcca tccattgctg 360

aacaagtacg acgatgttga gaactcgggt ggatacggtg gcaatccagg acaagacaac 420

agagtgaatg tcggcatgga ctacaagcaa acccagctgt gcatggttgg ttgtgcacca 480

cctctgggtg aacattgggg aaagggcact cagtgctcca acacctctgt tcagaatggt 540

gactgtcctc cactggagct gatcacctcg gttattcagg atggagacat ggtggacact 600

ggcttcggtg caatgaactt tgccgacttg cagaccaaca agtccgatgt tccattggac 660

atttgcggca ctgtgtgcaa atatcctgac tacctgcaga tggctgcaga tccatacggt 720

gacagactct tcttctacct gagaaaggag cagatgttcg ccagacactt ctttaacaga 780

gctggcaccg ttggtgagcc tgttccagat gacctgttgg tgaagggtgg aaacaataga 840

tcctctgttg cctcgtccat ctacgtccac accccatcgg gctctctggt gtcctcggag 900

gcccaactgt tcaacaagcc ttactggctc cagaaggccc aaggacacaa caatggcatc 960

tgctggggaa accacctgtt cgtcaccgtt gtggacacga ctagatccac caacatgact 1020

ttgtgtgcct ctgtttccaa gtcggctacc tacacgaact cggactataa ggagtacatg 1080

agacatgttg aagagttcga cctgcagttt atcttccagc tctgctccat taccttgtcg 1140

gcagaagtga tggcctacat ccacacgatg aacccatccg tcttggaaga ctggaacttc 1200

ggtctgtctc cacctccaaa tggcaccctg gaagacacgt acagatatgt gcagtcgcaa 1260

gccatcacct gtcagaaacc aactcctgaa aaggagaaac aggacccata caaggatatg 1320

tcgttctggg aggtcaacct gaaggagaag ttctcttcgg aactggacca gttcccattg 1380

ggaagaaagt tcctgctcca gtctggttat agaggaagaa cctccgcaag aactggcatc 1440

aagagacctg ccgtgtcgaa gccatccacc gctcctaaga gaaagagaac gaagaccaaa 1500

aagtaatag 1509

<210> 3

<211> 1521

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgtctcttt ggttgccatc cgaggctact gtttacttgc cacctgtccc agtttctaag 60

gtcgtgtcaa ctgatgaata cgttgctaga accaacatct attaccacgc tggaacttct 120

agattgcttg ctgttggtca tccatacttc cctatcaaga aacctaacaa taacaagatc 180

cttgttccaa aggtctctgg attgcagtac agagttttca gaatccactt gcctgaccca 240

aacaagttcg gttttcctga cacctccttc tacaacccag atactcaaag attggtgtgg 300

gcctgtgttg gtgtcgaggt tggacgtggt caaccattgg gagttggtat ttctggacat 360

cctttgctta acaagttgga tgacactgaa aatgcttctg cctacgcagc caacgctggt 420

gttgacaaca gagagtgtat ctctatggat tacaaacaga cccaattgtg tcttattggt 480

tgcaagccac ctattggtga acactggggt aagggatctc catgtaccaa cgttgctgtc 540

aatccaggtg attgtcctcc attggagctt atcaacactg ttattcaaga tggtgacatg 600

gttgatactg gatttggtgc tatggacttc actaccttgc aagctaacaa gtccgaggtt 660

ccattggaca tttgtacttc tatctgcaag tatccagact acattaagat ggtctctgaa 720

ccatacggtg actccttgtt tttctacctt cgtagagagc aaatgtttgt tagacacttg 780

ttcaacagag ctggtgccgt tggtgagaat gtcccagacg atttgtacat caagggatct 840

ggttccactg caaacttggc ctcttccaac tacttcccaa ctccttcagg ttctatggtt 900

acctccgatg ctcaaatctt caacaagcct tactggttgc aaagagcaca gggtcacaac 960

aatggaattt gttggggtaa ccaacttttc gttactgtcg ttgataccac aagatccacc 1020

aacatgtcct tgtgtgctgc catttctact tcagaaacca catacaagaa tactaacttc 1080

aaggagtacc ttagacatgg tgaggaatac gacttgcagt tcatctttca attgtgcaag 1140

attaccttga ctgctgacgt tatgacctac atccactcta tgaactccac tatccttgaa 1200

gattggaact tcggattgca accacctcca ggtggaacct tggaagatac ttacagattt 1260

gtcacatccc aagccattgc ttgtcagaag cacactcctc cagctcctaa ggaagatcca 1320

cttaagaaat acaccttctg ggaagtcaac ttgaaagaga agttctctgc tgaccttgat 1380

cagtttcctt tgggtagaaa gttcttactt caagctggat tgaaggccaa accaaagttc 1440

accttgggta aaagaaaggc tactccaacc acatcatcta cttccacaac cgccaaacgt 1500

aagaagagaa aactgtaata g 1521

<210> 4

<211> 1527

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atggctctgt ggagaccatc tgacaacacc gtctacttgc cacctccatc tgttgccaga 60

gtcgttaaca ccgacgatta cgtcactaga acatccatct tctaccacgc tggttcctct 120

agattgctta ctgttggtaa tccatacttc agagttccag ctggtggagg taataagcaa 180

gacattccta aggtttctgc ttaccaatat agagtcttta gagttcagtt gcctgaccca 240

aacaagttcg gtttgcctga tacttctatc tacaacccag agactcaaag attggtttgg 300

gcctgtgctg gtgtcgagat cggtagagga caacctttgg gagttggtct ttctggacac 360

ccattctaca acaagttgga tgacactgaa tcttcacatg ctgccacttc caatgtttct 420

gaggatgttc gtgacaacgt ctctgttgat tacaagcaaa ctcagttgtg tatccttgga 480

tgtgcccctg ctattggtga acactgggct aaaggtactg cctgtaagtc cagaccattg 540

tctcaaggtg actgcccacc tttggagctt aagaacactg ttttggaaga tggtgacatg 600

gttgatactg gatatggtgc tatggacttc tctaccctgc aggatactaa gtgtgaggtt 660

ccattggaca tctgtcaatc tatttgtaag taccctgatt atcttcagat gtctgctgac 720

ccatacggtg attctatgtt cttttgcttg agacgtgagc aacttttcgc tagacacttt 780

tggaacagag caggtactat gggtgacacc gttccacaat ctttgtatat caaaggaact 840

ggtatgagag cttctcctgg atcctgtgtt tactcaccat ctccttccgg ttctattgtt 900

acctcagact ctcaattgtt taacaagcca tactggttac acaaggctca gggtcataac 960

aatggtgttt gctggcacaa ccaattgttc gttactgtcg ttgacaccac tagatccacc 1020

aatttgacaa tttgtgcttc tactcagtcc cctgttccag gtcaatatga tgctaccaaa 1080

ttcaagcaat actctagaca cgttgaggaa tatgacttgc agtttatctt ccaattgtgt 1140

actattacct tgactgccga tgttatgtct tacattcatt ccatgaactc ttcaatcttg 1200

gaggattgga actttggtgt tccaccacct ccaacaactt ctttggttga cacctacaga 1260

ttcgtccaat ctgttgctat tacctgtcag aaggatgccg caccagctga aaacaaggat 1320

ccatacgaca agttgaagtt ttggaatgtc gatttgaagg agaagttctc ccttgacttg 1380

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gttcgtgtca gagctagaaa gtaatag 1527

<210> 5

<211> 1512

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gtcgacgcgg agaacgatct cctcgagctg ctcgcggatc agcttgtggc ccggtaatgg 60

aaccaggccg acggcacgct ccttgcggac cacggtggct ggcgagccca gtttgtgaac 120

gaggtcgttt agaacgtcct gcgcaaagtc cagtgtcaga tgaatgtcct cctcggacca 180

attcagcatg ttctcgagca gccatctgtc tttggagtag aagcgtaatc tctgctcctc 240

gttactgtac cggaagaggt agtttgcctc gccgcccata atgaacaggt tctctttctg 300

gtggcctgtg agcagcgggg acgtctggac ggcgtcgatg aggcccttga ggcgctcgta 360

gtacttgttc gcgtcgctgt agccggccgc ggtgacgata cccacataga ggtccttggc 420

cattagtttg atgaggtggg gcaggatggg cgactcggca tcgaaatttt tgccgtcgtc 480

gtacagtgtg atgtcaccat cgaatgtaat gagctgcagc ttgcgatctc ggatggtttt 540

ggaatggaag aaccgcgaca tctccaacag ctgggccgtg ttgagaatga gccggacgtc 600

gttgaacgag ggggccacaa gccggcgttt gctgatggcg cggcgctcgt cctcgatgta 660

gaaggccttt tccagaggca gtctcgtgaa gaagctgcca acgctcggaa ccagctgcac 720

gagccgagac aattcggggg tgccggcttt ggtcatttca atgttgtcgt cgatgaggag 780

ttcgaggtcg tggaagattt ccgcgtagcg gcgttttgcc tcagagttta ccatgaggtc 840

gtccactgca gagatgccgt tgctcttcac cgcgtacagg acgaacggcg tggccagcag 900

gcccttgatc cattctatga ggccatctcg acggtgttcc ttgagtgcgt actccactct 960

gtagcgactg gacatctcga gactgggctt gctgtgctgg atgcaccaat taattgttgc 1020

cgcatgcatc cttgcaccgc aagtttttaa aacccactcg ctttagccgt cgcgtaaaac 1080

ttgtgaatct ggcaactgag ggggttctgc agccgcaacc gaacttttcg cttcgaggac 1140

gcagctggat ggtgtcatgt gaggctctgt ttgctggcgt agcctacaac gtgaccttgc 1200

ctaaccggac ggcgctaccc actgctgtct gtgcctgcta ccagaaaatc accagagcag 1260

cagagggccg atgtggcaac tggtggggtg tcggacaggc tgtttctcca cagtgcaaat 1320

gcgggtgaac cggccagaaa gtaaattctt atgctaccgt gcagtgactc cgacatcccc 1380

agtttttgcc ctacttgatc acagatgggg tcagcgctgc cgctaagtgt acccaaccgt 1440

ccccacacgg tccatctata aatactgctg ccagtgcacg gtggtgacat caatctaaag 1500

tacaaaaaca aa 1512

<210> 6

<211> 341

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gtttgtagcc ttagacatga ctgttcctca gttcaagttg ggcacttacg agaagaccgg 60

tcttgctaga ttctaatcaa gaggatgtca gaatgccatt tgcctgagag atgcaggctt 120

catttttgat acttttttat ttgtaaccta tatagtatag gatttttttt gtcattttgt 180

ttcttctcgt acgagcttgc tcctgatcag cctatctcgc agctgatgaa tatcttgtgg 240

taggggtttg ggaaaatcat tcgagtttga tgtttttctt ggtatttccc actcctcttc 300

agagtacaga agattaagtg agaccttcgt ttgtgcggat c 341

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

accaaaagat ctgtcgacgc ggag 24

<210> 8

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cttggctaca tatgatcgat cgtgtacacg tttcgaattt gtttttgtac ttt 53

<210> 9

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tcaagtcaag cttcacgtgg ctagctttgt ttttgtactt t 41

<210> 10

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gcccgatcat atgcctgcag gcagctttct agaacaa 37

<210> 11

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

aaacgtgaag cttgaattcg cggccgccag ctttct 36

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

tgggggatcc gcacaaacga a 21

<210> 13

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

cccttagatc tcccacacac catagct 27

<210> 14

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

tgcggtctta aggtttagtt cctcacc 27

<210> 15

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

tattggctta agatgagcca tattcaac 28

<210> 16

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

gggtatcgtc accgcggccg gctacagcac ttgaagtcgg acag 44

<210> 17

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

gttggatcct cgatcacatg tgagc 25

<210> 18

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

aaaggatcct gaggtctgcc tcgt 24

<210> 19

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

cggacaaatt cgaaacgatg t 21

<210> 20

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

acagaaacct gcaggctatt actttttggt c 31

<210> 21

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

aatcgctagc atgtggagac catctg 26

<210> 22

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

ttggtaatgc ggccgcctat tatctcttgg tc 32

<210> 23

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

tgcttcctgc aggctattac agttttctc 29

<210> 24

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

attcgctagc atggctctgt ggagac 26

<210> 25

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

ttccttatgc ggccgctatt actttctagc t 31

<210> 26

<211> 1561

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

accaaaagat ctgtcgacgc ggagaacgat ctcctcgagc tgctcgcgga tcagcttgtg 60

gcccggtaat ggaaccaggc cgacggcacg ctccttgcgg accacggtgg ctggcgagcc 120

cagtttgtga acgaggtcgt ttagaacgtc ctgcgcaaag tccagtgtca gatgaatgtc 180

ctcctcggac caattcagca tgttctcgag cagccatctg tctttggagt agaagcgtaa 240

tctctgctcc tcgttactgt accggaagag gtagtttgcc tcgccgccca taatgaacag 300

gttctctttc tggtggcctg tgagcagcgg ggacgtctgg acggcgtcga tgaggccctt 360

gaggcgctcg tagtacttgt tcgcgtcgct gtagccggcc gcggtgacga tacccacata 420

gaggtccttg gccattagtt tgatgaggtg gggcaggatg ggcgactcgg catcgaaatt 480

tttgccgtcg tcgtacagtg tgatgtcacc atcgaatgta atgagctgca gcttgcgatc 540

tcggatggtt ttggaatgga agaaccgcga catctccaac agctgggccg tgttgagaat 600

gagccggacg tcgttgaacg agggggccac aagccggcgt ttgctgatgg cgcggcgctc 660

gtcctcgatg tagaaggcct tttccagagg cagtctcgtg aagaagctgc caacgctcgg 720

aaccagctgc acgagccgag acaattcggg ggtgccggct ttggtcattt caatgttgtc 780

gtcgatgagg agttcgaggt cgtggaagat ttccgcgtag cggcgttttg cctcagagtt 840

taccatgagg tcgtccactg cagagatgcc gttgctcttc accgcgtaca ggacgaacgg 900

cgtggccagc aggcccttga tccattctat gaggccatct cgacggtgtt ccttgagtgc 960

gtactccact ctgtagcgac tggacatctc gagactgggc ttgctgtgct ggatgcacca 1020

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gtcgcgtaaa acttgtgaat ctggcaactg agggggttct gcagccgcaa ccgaactttt 1140

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acgtgacctt gcctaaccgg acggcgctac ccactgctgt ctgtgcctgc taccagaaaa 1260

tcaccagagc agcagagggc cgatgtggca actggtgggg tgtcggacag gctgtttctc 1320

cacagtgcaa atgcgggtga accggccaga aagtaaattc ttatgctacc gtgcagtgac 1380

tccgacatcc ccagtttttg ccctacttga tcacagatgg ggtcagcgct gccgctaagt 1440

gtacccaacc gtccccacac ggtccatcta taaatactgc tgccagtgca cggtggtgac 1500

atcaatctaa agtacaaaaa caaattcgaa acgtgtacac gatcgatcat atgtagccaa 1560

g 1561

<210> 27

<211> 443

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

gcccgatcat atgcctgcag gcagctttct agaacaaaaa ctcatctcag aagaggatct 60

gaatagcgcc gtcgaccatc atcatcatca tcattgagtt tgtagcctta gacatgactg 120

ttcctcagtt caagttgggc acttacgaga agaccggtct tgctagattc taatcaagag 180

gatgtcagaa tgccatttgc ctgagagatg caggcttcat ttttgatact tttttatttg 240

taacctatat agtataggat tttttttgtc attttgtttc ttctcgtacg agcttgctcc 300

tgatcagcct atctcgcagc tgatgaatat cttgtggtag gggtttggga aaatcattcg 360

agtttgatgt ttttcttggt atttcccact cctcttcaga gtacagaaga ttaagtgaga 420

ccttcgtttg tgcggatccc cca 443

<210> 28

<211> 3884

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

agatctgtcg acgcggagaa cgatctcctc gagctgctcg cggatcagct tgtggcccgg 60

taatggaacc aggccgacgg cacgctcctt gcggaccacg gtggctggcg agcccagttt 120

gtgaacgagg tcgtttagaa cgtcctgcgc aaagtccagt gtcagatgaa tgtcctcctc 180

ggaccaattc agcatgttct cgagcagcca tctgtctttg gagtagaagc gtaatctctg 240

ctcctcgtta ctgtaccgga agaggtagtt tgcctcgccg cccataatga acaggttctc 300

tttctggtgg cctgtgagca gcggggacgt ctggacggcg tcgatgaggc ccttgaggcg 360

ctcgtagtac ttgttcgcgt cgctgtagcc ggccgcggtg acgataccca catagaggtc 420

cttggccatt agtttgatga ggtggggcag gatgggcgac tcggcatcga aatttttgcc 480

gtcgtcgtac agtgtgatgt caccatcgaa tgtaatgagc tgcagcttgc gatctcggat 540

ggttttggaa tggaagaacc gcgacatctc caacagctgg gccgtgttga gaatgagccg 600

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gatgtagaag gccttttcca gaggcagtct cgtgaagaag ctgccaacgc tcggaaccag 720

ctgcacgagc cgagacaatt cgggggtgcc ggctttggtc atttcaatgt tgtcgtcgat 780

gaggagttcg aggtcgtgga agatttccgc gtagcggcgt tttgcctcag agtttaccat 840

gaggtcgtcc actgcagaga tgccgttgct cttcaccgcg tacaggacga acggcgtggc 900

cagcaggccc ttgatccatt ctatgaggcc atctcgacgg tgttccttga gtgcgtactc 960

cactctgtag cgactggaca tctcgagact gggcttgctg tgctggatgc accaattaat 1020

tgttgccgca tgcatccttg caccgcaagt ttttaaaacc cactcgcttt agccgtcgcg 1080

taaaacttgt gaatctggca actgaggggg ttctgcagcc gcaaccgaac ttttcgcttc 1140

gaggacgcag ctggatggtg tcatgtgagg ctctgtttgc tggcgtagcc tacaacgtga 1200

ccttgcctaa ccggacggcg ctacccactg ctgtctgtgc ctgctaccag aaaatcacca 1260

gagcagcaga gggccgatgt ggcaactggt ggggtgtcgg acaggctgtt tctccacagt 1320

gcaaatgcgg gtgaaccggc cagaaagtaa attcttatgc taccgtgcag tgactccgac 1380

atccccagtt tttgccctac ttgatcacag atggggtcag cgctgccgct aagtgtaccc 1440

aaccgtcccc acacggtcca tctataaata ctgctgccag tgcacggtgg tgacatcaat 1500

ctaaagtaca aaaacaaatt cgaaacgtgt acacgatcga tcatatgcct gcaggcagct 1560

ttctagaaca aaaactcatc tcagaagagg atctgaatag cgccgtcgac catcatcatc 1620

atcatcattg agtttgtagc cttagacatg actgttcctc agttcaagtt gggcacttac 1680

gagaagaccg gtcttgctag attctaatca agaggatgtc agaatgccat ttgcctgaga 1740

gatgcaggct tcatttttga tactttttta tttgtaacct atatagtata ggattttttt 1800

tgtcattttg tttcttctcg tacgagcttg ctcctgatca gcctatctcg cagctgatga 1860

atatcttgtg gtaggggttt gggaaaatca ttcgagtttg atgtttttct tggtatttcc 1920

cactcctctt cagagtacag aagattaagt gagaccttcg tttgtgcgga tcccccacac 1980

accatagctt caaaatgttt ctactccttt tttactcttc cagattttct cggactccgc 2040

gcatcgccgt accacttcaa aacacccaag cacagcatac taaattttcc ctctttcttc 2100

ctctagggtg tcgttaatta cccgtactaa aggtttggaa aagaaaaaag agaccgcctc 2160

gtttcttttt cttcgtcgaa aaaggcaata aaaattttta tcacgtttct ttttcttgaa 2220

attttttttt ttagtttttt tctctttcag tgacctccat tgatatttaa gttaataaac 2280

ggtcttcaat ttctcaagtt tcagtttcat ttttcttgtt ctattacaac tttttttact 2340

tcttgttcat tagaaagaaa gcatagcaat ctaatctaag gggcggtgtt gacaattaat 2400

catcggcata gtatatcggc atagtataat acgacaaggt gaggaactaa accatggcca 2460

agttgaccag tgccgttccg gtgctcaccg cgcgcgacgt cgccggagcg gtcgagttct 2520

ggaccgaccg gctcgggttc tcccgggact tcgtggagga cgacttcgcc ggtgtggtcc 2580

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tggcctgggt gtgggtgcgc ggcctggacg agctgtacgc cgagtggtcg gaggtcgtgt 2700

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tcctttgtcg atatcatgta attagttatg tcacgcttac attcacgccc tccccccaca 2940

tccgctctaa ccgaaaagga aggagttaga caacctgaag tctaggtccc tatttatttt 3000

tttatagtta tgttagtatt aagaacgtta tttatatttc aaatttttct tttttttctg 3060

tacagacgcg tgtacgcatg taacattata ctgaaaacct tgcttgagaa ggttttggga 3120

cgctcgaagg ctttaatttg caagctggag accaacatgt gagcaaaagg ccagcaaaag 3180

gccaggaacc gtaaaaaggc cgcgttgctg gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac 3240

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agacacgact tatcgccact ggcagcagcc actggtaaca ggattagcag agcgaggtat 3600

gtaggcggtg ctacagagtt cttgaagtgg tggcctaact acggctacac tagaaggaca 3660

gtatttggta tctgcgctct gctgaagcca gttaccttcg gaaaaagagt tggtagctct 3720

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acgcgcagaa aaaaaggatc tcaagaagat cctttgatct tttctacggg gtctgacgct 3840

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<210> 29

<211> 1549

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

accaaaagat ctgtcgacgc ggagaacgat ctcctcgagc tgctcgcgga tcagcttgtg 60

gcccggtaat ggaaccaggc cgacggcacg ctccttgcgg accacggtgg ctggcgagcc 120

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ctcctcggac caattcagca tgttctcgag cagccatctg tctttggagt agaagcgtaa 240

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gaggcgctcg tagtacttgt tcgcgtcgct gtagccggcc gcggtgacga tacccacata 420

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tttgccgtcg tcgtacagtg tgatgtcacc atcgaatgta atgagctgca gcttgcgatc 540

tcggatggtt ttggaatgga agaaccgcga catctccaac agctgggccg tgttgagaat 600

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taccatgagg tcgtccactg cagagatgcc gttgctcttc accgcgtaca ggacgaacgg 900

cgtggccagc aggcccttga tccattctat gaggccatct cgacggtgtt ccttgagtgc 960

gtactccact ctgtagcgac tggacatctc gagactgggc ttgctgtgct ggatgcacca 1020

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gtcgcgtaaa acttgtgaat ctggcaactg agggggttct gcagccgcaa ccgaactttt 1140

cgcttcgagg acgcagctgg atggtgtcat gtgaggctct gtttgctggc gtagcctaca 1200

acgtgacctt gcctaaccgg acggcgctac ccactgctgt ctgtgcctgc taccagaaaa 1260

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<210> 30

<211> 449

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

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ggatctgaat agcgccgtcg accatcatca tcatcatcat tgagtttgta gccttagaca 120

tgactgttcc tcagttcaag ttgggcactt acgagaagac cggtcttgct agattctaat 180

caagaggatg tcagaatgcc atttgcctga gagatgcagg cttcattttt gatacttttt 240

tatttgtaac ctatatagta taggattttt tttgtcattt tgtttcttct cgtacgagct 300

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<210> 31

<211> 3879

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

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<210> 32

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<400> 32

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ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc ttaccggata cctgtccgcc 5340

tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct caatgctcac gctgtaggta tctcagttcg 5400

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ctggcagcag ccactggtaa caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg tgctacagag 5580

ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac actagaagga cagtatttgg tatctgcgct 5640

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<210> 33

<211> 502

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

cccttagatc tcccacacac catagcttca aaatgtttct actccttttt tactcttcca 60

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gaaaaaagag accgcctcgt ttctttttct tcgtcgaaaa aggcaataaa aatttttatc 240

acgtttcttt ttcttgaaat tttttttttt agtttttttc tctttcagtg acctccattg 300

atatttaagt taataaacgg tcttcaattt ctcaagtttc agtttcattt ttcttgttct 360

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

gggtatcgtc accgcggccg gctacagcac ttgaagtcgg acagtgagtg tagtcttgag 60

aaattctgaa gccgtatttt tattatcagt gagtcagtca tcaggagatc ctctacgccg 120

gacgcatcgt ggccgacctg cagggggggg gggggcgctg aggtctgcct cgtgaagaag 180

gtgttgctga ctcataccag gcctgaatcg ccccatcatc cagccagaaa gtgagggagc 240

cacggttgat gagagctttg ttgtaggtgg accagttggt gattttgaac ttttgctttg 300

ccacggaacg gtctgcgttg tcgggaagat gcgtgatctg atccttcaac tcagcaaaag 360

ttcgatttat tcaacaaagc cgccgtcccg tcaagtcagc gtaatgctct gccagtgtta 420

caaccaatta accaattctg attagaaaaa ctcatcgagc atcaaatgaa actgcaattt 480

attcatatca ggattatcaa taccatattt ttgaaaaagc cgtttctgta atgaaggaga 540

aaactcaccg aggcagttcc ataggatggc aagatcctgg tatcggtctg cgattccgac 600

tcgtccaaca tcaatacaac ctattaattt cccctcgtca aaaataaggt tatcaagtga 660

gaaatcacca tgagtgacga ctgaatccgg tgagaatggc aaaagcttat gcatttcttt 720

ccagacttgt tcaacaggcc agccattacg ctcgtcatca aaatcactcg catcaaccaa 780

accgttattc attcgtgatt gcgcctgagc gagacgaaat acgcgatcgc tgttaaaagg 840

acaattacaa acaggaatcg aatgcaaccg gcgcaggaac actgccagcg catcaacaat 900

attttcacct gaatcaggat attcttctaa tacctggaat gctgttttcc cggggatcgc 960

agtggtgagt aaccatgcat catcaggagt acggataaaa tgcttgatgg tcggaagagg 1020

cataaattcc gtcagccagt ttagtctgac catctcatct gtaacatcat tggcaacgct 1080

acctttgcca tgtttcagaa acaactctgg cgcatcgggc ttcccataca atcgatagat 1140

tgtcgcacct gattgcccga cattatcgcg agcccattta tacccatata aatcagcatc 1200

catgttggaa tttaatcgcg gcctcgagca agacgtttcc cgttgaatat ggctcatctt 1260

aagccaata 1269

<210> 35

<211> 5223

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 35

agatctccca cacaccatag cttcaaaatg tttctactcc ttttttactc ttccagattt 60

tctcggactc cgcgcatcgc cgtaccactt caaaacaccc aagcacagca tactaaattt 120

tccctctttc ttcctctagg gtgtcgttaa ttacccgtac taaaggtttg gaaaagaaaa 180

aagagaccgc ctcgtttctt tttcttcgtc gaaaaaggca ataaaaattt ttatcacgtt 240

tctttttctt gaaatttttt tttttagttt ttttctcttt cagtgacctc cattgatatt 300

taagttaata aacggtcttc aatttctcaa gtttcagttt catttttctt gttctattac 360

aacttttttt acttcttgtt cattagaaag aaagcatagc aatctaatct aaggggcggt 420

gttgacaatt aatcatcggc atagtatatc ggcatagtat aatacgacaa ggtgaggaac 480

taaaccttaa gatgagccat attcaacggg aaacgtcttg ctcgaggccg cgattaaatt 540

ccaacatgga tgctgattta tatgggtata aatgggctcg cgataatgtc gggcaatcag 600

gtgcgacaat ctatcgattg tatgggaagc ccgatgcgcc agagttgttt ctgaaacatg 660

gcaaaggtag cgttgccaat gatgttacag atgagatggt cagactaaac tggctgacgg 720

aatttatgcc tcttccgacc atcaagcatt ttatccgtac tcctgatgat gcatggttac 780

tcaccactgc gatccccggg aaaacagcat tccaggtatt agaagaatat cctgattcag 840

gtgaaaatat tgttgatgcg ctggcagtgt tcctgcgccg gttgcattcg attcctgttt 900

gtaattgtcc ttttaacagc gatcgcgtat ttcgtctcgc tcaggcgcaa tcacgaatga 960

ataacggttt ggttgatgcg agtgattttg atgacgagcg taatggctgg cctgttgaac 1020

aagtctggaa agaaatgcat aagcttttgc cattctcacc ggattcagtc gtcactcatg 1080

gtgatttctc acttgataac cttatttttg acgaggggaa attaataggt tgtattgatg 1140

ttggacgagt cggaatcgca gaccgatacc aggatcttgc catcctatgg aactgcctcg 1200

gtgagttttc tccttcatta cagaaacggc tttttcaaaa atatggtatt gataatcctg 1260

atatgaataa attgcagttt catttgatgc tcgatgagtt tttctaatca gaattggtta 1320

attggttgta acactggcag agcattacgc tgacttgacg ggacggcggc tttgttgaat 1380

aaatcgaact tttgctgagt tgaaggatca gatcacgcat cttcccgaca acgcagaccg 1440

ttccgtggca aagcaaaagt tcaaaatcac caactggtcc acctacaaca aagctctcat 1500

caaccgtggc tccctcactt tctggctgga tgatggggcg attcaggcct ggtatgagtc 1560

agcaacacct tcttcacgag gcagacctca gcgccccccc cccccctgca ggtcggccac 1620

gatgcgtccg gcgtagagga tctcctgatg actgactcac tgataataaa aatacggctt 1680

cagaatttct caagactaca ctcactgtcc gacttcaagt gctgtagccg gccgcggtga 1740

cgatacccac atagaggtcc ttggccatta gtttgatgag gtggggcagg atgggcgact 1800

cggcatcgaa atttttgccg tcgtcgtaca gtgtgatgtc accatcgaat gtaatgagct 1860

gcagcttgcg atctcggatg gttttggaat ggaagaaccg cgacatctcc aacagctggg 1920

ccgtgttgag aatgagccgg acgtcgttga acgagggggc cacaagccgg cgtttgctga 1980

tggcgcggcg ctcgtcctcg atgtagaagg ccttttccag aggcagtctc gtgaagaagc 2040

tgccaacgct cggaaccagc tgcacgagcc gagacaattc gggggtgccg gctttggtca 2100

tttcaatgtt gtcgtcgatg aggagttcga ggtcgtggaa gatttccgcg tagcggcgtt 2160

ttgcctcaga gtttaccatg aggtcgtcca ctgcagagat gccgttgctc ttcaccgcgt 2220

acaggacgaa cggcgtggcc agcaggccct tgatccattc tatgaggcca tctcgacggt 2280

gttccttgag tgcgtactcc actctgtagc gactggacat ctcgagactg ggcttgctgt 2340

gctggatgca ccaattaatt gttgccgcat gcatccttgc accgcaagtt tttaaaaccc 2400

actcgcttta gccgtcgcgt aaaacttgtg aatctggcaa ctgagggggt tctgcagccg 2460

caaccgaact tttcgcttcg aggacgcagc tggatggtgt catgtgaggc tctgtttgct 2520

ggcgtagcct acaacgtgac cttgcctaac cggacggcgc tacccactgc tgtctgtgcc 2580

tgctaccaga aaatcaccag agcagcagag ggccgatgtg gcaactggtg gggtgtcgga 2640

caggctgttt ctccacagtg caaatgcggg tgaaccggcc agaaagtaaa ttcttatgct 2700

accgtgcagt gactccgaca tccccagttt ttgccctact tgatcacaga tggggtcagc 2760

gctgccgcta agtgtaccca accgtcccca cacggtccat ctataaatac tgctgccagt 2820

gcacggtggt gacatcaatc taaagtacaa aaacaaattc gaaacgtgta cacgatcgat 2880

catatgcctg caggcagctt tctagaacaa aaactcatct cagaagagga tctgaatagc 2940

gccgtcgacc atcatcatca tcatcattga gtttgtagcc ttagacatga ctgttcctca 3000

gttcaagttg ggcacttacg agaagaccgg tcttgctaga ttctaatcaa gaggatgtca 3060

gaatgccatt tgcctgagag atgcaggctt catttttgat acttttttat ttgtaaccta 3120

tatagtatag gatttttttt gtcattttgt ttcttctcgt acgagcttgc tcctgatcag 3180

cctatctcgc agctgatgaa tatcttgtgg taggggtttg ggaaaatcat tcgagtttga 3240

tgtttttctt ggtatttccc actcctcttc agagtacaga agattaagtg agaccttcgt 3300

ttgtgcggat cccccacaca ccatagcttc aaaatgtttc tactcctttt ttactcttcc 3360

agattttctc ggactccgcg catcgccgta ccacttcaaa acacccaagc acagcatact 3420

aaattttccc tctttcttcc tctagggtgt cgttaattac ccgtactaaa ggtttggaaa 3480

agaaaaaaga gaccgcctcg tttctttttc ttcgtcgaaa aaggcaataa aaatttttat 3540

cacgtttctt tttcttgaaa tttttttttt tagttttttt ctctttcagt gacctccatt 3600

gatatttaag ttaataaacg gtcttcaatt tctcaagttt cagtttcatt tttcttgttc 3660

tattacaact ttttttactt cttgttcatt agaaagaaag catagcaatc taatctaagg 3720

ggcggtgttg acaattaatc atcggcatag tatatcggca tagtataata cgacaaggtg 3780

aggaactaaa ccatggccaa gttgaccagt gccgttccgg tgctcaccgc gcgcgacgtc 3840

gccggagcgg tcgagttctg gaccgaccgg ctcgggttct cccgggactt cgtggaggac 3900

gacttcgccg gtgtggtccg ggacgacgtg accctgttca tcagcgcggt ccaggaccag 3960

gtggtgccgg acaacaccct ggcctgggtg tgggtgcgcg gcctggacga gctgtacgcc 4020

gagtggtcgg aggtcgtgtc cacgaacttc cgggacgcct ccgggccggc catgaccgag 4080

atcggcgagc agccgtgggg gcgggagttc gccctgcgcg acccggccgg caactgcgtg 4140

cacttcgtgg ccgaggagca ggactgacac gtccgacggc ggcccacggg tcccaggcct 4200

cggagatccg tccccctttt cctttgtcga tatcatgtaa ttagttatgt cacgcttaca 4260

ttcacgccct ccccccacat ccgctctaac cgaaaaggaa ggagttagac aacctgaagt 4320

ctaggtccct atttattttt ttatagttat gttagtatta agaacgttat ttatatttca 4380

aatttttctt ttttttctgt acagacgcgt gtacgcatgt aacattatac tgaaaacctt 4440

gcttgagaag gttttgggac gctcgaaggc tttaatttgc aagctggaga ccaacatgtg 4500

agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca 4560

taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa 4620

cccgacagga ctataaagat accaggcgtt tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc 4680

tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc 4740

gctttctcaa tgctcacgct gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct 4800

gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg 4860

tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag 4920

gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta 4980

cggctacact agaaggacag tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg 5040

aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt 5100

tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt 5160

ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt taagggattt tggtcatgag 5220

atc 5223

<210> 36

<211> 2344

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 36

gttggatcct cgatcacatg tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg 60

ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac 120

gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag gactataaag ataccaggcg tttccccctg 180

gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct 240

ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc aatgctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg 300

tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct 360

gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac 420

tggcagcagc cactggtaac aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt 480

tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca ctagaaggac agtatttggt atctgcgctc 540

tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca 600

ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat 660

ctcaagaaga tcctttgatc ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac 720

gttaagggat tttggtcatg agatcagatc tcccacacac catagcttca aaatgtttct 780

actccttttt tactcttcca gattttctcg gactccgcgc atcgccgtac cacttcaaaa 840

cacccaagca cagcatacta aattttccct ctttcttcct ctagggtgtc gttaattacc 900

cgtactaaag gtttggaaaa gaaaaaagag accgcctcgt ttctttttct tcgtcgaaaa 960

aggcaataaa aatttttatc acgtttcttt ttcttgaaat tttttttttt agtttttttc 1020

tctttcagtg acctccattg atatttaagt taataaacgg tcttcaattt ctcaagtttc 1080

agtttcattt ttcttgttct attacaactt tttttacttc ttgttcatta gaaagaaagc 1140

atagcaatct aatctaaggg gcggtgttga caattaatca tcggcatagt atatcggcat 1200

agtataatac gacaaggtga ggaactaaac cttaagatga gccatattca acgggaaacg 1260

tcttgctcga ggccgcgatt aaattccaac atggatgctg atttatatgg gtataaatgg 1320

gctcgcgata atgtcgggca atcaggtgcg acaatctatc gattgtatgg gaagcccgat 1380

gcgccagagt tgtttctgaa acatggcaaa ggtagcgttg ccaatgatgt tacagatgag 1440

atggtcagac taaactggct gacggaattt atgcctcttc cgaccatcaa gcattttatc 1500

cgtactcctg atgatgcatg gttactcacc actgcgatcc ccgggaaaac agcattccag 1560

gtattagaag aatatcctga ttcaggtgaa aatattgttg atgcgctggc agtgttcctg 1620

cgccggttgc attcgattcc tgtttgtaat tgtcctttta acagcgatcg cgtatttcgt 1680

ctcgctcagg cgcaatcacg aatgaataac ggtttggttg atgcgagtga ttttgatgac 1740

gagcgtaatg gctggcctgt tgaacaagtc tggaaagaaa tgcataagct tttgccattc 1800

tcaccggatt cagtcgtcac tcatggtgat ttctcacttg ataaccttat ttttgacgag 1860

gggaaattaa taggttgtat tgatgttgga cgagtcggaa tcgcagaccg ataccaggat 1920

cttgccatcc tatggaactg cctcggtgag ttttctcctt cattacagaa acggcttttt 1980

caaaaatatg gtattgataa tcctgatatg aataaattgc agtttcattt gatgctcgat 2040

gagtttttct aatcagaatt ggttaattgg ttgtaacact ggcagagcat tacgctgact 2100

tgacgggacg gcggctttgt tgaataaatc gaacttttgc tgagttgaag gatcagatca 2160

cgcatcttcc cgacaacgca gaccgttccg tggcaaagca aaagttcaaa atcaccaact 2220

ggtccaccta caacaaagct ctcatcaacc gtggctccct cactttctgg ctggatgatg 2280

gggcgattca ggcctggtat gagtcagcaa caccttcttc acgaggcaga cctcaggatc 2340

cttt 2344

<210> 37

<211> 6261

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 37

ggatctgtcg acgcggagaa cgatctcctc gagctgctcg cggatcagct tgtggcccgg 60

taatggaacc aggccgacgg cacgctcctt gcggaccacg gtggctggcg agcccagttt 120

gtgaacgagg tcgtttagaa cgtcctgcgc aaagtccagt gtcagatgaa tgtcctcctc 180

ggaccaattc agcatgttct cgagcagcca tctgtctttg gagtagaagc gtaatctctg 240

ctcctcgtta ctgtaccgga agaggtagtt tgcctcgccg cccataatga acaggttctc 300

tttctggtgg cctgtgagca gcggggacgt ctggacggcg tcgatgaggc ccttgaggcg 360

ctcgtagtac ttgttcgcgt cgctgtagcc ggccgcggtg acgataccca catagaggtc 420

cttggccatt agtttgatga ggtggggcag gatgggcgac tcggcatcga aatttttgcc 480

gtcgtcgtac agtgtgatgt caccatcgaa tgtaatgagc tgcagcttgc gatctcggat 540

ggttttggaa tggaagaacc gcgacatctc caacagctgg gccgtgttga gaatgagccg 600

gacgtcgttg aacgaggggg ccacaagccg gcgtttgctg atggcgcggc gctcgtcctc 660

gatgtagaag gccttttcca gaggcagtct cgtgaagaag ctgccaacgc tcggaaccag 720

ctgcacgagc cgagacaatt cgggggtgcc ggctttggtc atttcaatgt tgtcgtcgat 780

gaggagttcg aggtcgtgga agatttccgc gtagcggcgt tttgcctcag agtttaccat 840

gaggtcgtcc actgcagaga tgccgttgct cttcaccgcg tacaggacga acggcgtggc 900

cagcaggccc ttgatccatt ctatgaggcc atctcgacgg tgttccttga gtgcgtactc 960

cactctgtag cgactggaca tctcgagact gggcttgctg tgctggatgc accaattaat 1020

tgttgccgca tgcatccttg caccgcaagt ttttaaaacc cactcgcttt agccgtcgcg 1080

taaaacttgt gaatctggca actgaggggg ttctgcagcc gcaaccgaac ttttcgcttc 1140

gaggacgcag ctggatggtg tcatgtgagg ctctgtttgc tggcgtagcc tacaacgtga 1200

ccttgcctaa ccggacggcg ctacccactg ctgtctgtgc ctgctaccag aaaatcacca 1260

gagcagcaga gggccgatgt ggcaactggt ggggtgtcgg acaggctgtt tctccacagt 1320

gcaaatgcgg gtgaaccggc cagaaagtaa attcttatgc taccgtgcag tgactccgac 1380

atccccagtt tttgccctac ttgatcacag atggggtcag cgctgccgct aagtgtaccc 1440

aaccgtcccc acacggtcca tctataaata ctgctgccag tgcacggtgg tgacatcaat 1500

ctaaagtaca aaaacaaagc tagccacgtg aagcttgaat tcgcggccgc cagctttcta 1560

gaacaaaaac tcatctcaga agaggatctg aatagcgccg tcgaccatca tcatcatcat 1620

cattgagttt gtagccttag acatgactgt tcctcagttc aagttgggca cttacgagaa 1680

gaccggtctt gctagattct aatcaagagg atgtcagaat gccatttgcc tgagagatgc 1740

aggcttcatt tttgatactt ttttatttgt aacctatata gtataggatt ttttttgtca 1800

ttttgtttct tctcgtacga gcttgctcct gatcagccta tctcgcagct gatgaatatc 1860

ttgtggtagg ggtttgggaa aatcattcga gtttgatgtt tttcttggta tttcccactc 1920

ctcttcagag tacagaagat taagtgagac cttcgtttgt gcggatctgt cgacgcggag 1980

aacgatctcc tcgagctgct cgcggatcag cttgtggccc ggtaatggaa ccaggccgac 2040

ggcacgctcc ttgcggacca cggtggctgg cgagcccagt ttgtgaacga ggtcgtttag 2100

aacgtcctgc gcaaagtcca gtgtcagatg aatgtcctcc tcggaccaat tcagcatgtt 2160

ctcgagcagc catctgtctt tggagtagaa gcgtaatctc tgctcctcgt tactgtaccg 2220

gaagaggtag tttgcctcgc cgcccataat gaacaggttc tctttctggt ggcctgtgag 2280

cagcggggac gtctggacgg cgtcgatgag gcccttgagg cgctcgtagt acttgttcgc 2340

gtcgctgtag ccggccgcgg tgacgatacc cacatagagg tccttggcca ttagtttgat 2400

gaggtggggc aggatgggcg actcggcatc gaaatttttg ccgtcgtcgt acagtgtgat 2460

gtcaccatcg aatgtaatga gctgcagctt gcgatctcgg atggttttgg aatggaagaa 2520

ccgcgacatc tccaacagct gggccgtgtt gagaatgagc cggacgtcgt tgaacgaggg 2580

ggccacaagc cggcgtttgc tgatggcgcg gcgctcgtcc tcgatgtaga aggccttttc 2640

cagaggcagt ctcgtgaaga agctgccaac gctcggaacc agctgcacga gccgagacaa 2700

ttcgggggtg ccggctttgg tcatttcaat gttgtcgtcg atgaggagtt cgaggtcgtg 2760

gaagatttcc gcgtagcggc gttttgcctc agagtttacc atgaggtcgt ccactgcaga 2820

gatgccgttg ctcttcaccg cgtacaggac gaacggcgtg gccagcaggc ccttgatcca 2880

ttctatgagg ccatctcgac ggtgttcctt gagtgcgtac tccactctgt agcgactgga 2940

catctcgaga ctgggcttgc tgtgctggat gcaccaatta attgttgccg catgcatcct 3000

tgcaccgcaa gtttttaaaa cccactcgct ttagccgtcg cgtaaaactt gtgaatctgg 3060

caactgaggg ggttctgcag ccgcaaccga acttttcgct tcgaggacgc agctggatgg 3120

tgtcatgtga ggctctgttt gctggcgtag cctacaacgt gaccttgcct aaccggacgg 3180

cgctacccac tgctgtctgt gcctgctacc agaaaatcac cagagcagca gagggccgat 3240

gtggcaactg gtggggtgtc ggacaggctg tttctccaca gtgcaaatgc gggtgaaccg 3300

gccagaaagt aaattcttat gctaccgtgc agtgactccg acatccccag tttttgccct 3360

acttgatcac agatggggtc agcgctgccg ctaagtgtac ccaaccgtcc ccacacggtc 3420

catctataaa tactgctgcc agtgcacggt ggtgacatca atctaaagta caaaaacaaa 3480

ttcgaaacgt gtacacgatc gatcatatgc ctgcaggcag ctttctagaa caaaaactca 3540

tctcagaaga ggatctgaat agcgccgtcg accatcatca tcatcatcat tgagtttgta 3600

gccttagaca tgactgttcc tcagttcaag ttgggcactt acgagaagac cggtcttgct 3660

agattctaat caagaggatg tcagaatgcc atttgcctga gagatgcagg cttcattttt 3720

gatacttttt tatttgtaac ctatatagta taggattttt tttgtcattt tgtttcttct 3780

cgtacgagct tgctcctgat cagcctatct cgcagctgat gaatatcttg tggtaggggt 3840

ttgggaaaat cattcgagtt tgatgttttt cttggtattt cccactcctc ttcagagtac 3900

agaagattaa gtgagacctt cgtttgtgcg gatcctcgat cacatgtgag caaaaggcca 3960

gcaaaaggcc aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata ggctccgccc 4020

ccctgacgag catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact 4080

ataaagatac caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct 4140

gccgcttacc ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc tttctcaatg 4200

ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca 4260

cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa 4320

cccggtaaga cacgacttat cgccactggc agcagccact ggtaacagga ttagcagagc 4380

gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg gctacactag 4440

aaggacagta tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg 4500

tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca 4560

gcagattacg cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct ttgatctttt ctacggggtc 4620

tgacgctcag tggaacgaaa actcacgtta agggattttg gtcatgagat cagatctccc 4680

acacaccata gcttcaaaat gtttctactc cttttttact cttccagatt ttctcggact 4740

ccgcgcatcg ccgtaccact tcaaaacacc caagcacagc atactaaatt ttccctcttt 4800

cttcctctag ggtgtcgtta attacccgta ctaaaggttt ggaaaagaaa aaagagaccg 4860

cctcgtttct ttttcttcgt cgaaaaaggc aataaaaatt tttatcacgt ttctttttct 4920

tgaaattttt ttttttagtt tttttctctt tcagtgacct ccattgatat ttaagttaat 4980

aaacggtctt caatttctca agtttcagtt tcatttttct tgttctatta caactttttt 5040

tacttcttgt tcattagaaa gaaagcatag caatctaatc taaggggcgg tgttgacaat 5100

taatcatcgg catagtatat cggcatagta taatacgaca aggtgaggaa ctaaacctta 5160

agatgagcca tattcaacgg gaaacgtctt gctcgaggcc gcgattaaat tccaacatgg 5220

atgctgattt atatgggtat aaatgggctc gcgataatgt cgggcaatca ggtgcgacaa 5280

tctatcgatt gtatgggaag cccgatgcgc cagagttgtt tctgaaacat ggcaaaggta 5340

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<210> 38

<211> 1541

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 38

cggacaaatt cgaaacgatg tggagaccat ctgactcgac cgtctacgtt cctccaccta 60

acccagtctc caaagtggtt gctactgatg cctacgtcaa gagaaccaac atcttctacc 120

acgcctcttc gtccagattg ctggcagttg gacatcctta ctattccatc aagaaagtta 180

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tggtttgggc ttgcacgggt ttggaagtgg gcagaggaca accactgggt gtcggagttt 360

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<210> 39

<211> 7750

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 39

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atttgtaacc tatatagtat aggatttttt ttgtcatttt gtttcttctc gtacgagctt 5280

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attcgagttt gatgtttttc ttggtatttc ccactcctct tcagagtaca gaagattaag 5400

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atcacaaaaa tcgacgctca agtcagaggt ggcgaaaccc gacaggacta taaagatacc 5580

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gatacctgtc cgcctttctc ccttcgggaa gcgtggcgct ttctcaatgc tcacgctgta 5700

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<210> 40

<211> 1532

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 40

aatcgctagc atgtggagac catctgactc gactgtctac gttcctccac ctaacccagt 60

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 41

ggatctgtcg acgcggagaa cgatctcctc gagctgctcg cggatcagct tgtggcccgg 60

taatggaacc aggccgacgg cacgctcctt gcggaccacg gtggctggcg agcccagttt 120

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ctcgtagtac ttgttcgcgt cgctgtagcc ggccgcggtg acgataccca catagaggtc 420

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caaagactcg tttgggcctg cactggtctt gaggttggca gaggacagcc actcggagtc 1860

ggcgtttctg gtcatccttt cctgaacaag tacgacgatg ttgagaactc tggttccgga 1920

ggcaatcctg gacaggacaa cagagtcaat gttggcatgg actacaagca aactcagctc 1980

tgtatggtgg gatgcgcacc tccactgggt gagcattggg gaaaaggcaa gcagtgcacc 2040

aacactccag ttcaggcagg tgactgccct ccattggagc tgattacctc ggtcatccag 2100

gacggtgata tggttgacac cggattcggt gccatgaact tcgctgacct gcagaccaac 2160

aagtccgatg tgccaatcga catctgcgga acgacctgta aataccctga ctacttgcag 2220

atggcagccg atccatacgg cgacagactc ttcttctttc tgagaaagga gcagatgttt 2280

gctagacact ttttcaacag agccggagag gtcggtgagc ctgttccaga caccctgatc 2340

attaagggct cgggaaacag aacttctgtc ggctcctcga tctacgtgaa caccccttcc 2400

ggttcgttgg tgtcgtccga ggctcaactg ttcaacaagc catactggct ccagaaagcc 2460

caaggtcaca acaatggcat ctgctggggt aaccagctgt tcgttactgt cgtggacacc 2520

acgagatcga ccaacatgac tctgtgtgcc tccgttacca catcttcgac ttacaccaac 2580

tccgactata aggagtacat gagacacgtt gaagagtacg acttgcaatt catctttcag 2640

ctctgctcga ttaccctgtc cgcagaagtc atggcctaca tccacactat gaatccatcg 2700

gtgcttgagg actggaactt tggcttgtcc ccacctccaa acggaactct ggaagacacc 2760

tatagatacg tgcagtcgca agccatcacg tgccagaagc caacccctga gaaggaaaag 2820

ccagatcctt acaagaacct gtccttctgg gaggtcaatc tcaaggagaa gttctcgtcc 2880

gaactggacc agtacccatt gggtagaaag ttcctgctcc agtctggata ccgtggtaga 2940

tcgtccatca gaaccggagt gaagagacca gcagtttcca aggcttctgc cgcacctaag 3000

cgtaaaagag ccaagaccaa gagataatag gcggccgcca gctttctaga acaaaaactc 3060

atctcagaag aggatctgaa tagcgccgtc gaccatcatc atcatcatca ttgagtttgt 3120

agccttagac atgactgttc ctcagttcaa gttgggcact tacgagaaga ccggtcttgc 3180

tagattctaa tcaagaggat gtcagaatgc catttgcctg agagatgcag gcttcatttt 3240

tgatactttt ttatttgtaa cctatatagt ataggatttt ttttgtcatt ttgtttcttc 3300

tcgtacgagc ttgctcctga tcagcctatc tcgcagctga tgaatatctt gtggtagggg 3360

tttgggaaaa tcattcgagt ttgatgtttt tcttggtatt tcccactcct cttcagagta 3420

cagaagatta agtgagacct tcgtttgtgc ggatctgtcg acgcggagaa cgatctcctc 3480

gagctgctcg cggatcagct tgtggcccgg taatggaacc aggccgacgg cacgctcctt 3540

gcggaccacg gtggctggcg agcccagttt gtgaacgagg tcgtttagaa cgtcctgcgc 3600

aaagtccagt gtcagatgaa tgtcctcctc ggaccaattc agcatgttct cgagcagcca 3660

tctgtctttg gagtagaagc gtaatctctg ctcctcgtta ctgtaccgga agaggtagtt 3720

tgcctcgccg cccataatga acaggttctc tttctggtgg cctgtgagca gcggggacgt 3780

ctggacggcg tcgatgaggc ccttgaggcg ctcgtagtac ttgttcgcgt cgctgtagcc 3840

ggccgcggtg acgataccca catagaggtc cttggccatt agtttgatga ggtggggcag 3900

gatgggcgac tcggcatcga aatttttgcc gtcgtcgtac agtgtgatgt caccatcgaa 3960

tgtaatgagc tgcagcttgc gatctcggat ggttttggaa tggaagaacc gcgacatctc 4020

caacagctgg gccgtgttga gaatgagccg gacgtcgttg aacgaggggg ccacaagccg 4080

gcgtttgctg atggcgcggc gctcgtcctc gatgtagaag gccttttcca gaggcagtct 4140

cgtgaagaag ctgccaacgc tcggaaccag ctgcacgagc cgagacaatt cgggggtgcc 4200

ggctttggtc atttcaatgt tgtcgtcgat gaggagttcg aggtcgtgga agatttccgc 4260

gtagcggcgt tttgcctcag agtttaccat gaggtcgtcc actgcagaga tgccgttgct 4320

cttcaccgcg tacaggacga acggcgtggc cagcaggccc ttgatccatt ctatgaggcc 4380

atctcgacgg tgttccttga gtgcgtactc cactctgtag cgactggaca tctcgagact 4440

gggcttgctg tgctggatgc accaattaat tgttgccgca tgcatccttg caccgcaagt 4500

ttttaaaacc cactcgcttt agccgtcgcg taaaacttgt gaatctggca actgaggggg 4560

ttctgcagcc gcaaccgaac ttttcgcttc gaggacgcag ctggatggtg tcatgtgagg 4620

ctctgtttgc tggcgtagcc tacaacgtga ccttgcctaa ccggacggcg ctacccactg 4680

ctgtctgtgc ctgctaccag aaaatcacca gagcagcaga gggccgatgt ggcaactggt 4740

ggggtgtcgg acaggctgtt tctccacagt gcaaatgcgg gtgaaccggc cagaaagtaa 4800

attcttatgc taccgtgcag tgactccgac atccccagtt tttgccctac ttgatcacag 4860

atggggtcag cgctgccgct aagtgtaccc aaccgtcccc acacggtcca tctataaata 4920

ctgctgccag tgcacggtgg tgacatcaat ctaaagtaca aaaacaaatt cgaaacgatg 4980

tggagaccat ctgactcgac cgtctacgtt cctccaccta acccagtctc caaagtggtt 5040

gctactgatg cctacgtcaa gagaaccaac atcttctacc acgcctcttc gtccagattg 5100

ctggcagttg gacatcctta ctattccatc aagaaagtta acaagaccgt ggtccctaag 5160

gtttcgggct atcagtacag agtgttcaag gtcgttctgc cagaccctaa caagtttgcc 5220

ttgccagatt cctcgctgtt cgaccctacc actcaaagac tggtttgggc ttgcacgggt 5280

ttggaagtgg gcagaggaca accactgggt gtcggagttt ccggccatcc attgctgaac 5340

aagtacgacg atgttgagaa ctcgggtgga tacggtggca atccaggaca agacaacaga 5400

gtgaatgtcg gcatggacta caagcaaacc cagctgtgca tggttggttg tgcaccacct 5460

ctgggtgaac attggggaaa gggcactcag tgctccaaca cctctgttca gaatggtgac 5520

tgtcctccac tggagctgat cacctcggtt attcaggatg gagacatggt ggacactggc 5580

ttcggtgcaa tgaactttgc cgacttgcag accaacaagt ccgatgttcc attggacatt 5640

tgcggcactg tgtgcaaata tcctgactac ctgcagatgg ctgcagatcc atacggtgac 5700

agactcttct tctacctgag aaaggagcag atgttcgcca gacacttctt taacagagct 5760

ggcaccgttg gtgagcctgt tccagatgac ctgttggtga agggtggaaa caatagatcc 5820

tctgttgcct cgtccatcta cgtccacacc ccatcgggct ctctggtgtc ctcggaggcc 5880

caactgttca acaagcctta ctggctccag aaggcccaag gacacaacaa tggcatctgc 5940

tggggaaacc acctgttcgt caccgttgtg gacacgacta gatccaccaa catgactttg 6000

tgtgcctctg tttccaagtc ggctacctac acgaactcgg actataagga gtacatgaga 6060

catgttgaag agttcgacct gcagtttatc ttccagctct gctccattac cttgtcggca 6120

gaagtgatgg cctacatcca cacgatgaac ccatccgtct tggaagactg gaacttcggt 6180

ctgtctccac ctccaaatgg caccctggaa gacacgtaca gatatgtgca gtcgcaagcc 6240

atcacctgtc agaaaccaac tcctgaaaag gagaaacagg acccatacaa ggatatgtcg 6300

ttctgggagg tcaacctgaa ggagaagttc tcttcggaac tggaccagtt cccattggga 6360

agaaagttcc tgctccagtc tggttataga ggaagaacct ccgcaagaac tggcatcaag 6420

agacctgccg tgtcgaagcc atccaccgct cctaagagaa agagaacgaa gaccaaaaag 6480

taatagcctg caggcagctt tctagaacaa aaactcatct cagaagagga tctgaatagc 6540

gccgtcgacc atcatcatca tcatcattga gtttgtagcc ttagacatga ctgttcctca 6600

gttcaagttg ggcacttacg agaagaccgg tcttgctaga ttctaatcaa gaggatgtca 6660

gaatgccatt tgcctgagag atgcaggctt catttttgat acttttttat ttgtaaccta 6720

tatagtatag gatttttttt gtcattttgt ttcttctcgt acgagcttgc tcctgatcag 6780

cctatctcgc agctgatgaa tatcttgtgg taggggtttg ggaaaatcat tcgagtttga 6840

tgtttttctt ggtatttccc actcctcttc agagtacaga agattaagtg agaccttcgt 6900

ttgtgcggat cctcgatcac atgtgagcaa aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa 6960

aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc 7020

gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga caggactata aagataccag gcgtttcccc 7080

ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg 7140

cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt ctcaatgctc acgctgtagg tatctcagtt 7200

cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc 7260

gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc 7320

cactggcagc agccactggt aacaggatta gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag 7380

agttcttgaa gtggtggcct aactacggct acactagaag gacagtattt ggtatctgcg 7440

ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa 7500

ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag 7560

gatctcaaga agatcctttg atcttttcta cggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact 7620

cacgttaagg gattttggtc atgagatcag atctcccaca caccatagct tcaaaatgtt 7680

tctactcctt ttttactctt ccagattttc tcggactccg cgcatcgccg taccacttca 7740

aaacacccaa gcacagcata ctaaattttc cctctttctt cctctagggt gtcgttaatt 7800

acccgtacta aaggtttgga aaagaaaaaa gagaccgcct cgtttctttt tcttcgtcga 7860

aaaaggcaat aaaaattttt atcacgtttc tttttcttga aatttttttt tttagttttt 7920

ttctctttca gtgacctcca ttgatattta agttaataaa cggtcttcaa tttctcaagt 7980

ttcagtttca tttttcttgt tctattacaa ctttttttac ttcttgttca ttagaaagaa 8040

agcatagcaa tctaatctaa ggggcggtgt tgacaattaa tcatcggcat agtatatcgg 8100

catagtataa tacgacaagg tgaggaacta aaccttaaga tgagccatat tcaacgggaa 8160

acgtcttgct cgaggccgcg attaaattcc aacatggatg ctgatttata tgggtataaa 8220

tgggctcgcg ataatgtcgg gcaatcaggt gcgacaatct atcgattgta tgggaagccc 8280

gatgcgccag agttgtttct gaaacatggc aaaggtagcg ttgccaatga tgttacagat 8340

gagatggtca gactaaactg gctgacggaa tttatgcctc ttccgaccat caagcatttt 8400

atccgtactc ctgatgatgc atggttactc accactgcga tccccgggaa aacagcattc 8460

caggtattag aagaatatcc tgattcaggt gaaaatattg ttgatgcgct ggcagtgttc 8520

ctgcgccggt tgcattcgat tcctgtttgt aattgtcctt ttaacagcga tcgcgtattt 8580

cgtctcgctc aggcgcaatc acgaatgaat aacggtttgg ttgatgcgag tgattttgat 8640

gacgagcgta atggctggcc tgttgaacaa gtctggaaag aaatgcataa gcttttgcca 8700

ttctcaccgg attcagtcgt cactcatggt gatttctcac ttgataacct tatttttgac 8760

gaggggaaat taataggttg tattgatgtt ggacgagtcg gaatcgcaga ccgataccag 8820

gatcttgcca tcctatggaa ctgcctcggt gagttttctc cttcattaca gaaacggctt 8880

tttcaaaaat atggtattga taatcctgat atgaataaat tgcagtttca tttgatgctc 8940

gatgagtttt tctaatcaga attggttaat tggttgtaac actggcagag cattacgctg 9000

acttgacggg acggcggctt tgttgaataa atcgaacttt tgctgagttg aaggatcaga 9060

tcacgcatct tcccgacaac gcagaccgtt ccgtggcaaa gcaaaagttc aaaatcacca 9120

actggtccac ctacaacaaa gctctcatca accgtggctc cctcactttc tggctggatg 9180

atggggcgat tcaggcctgg tatgagtcag caacaccttc ttcacgaggc agacctca 9238

<210> 42

<211> 1551

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 42

cggacaaatt cgaaacgatg tctctttggt tgccatccga ggctactgtt tacttgccac 60

ctgtcccagt ttctaaggtc gtgtcaactg atgaatacgt tgctagaacc aacatctatt 120

accacgctgg aacttctaga ttgcttgctg ttggtcatcc atacttccct atcaagaaac 180

ctaacaataa caagatcctt gttccaaagg tctctggatt gcagtacaga gttttcagaa 240

tccacttgcc tgacccaaac aagttcggtt ttcctgacac ctccttctac aacccagata 300

ctcaaagatt ggtgtgggcc tgtgttggtg tcgaggttgg acgtggtcaa ccattgggag 360

ttggtatttc tggacatcct ttgcttaaca agttggatga cactgaaaat gcttctgcct 420

acgcagccaa cgctggtgtt gacaacagag agtgtatctc tatggattac aaacagaccc 480

aattgtgtct tattggttgc aagccaccta ttggtgaaca ctggggtaag ggatctccat 540

gtaccaacgt tgctgtcaat ccaggtgatt gtcctccatt ggagcttatc aacactgtta 600

ttcaagatgg tgacatggtt gatactggat ttggtgctat ggacttcact accttgcaag 660

ctaacaagtc cgaggttcca ttggacattt gtacttctat ctgcaagtat ccagactaca 720

ttaagatggt ctctgaacca tacggtgact ccttgttttt ctaccttcgt agagagcaaa 780

tgtttgttag acacttgttc aacagagctg gtgccgttgg tgagaatgtc ccagacgatt 840

tgtacatcaa gggatctggt tccactgcaa acttggcctc ttccaactac ttcccaactc 900

cttcaggttc tatggttacc tccgatgctc aaatcttcaa caagccttac tggttgcaaa 960

gagcacaggg tcacaacaat ggaatttgtt ggggtaacca acttttcgtt actgtcgttg 1020

ataccacaag atccaccaac atgtccttgt gtgctgccat ttctacttca gaaaccacat 1080

acaagaatac taacttcaag gagtacctta gacatggtga ggaatacgac ttgcagttca 1140

tctttcaatt gtgcaagatt accttgactg ctgacgttat gacctacatc cactctatga 1200

actccactat ccttgaagat tggaacttcg gattgcaacc acctccaggt ggaaccttgg 1260

aagatactta cagatttgtc acatcccaag ccattgcttg tcagaagcac actcctccag 1320

ctcctaagga agatccactt aagaaataca ccttctggga agtcaacttg aaagagaagt 1380

tctctgctga ccttgatcag tttcctttgg gtagaaagtt cttacttcaa gctggattga 1440

aggccaaacc aaagttcacc ttgggtaaaa gaaaggctac tccaaccaca tcatctactt 1500

ccacaaccgc caaacgtaag aagagaaaac tgtaatagcc tgcaggaagc a 1551

<210> 43

<211> 7347

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 43

agatctgtcg acgcggagaa cgatctcctc gagctgctcg cggatcagct tgtggcccgg 60

taatggaacc aggccgacgg cacgctcctt gcggaccacg gtggctggcg agcccagttt 120

gtgaacgagg tcgtttagaa cgtcctgcgc aaagtccagt gtcagatgaa tgtcctcctc 180

ggaccaattc agcatgttct cgagcagcca tctgtctttg gagtagaagc gtaatctctg 240

ctcctcgtta ctgtaccgga agaggtagtt tgcctcgccg cccataatga acaggttctc 300

tttctggtgg cctgtgagca gcggggacgt ctggacggcg tcgatgaggc ccttgaggcg 360

ctcgtagtac ttgttcgcgt cgctgtagcc ggccgcggtg acgataccca catagaggtc 420

cttggccatt agtttgatga ggtggggcag gatgggcgac tcggcatcga aatttttgcc 480

gtcgtcgtac agtgtgatgt caccatcgaa tgtaatgagc tgcagcttgc gatctcggat 540

ggttttggaa tggaagaacc gcgacatctc caacagctgg gccgtgttga gaatgagccg 600

gacgtcgttg aacgaggggg ccacaagccg gcgtttgctg atggcgcggc gctcgtcctc 660

gatgtagaag gccttttcca gaggcagtct cgtgaagaag ctgccaacgc tcggaaccag 720

ctgcacgagc cgagacaatt cgggggtgcc ggctttggtc atttcaatgt tgtcgtcgat 780

gaggagttcg aggtcgtgga agatttccgc gtagcggcgt tttgcctcag agtttaccat 840

gaggtcgtcc actgcagaga tgccgttgct cttcaccgcg tacaggacga acggcgtggc 900

cagcaggccc ttgatccatt ctatgaggcc atctcgacgg tgttccttga gtgcgtactc 960

cactctgtag cgactggaca tctcgagact gggcttgctg tgctggatgc accaattaat 1020

tgttgccgca tgcatccttg caccgcaagt ttttaaaacc cactcgcttt agccgtcgcg 1080

taaaacttgt gaatctggca actgaggggg ttctgcagcc gcaaccgaac ttttcgcttc 1140

gaggacgcag ctggatggtg tcatgtgagg ctctgtttgc tggcgtagcc tacaacgtga 1200

ccttgcctaa ccggacggcg ctacccactg ctgtctgtgc ctgctaccag aaaatcacca 1260

gagcagcaga gggccgatgt ggcaactggt ggggtgtcgg acaggctgtt tctccacagt 1320

gcaaatgcgg gtgaaccggc cagaaagtaa attcttatgc taccgtgcag tgactccgac 1380

atccccagtt tttgccctac ttgatcacag atggggtcag cgctgccgct aagtgtaccc 1440

aaccgtcccc acacggtcca tctataaata ctgctgccag tgcacggtgg tgacatcaat 1500

ctaaagtaca aaaacaaagc tagccacgtg aagcttgaat tcgcggccgc cagctttcta 1560

gaacaaaaac tcatctcaga agaggatctg aatagcgccg tcgaccatca tcatcatcat 1620

cattgagttt gtagccttag acatgactgt tcctcagttc aagttgggca cttacgagaa 1680

gaccggtctt gctagattct aatcaagagg atgtcagaat gccatttgcc tgagagatgc 1740

aggcttcatt tttgatactt ttttatttgt aacctatata gtataggatt ttttttgtca 1800

ttttgtttct tctcgtacga gcttgctcct gatcagccta tctcgcagct gatgaatatc 1860

ttgtggtagg ggtttgggaa aatcattcga gtttgatgtt tttcttggta tttcccactc 1920

ctcttcagag tacagaagat taagtgagac cttcgtttgt gcggatctgt cgacgcggag 1980

aacgatctcc tcgagctgct cgcggatcag cttgtggccc ggtaatggaa ccaggccgac 2040

ggcacgctcc ttgcggacca cggtggctgg cgagcccagt ttgtgaacga ggtcgtttag 2100

aacgtcctgc gcaaagtcca gtgtcagatg aatgtcctcc tcggaccaat tcagcatgtt 2160

ctcgagcagc catctgtctt tggagtagaa gcgtaatctc tgctcctcgt tactgtaccg 2220

gaagaggtag tttgcctcgc cgcccataat gaacaggttc tctttctggt ggcctgtgag 2280

cagcggggac gtctggacgg cgtcgatgag gcccttgagg cgctcgtagt acttgttcgc 2340

gtcgctgtag ccggccgcgg tgacgatacc cacatagagg tccttggcca ttagtttgat 2400

gaggtggggc aggatgggcg actcggcatc gaaatttttg ccgtcgtcgt acagtgtgat 2460

gtcaccatcg aatgtaatga gctgcagctt gcgatctcgg atggttttgg aatggaagaa 2520

ccgcgacatc tccaacagct gggccgtgtt gagaatgagc cggacgtcgt tgaacgaggg 2580

ggccacaagc cggcgtttgc tgatggcgcg gcgctcgtcc tcgatgtaga aggccttttc 2640

cagaggcagt ctcgtgaaga agctgccaac gctcggaacc agctgcacga gccgagacaa 2700

ttcgggggtg ccggctttgg tcatttcaat gttgtcgtcg atgaggagtt cgaggtcgtg 2760

gaagatttcc gcgtagcggc gttttgcctc agagtttacc atgaggtcgt ccactgcaga 2820

gatgccgttg ctcttcaccg cgtacaggac gaacggcgtg gccagcaggc ccttgatcca 2880

ttctatgagg ccatctcgac ggtgttcctt gagtgcgtac tccactctgt agcgactgga 2940

catctcgaga ctgggcttgc tgtgctggat gcaccaatta attgttgccg catgcatcct 3000

tgcaccgcaa gtttttaaaa cccactcgct ttagccgtcg cgtaaaactt gtgaatctgg 3060

caactgaggg ggttctgcag ccgcaaccga acttttcgct tcgaggacgc agctggatgg 3120

tgtcatgtga ggctctgttt gctggcgtag cctacaacgt gaccttgcct aaccggacgg 3180

cgctacccac tgctgtctgt gcctgctacc agaaaatcac cagagcagca gagggccgat 3240

gtggcaactg gtggggtgtc ggacaggctg tttctccaca gtgcaaatgc gggtgaaccg 3300

gccagaaagt aaattcttat gctaccgtgc agtgactccg acatccccag tttttgccct 3360

acttgatcac agatggggtc agcgctgccg ctaagtgtac ccaaccgtcc ccacacggtc 3420

catctataaa tactgctgcc agtgcacggt ggtgacatca atctaaagta caaaaacaaa 3480

ttcgaaacga tgtctctttg gttgccatcc gaggctactg tttacttgcc acctgtccca 3540

gtttctaagg tcgtgtcaac tgatgaatac gttgctagaa ccaacatcta ttaccacgct 3600

ggaacttcta gattgcttgc tgttggtcat ccatacttcc ctatcaagaa acctaacaat 3660

aacaagatcc ttgttccaaa ggtctctgga ttgcagtaca gagttttcag aatccacttg 3720

cctgacccaa acaagttcgg ttttcctgac acctccttct acaacccaga tactcaaaga 3780

ttggtgtggg cctgtgttgg tgtcgaggtt ggacgtggtc aaccattggg agttggtatt 3840

tctggacatc ctttgcttaa caagttggat gacactgaaa atgcttctgc ctacgcagcc 3900

aacgctggtg ttgacaacag agagtgtatc tctatggatt acaaacagac ccaattgtgt 3960

cttattggtt gcaagccacc tattggtgaa cactggggta agggatctcc atgtaccaac 4020

gttgctgtca atccaggtga ttgtcctcca ttggagctta tcaacactgt tattcaagat 4080

ggtgacatgg ttgatactgg atttggtgct atggacttca ctaccttgca agctaacaag 4140

tccgaggttc cattggacat ttgtacttct atctgcaagt atccagacta cattaagatg 4200

gtctctgaac catacggtga ctccttgttt ttctaccttc gtagagagca aatgtttgtt 4260

agacacttgt tcaacagagc tggtgccgtt ggtgagaatg tcccagacga tttgtacatc 4320

aagggatctg gttccactgc aaacttggcc tcttccaact acttcccaac tccttcaggt 4380

tctatggtta cctccgatgc tcaaatcttc aacaagcctt actggttgca aagagcacag 4440

ggtcacaaca atggaatttg ttggggtaac caacttttcg ttactgtcgt tgataccaca 4500

agatccacca acatgtcctt gtgtgctgcc atttctactt cagaaaccac atacaagaat 4560

actaacttca aggagtacct tagacatggt gaggaatacg acttgcagtt catctttcaa 4620

ttgtgcaaga ttaccttgac tgctgacgtt atgacctaca tccactctat gaactccact 4680

atccttgaag attggaactt cggattgcaa ccacctccag gtggaacctt ggaagatact 4740

tacagatttg tcacatccca agccattgct tgtcagaagc acactcctcc agctcctaag 4800

gaagatccac ttaagaaata caccttctgg gaagtcaact tgaaagagaa gttctctgct 4860

gaccttgatc agtttccttt gggtagaaag ttcttacttc aagctggatt gaaggccaaa 4920

ccaaagttca ccttgggtaa aagaaaggct actccaacca catcatctac ttccacaacc 4980

gccaaacgta agaagagaaa actgtaatag cctgcaggca gctttctaga acaaaaactc 5040

atctcagaag aggatctgaa tagcgccgtc gaccatcatc atcatcatca ttgagtttgt 5100

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tagattctaa tcaagaggat gtcagaatgc catttgcctg agagatgcag gcttcatttt 5220

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<210> 44

<211> 1552

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 44

attcgctagc atggctctgt ggagaccatc tgacaacacc gtctacttgc cacctccatc 60

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<210> 45

<211> 8855

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 45

agatctgtcg acgcggagaa cgatctcctc gagctgctcg cggatcagct tgtggcccgg 60

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ccggacggcg ctacccactg ctgtctgtgc ctgctaccag aaaatcacca gagcagcaga 4740

gggccgatgt ggcaactggt ggggtgtcgg acaggctgtt tctccacagt gcaaatgcgg 4800

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ctgtcccagt ttctaaggtc gtgtcaactg atgaatacgt tgctagaacc aacatctatt 5100

accacgctgg aacttctaga ttgcttgctg ttggtcatcc atacttccct atcaagaaac 5160

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tccacttgcc tgacccaaac aagttcggtt ttcctgacac ctccttctac aacccagata 5280

ctcaaagatt ggtgtgggcc tgtgttggtg tcgaggttgg acgtggtcaa ccattgggag 5340

ttggtatttc tggacatcct ttgcttaaca agttggatga cactgaaaat gcttctgcct 5400

acgcagccaa cgctggtgtt gacaacagag agtgtatctc tatggattac aaacagaccc 5460

aattgtgtct tattggttgc aagccaccta ttggtgaaca ctggggtaag ggatctccat 5520

gtaccaacgt tgctgtcaat ccaggtgatt gtcctccatt ggagcttatc aacactgtta 5580

ttcaagatgg tgacatggtt gatactggat ttggtgctat ggacttcact accttgcaag 5640

ctaacaagtc cgaggttcca ttggacattt gtacttctat ctgcaagtat ccagactaca 5700

ttaagatggt ctctgaacca tacggtgact ccttgttttt ctaccttcgt agagagcaaa 5760

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cttcaggttc tatggttacc tccgatgctc aaatcttcaa caagccttac tggttgcaaa 5940

gagcacaggg tcacaacaat ggaatttgtt ggggtaacca acttttcgtt actgtcgttg 6000

ataccacaag atccaccaac atgtccttgt gtgctgccat ttctacttca gaaaccacat 6060

acaagaatac taacttcaag gagtacctta gacatggtga ggaatacgac ttgcagttca 6120

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ctcctaagga agatccactt aagaaataca ccttctggga agtcaacttg aaagagaagt 6360

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gatatcatgt aattagttat gtcacgctta cattcacgcc ctccccccac atccgctcta 7920

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ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag 8460

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gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca ctagaaggac agtatttggt 8640

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gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg agatc 8855