一种快速评价体外拮抗幽门螺杆菌活性的方法

摘要

本发明涉及一种快速评价体外拮抗幽门螺杆菌活性的方法，属于微生物检测技术领域。本发明所述方法包括以下步骤：取羊血琼脂培养基平板，在所述羊血琼脂培养基平板上涂布幽门螺杆菌的菌悬液，放置牛津杯，在牛津杯中加入待测样品溶液，培养3～5d，测量抑菌圈直径；配制不同浓度的待测样品溶液，分别加入96孔板中，每个孔中趁热加入羊血琼脂培养基，混合，待羊血琼脂培养基凝固后，每孔加入幽门螺杆菌的菌悬液，培养3～5d，确定待测样品溶液对幽门螺杆菌的的最小抑制浓度。本发明所述方法具有简单高效，判定时间短，观察结果直观等特点，符合幽门螺杆菌体外拮抗实验方法的要求，适用于多样品检测。

说明书

技术领域

本发明涉及微生物检测技术领域，具体涉及一种快速评价体外拮抗幽门螺杆菌活性的方法。

背景技术

幽门螺杆菌(Helicobacterpylori，H.pylori)由Warren和Marshall于1983年成功从胃黏膜组织中分离。现已证实H.pylori与慢性胃炎、消化性溃疡、胃黏膜相关淋巴样组织(MALT)淋巴瘤以及胃癌密切相关。1994年，世界癌症研究机构将其列为I类致癌因子。目前临床上普遍采用三联或四联抗生素疗法治疗H.pylori感染。由于该疗法具有副作用大和易产耐药性等缺点，探求抗生素替代疗法是目前国际国内研究的热点。在寻求新的抗H.pylori药物的过程中，体外拮抗作用是筛选拮抗H.pylori药物的首要步骤，显得尤为重要。该方法的优劣，直接涉及到从大量候选前体药物或天然产物中筛选出具有拮抗H.pylori活性候选药物的效率。

幽门螺杆菌是一种专属微需氧菌，对体外生长条件要求苛刻，需在培养基中加入10％左右的羊血，且在平板表面生长。常规的针对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌等需氧菌的体外抑菌方法有一定局限性，不适用于幽门螺杆菌的体外抑菌实验。目前，用于体外拮抗幽门螺杆菌的方法主要有纸片法、活菌计数法、打孔扩散法和牛津杯琼脂扩散法；但是这些方法都有一定的缺点，药敏纸片法所使用的药敏纸片所能装载的样品量较少，且活性物质容易吸附在纸片上不易扩散至培养基中，致使纸片周围的抑菌圈非常小，不容易判定；活菌计数法耗时长，所需平板数量大，而且各个重复实验结果菌落数差异相对较大，不利于判定；打孔扩散法的缺点是样品溶液从孔中流走，无法检出预期的抑菌活性；牛津杯琼脂扩散法采用双层平板原理，即下层是基础培养基，而上层指示菌培养基需混合一定数量的幽门螺杆菌菌液，上层培养基凝固后，放置无菌牛津杯，倒入样品液，培养后测定；在制备上层培养基时，要控制上层培养基的厚度、幽门螺杆菌分散均匀度以及菌的存活率，所以此法实验条件严格，不适合抑菌活性的快速评价。目前缺少一种快速的评价体外拮抗幽门螺杆菌活性的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种快速评价体外拮抗幽门螺杆菌活性的方法。本发明所述方法具有简单高效，判定时间短，观察结果直观等特点，符合幽门螺杆菌体外拮抗实验方法的要求，适用于多样品检测。

本发明提供了一种快速评价体外拮抗幽门螺杆菌活性的方法，包括以下步骤：

取羊血琼脂培养基平板，在所述羊血琼脂培养基平板上涂布幽门螺杆菌的菌悬液，放置牛津杯，在牛津杯中加入待测样品溶液，培养3～5d，测量抑菌圈直径；

配制不同浓度的待测样品溶液，分别加入96孔板中，每个孔中趁热加入羊血琼脂培养基，混合，待羊血琼脂培养基凝固后，每孔加入幽门螺杆菌的菌悬液，培养3～5d，确定待测样品溶液对幽门螺杆菌的的最小抑制浓度。

优选的是，所述羊血琼脂培养基的制备用原料包括以下重量份的组分：脑心浸粉8～10份，哥伦比亚琼脂20～25份，水700～850份和去纤维羊血30～40份。

优选的是，所述羊血琼脂培养基的制备方法包括：将脑心浸粉、哥伦比亚琼脂和水混合，高压灭菌后降温至45～50℃后加入去纤维羊血。

优选的是，所述平板中羊血琼脂培养基的厚度为4～8mm。

优选的是，所述幽门螺杆菌的菌悬液的浓度为1×10

优选的是，当所述平板的直径为9cm时，每个平板加入80～120μL的幽门螺杆菌的菌悬液进行涂布。

优选的是，所述牛津杯深入所述羊血琼脂培养基1～2mm。

优选的是，每个牛津杯中加入50～100μL待测样品溶液。

优选的是，96孔板中，所述待测样品溶液和羊血琼脂培养基的体积比为1：(2～5)。

优选的是，96孔板中，所述待测样品溶液和所述幽门螺杆菌的菌悬液的体积比为(10～20):1。

本发明提供了一种快速评价体外拮抗幽门螺杆菌活性的方法。本发明所述方法具有简单高效，判定时间短，观察结果直观等特点，符合幽门螺杆菌体外拮抗实验方法的要求，适用于多样品检测。此外，本发明不仅可简化筛选拮抗幽门螺杆菌菌株的操作步骤，还可在分离纯化拮抗幽门螺杆菌活性物质的过程中，为活性检测提供了快速、有效、实用的检测方法；并且该方法还能为后续开发治疗幽门螺杆菌感染药物打下扎实的前期基础。

附图说明

图1为本发明提供的甘草2和甘草5拮抗幽门螺杆菌ATCC43504的牛津杯实验。

具体实施方式

本发明提供了一种快速评价体外拮抗幽门螺杆菌活性的方法，包括以下步骤：

取羊血琼脂培养基平板，在所述羊血琼脂培养基平板上涂布幽门螺杆菌的菌悬液，放置牛津杯，在牛津杯中加入待测样品溶液，培养3～5d，测量抑菌圈直径；

配制不同浓度的待测样品溶液，分别加入96孔板中，每个孔中趁热加入羊血琼脂培养基，混合，待羊血琼脂培养基凝固后，每孔加入幽门螺杆菌的菌悬液，培养3～5d，确定待测样品溶液对幽门螺杆菌的的最小抑制浓度。

本发明直接在基础培养基上涂布菌液，然后放置牛津杯，倒入样品液，培养后测定抑菌圈直径；同时利用改进的96孔板法测定最小抑菌浓度。该法操作简单，快速，测定结果准确，不仅能为筛选拮抗幽门螺杆菌的活性物质提供简单有效的操作方法.还能为后续开发治疗幽门螺杆菌感染药物打下扎实的前期基础。

本发明对所述幽门螺杆菌的来源没有特殊限定，选取常规现有市售幽门螺杆菌即可，在本发明具体实施例中，使用的幽门螺杆菌为广东省微生物菌种保藏中心保藏的幽门螺杆菌(Helicobacterpylori)ATCC43504菌株和幽门螺杆菌(Helicobacterpylori)悉尼SS1菌株。本发明对所述幽门螺杆菌的培养和传代方法没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的常规培养和传代方法即可。

本发明取羊血琼脂培养基平板，在所述羊血琼脂培养基平板上涂布幽门螺杆菌的菌悬液，放置牛津杯，在牛津杯中加入待测样品溶液，培养3～5d，测量抑菌圈直径。在本发明中，所述培养的条件优选为37℃，10％二氧化碳，5％氧气。在本发明中，所述羊血琼脂培养基的制备用原料包括以下重量份的组分：脑心浸粉8～10份，哥伦比亚琼脂20～25份，水700～850份和去纤维羊血30～40份。在本发明中，所述羊血琼脂培养基的制备方法包括：将脑心浸粉、哥伦比亚琼脂和水混合，高压灭菌后降温至45～50℃后加入去纤维羊血。在本发明中，所述平板中羊血琼脂培养基的厚度优选为4～8mm。在本发明中，所述幽门螺杆菌的菌悬液的浓度优选为1×10

本发明配制不同浓度的待测样品溶液，分别加入96孔板中，每个孔中趁热加入羊血琼脂培养基，混合，待羊血琼脂培养基凝固后，每孔加入幽门螺杆菌的菌悬液，培养3～5d，确定待测样品溶液对幽门螺杆菌的的最小抑制浓度。在本发明中，所述培养的条件优选为37℃，10％二氧化碳，5％氧气。本发明优选按照待测样品溶液浓度由小到达依次将待测样品溶液添加到96孔板中，每个样品优选设置3组平行。在本发明中，96孔板中，所述待测样品溶液和羊血琼脂培养基的体积比优选为1：(2～5)，更优选为1:2。在本发明中，所述幽门螺杆菌的菌悬液的浓度优选为1×10

在本发明中，上述操作优选在无菌操作条件下进行，包括待测样品溶液的配制过程和96孔板的加液过程等。避免杂菌对本发明方法结果的影响。

下面结合具体实施例对本发明所述的一种快速评价体外拮抗幽门螺杆菌活性的方法做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。

下列实施例中所用原料，除非特别说明，均为普通市售产品。

实施例1

1、幽门螺杆菌的培养和传代：取培养好的长有幽门螺杆菌ATCC43504菌株的羊血琼脂培养基平板，无菌条件下加入800μL脑心浸液肉汤(BHI)洗液，将菌液转移至2mL无菌样品管中，取100μL的菌液至羊血琼脂培养基上，摇匀后37℃，10％二氧化碳，5％氧气培养待用。

羊血琼脂培养基的组分为：脑心浸粉9.6g，哥伦比亚琼脂23.4g，蒸馏水780mL，高压灭菌后降至46℃后加入33～40mL去纤维羊血，倒板。

BHI洗液的组分为：蛋白胨10.0g/L，脱水小牛脑浸粉12.5g/L，脱水牛心浸粉5.0g/L，氯化钠5.0g/L，葡萄糖2.0g/L，磷酸氢二钠2.5g/L，水余量，pH 7.4。

2、配置样品溶液：分别将黄芪、蒲公英、陈皮、甘草、葛根和猴头菌子实体提取物干粉用无菌蒸馏水配置成浓度梯度为10mg/mL、5mg/mL、2.5mg/mL、1.25mg/mL、0.625mg/mL、0.3125mg/mL、0.15625mg/mL、0.078125mg/mL的单个样品溶液。

3、牛津杯法测定抑菌圈直径：取直径9cm，厚度约5mm的羊血琼脂培养基平板，每块平板加入约100μL浓度为1×10

4、96孔板法测定最小抑制浓度：将浓度梯度为10mg/mL、5mg/mL、2.5mg/mL、1.25mg/mL、0.625mg/mL、0.3125mg/mL、0.15625mg/mL、0.078125mg/mL的样品溶液各取100μL依次加入96孔板中，每个样品3组平行。趁热加入100μL羊血琼脂培养基，混合均匀。待培养基凝固后，每个孔中加入10μL浓度为1×10

5、不同样品溶液的体外抑制幽门螺杆菌ATCC43504的抑菌圈直径和最小抑菌浓度如表1和图1(甘草2和甘草5拮抗幽门螺杆菌ATCC43504的牛津杯实验，其中，A和B为甘草2，C和D为甘草5)所示，不同样品溶液都有一定的抑菌效果，其中甘草2的抑菌效果最好。

表1各样品溶液对幽门螺杆菌(Helicobacterpylori)ATCC43504的抑菌效果(样品名后的数字表示原料的来源不同)

实施例2

1、幽门螺杆菌的培养和传代：取培养好的长有幽门螺杆菌悉尼SS1菌株的羊血琼脂培养基平板，无菌条件下加入800μL脑心浸液肉汤(BHI)洗液，将菌液转移至2mL无菌样品管中，取100μL的菌液至羊血琼脂培养基上，摇匀后37℃，10％二氧化碳，5％氧气培养待用。羊血琼脂培养基的组分和BHI洗液的组分同实施例1。

2、样品溶液的配置同实施例1。

3、牛津杯法测定抑菌圈直径：取直径9cm，厚度约5mm的羊血琼脂培养基平板，每块平板加入约100μL浓度为1×10

4、96孔板法测定最小抑制浓度：将浓度梯度为10mg/mL、5mg/mL、2.5mg/mL、1.25mg/mL、0.625mg/mL、0.3125mg/mL、0.15625mg/mL、0.078125mg/mL的样品溶液各取100μL依次加入96孔板中，每个样品3组平行。趁热加入100μL羊血琼脂培养基，混合均匀。待培养基凝固后，每个孔中加入10μL浓度为1×10

5、不同样品溶液的体外抑制幽门螺杆菌SS1的抑菌圈直径和最小抑制浓度如表2所示，不同样品溶液都有一定的抑菌效果，其中甘草2的抑菌效果最好。

可见，本发明所述方法具有简单高效，判定时间短，观察结果直观等特点，符合幽门螺杆菌体外拮抗实验方法的要求，适用于多样品检测。此外，本发明不仅可简化筛选拮抗幽门螺杆菌菌株的操作步骤，还可在分离纯化拮抗幽门螺杆菌活性物质的过程中，为活性检测提供了快速、有效、实用的检测方法；并且该方法还能为后续开发治疗幽门螺杆菌感染药物打下扎实的前期基础。

表2各样品溶液对幽门螺杆菌(Helicobacterpylori)SS1的抑菌效果(样品名后的数字表示原料的来源不同)

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。