一种抗原抗体混合检测新型冠状病毒的胶体金试剂盒及制备方法

摘要

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种抗原抗体混合检测新型冠状病毒的胶体金试剂盒及制备方法。所述试剂盒包括盒体、位于所述盒体内的粘贴支架，所述粘贴支架上延长度方向依次粘贴有样本垫、金标垫、NC膜、吸样垫，所述NC膜上设有抗体检测线、抗原检测线和质控线，所述金标垫含有金标S抗体和金标S、N蛋白；所述抗体检测线上包被有S抗体，所述抗原检测线上包被有S蛋白和N蛋白混合物，所述质控线上包被有鼠抗6×His单抗。该产品为更快捷、更准确、更早期、更便利检测新冠病毒提供更多工具，为全球抗击疫情的战役提供交叉科学的武器。

说明书

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种抗原抗体混合检测新型冠状病毒的胶体金试剂盒及制备方法。

背景技术

新型冠状病毒(2019-nCoV)感染后常见体征有发热、干咳、乏力、逐渐出现呼吸困难，而部分患者未表现出临床症状。潜伏期及无症状感染者均具有传染性，且具备人传人的特点，而无症状感染者也可成为传染源，其主要通过呼吸道飞沫和密切接触传染传播，人群普遍易感。

新型冠状病毒(2019-nCoV)目前临床诊断是通过实时定量荧光PCR核酸检测试剂(核酸检测)检测患者和疑似患者血液中的2019-nCoV特定核酸序列，虽然该方法在排查中发挥了重要作用，但是该方法受操作繁琐、耗时长、需要集中送检、对检测人员要求高等的限制，同时检测结果受RNA提取效果影响较大，假阴性较高。该方法检测结果还会受到PCR试剂的质量和气溶胶污染的影响。市场上检测试剂盒目前为抗体检测试剂盒，其仅在发病产生抗体(感染8-15天) 后才能检出，不能在感染早期检测出来，因此还不能满足大规模疑似患者和无症状感染者的快速筛查。

如何在机场这种人流量很大的场所快速筛查疑似病例，供临床医生快速判断是否为新型冠状病毒肺炎，以便于快速隔离免于传染给更多的人，是亟需解决的问题。

发明内容

本发明要解决的技术问题是快速检测新型冠状病毒，在感染3-5天就可检出，检出率可达80％；实现更早期、更便捷、更准确、更快捷检出新型冠状病毒，提供一种快速、简单、可靠、成本低廉、灵敏度高的抗原抗体混合检测新型冠状病毒的胶体金试剂盒。

本发明的另一个目的是提供一种抗原抗体混合检测新型冠状病毒的胶体金试剂盒的制备方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种抗原抗体混合检测新型冠状病毒的胶体金试剂盒，包括盒体、位于所述盒体内的粘贴支架，所述粘贴支架上延长度方向依次粘贴有样本垫、金标垫、 NC膜、吸样垫，所述NC膜上靠近所述金标垫侧设有抗体检测线(X)和抗原检测线(I)，所述NC膜上靠近所述吸样垫侧设有质控线(C)，所述金标垫含有金标S抗体和金标S、N蛋白，所述金标S抗体和金标S、N蛋白为由胶体金标记的含有6×His标记的新型冠状病毒S抗体和由胶体金标记的含有6×His标记的 S、N蛋白；所述抗体检测线上包被有S抗体，所述抗原检测线上包被有S、N蛋白，所述质控线上包被有鼠抗6×His单抗。

作为本发明的进一步改进，所述金标S抗体和金标S、N蛋白的制备方法包括以下步骤：

S11、胶体金制备：取2mL 1wt％氯金酸加入120mL水溶液中，加热至沸腾，再加入2-5mL 1wt％柠檬酸三钠混匀，煮沸待胶体金溶液颜色由蓝经紫变紫红后，冷却；

S12、金标液制备：取1mL胶体金加入100μL0.1M、pH7.2的PB，混匀后加入0.1MNaOH溶液调节pH值至7.2-7.6，加入15-25μg含有6X His标记的新型冠状病毒S、N蛋白充分混匀，再加入100μL 10vol％的牛血清白蛋白混匀；加入 15-25μg含有6×His标记的新型冠状病毒S抗体充分混匀，再加入100μL 10vol％的牛血清白蛋白混匀；

S13、金标液纯化：将金标液离心后弃去上清，加入含有20wt％蔗糖的金标复溶液溶解，即得。

作为本发明的进一步改进，所述金标垫上含有6×His标记的新型冠状病毒S、 N蛋白含量高于所述新型冠状病毒S抗体的总量。

作为本发明的进一步改进，所述的样本垫材质为玻璃纤维膜，经过含Tris、酪蛋白钠盐、PVP-10的处理液进行处理过夜。

作为本发明的进一步改进，所述的金标垫材质为玻璃纤维膜，经过含Tris、 ST7、牛血清白蛋白的处理液处理。

作为本发明的进一步改进，所述金标复溶液由以下浓度的各组分组成： 0.02MTris，0.5％(w/v)PVP，0.1％(w/v)X-100和0.5％(w/v)BSA。

一种抗原抗体混合检测新型冠状病毒的胶体金试剂盒的制备方法，包括以下步骤：

S1、金标垫的制备：采用胶体金标记含有6×His标记的新型冠状病毒S抗体制得金标S抗体，采用胶体金标记含有6×His标记的新型冠状病毒S、N蛋白制得金标S、N蛋白，并将金标S抗体和金标S、N蛋白喷涂在玻璃纤维膜上，干燥得到金标垫；

S2、NC膜的制备：将配对S抗体用双抗夹心法包被在硝酸纤维素膜上形成抗体检测线，将S、N蛋白包被在硝酸纤维素膜上形成抗原检测线，将鼠抗6× His单抗包被在硝酸纤维素膜上形成质控线；

S3、切割装配：在粘贴支架的长度方向上依次粘贴样本垫、上面步骤制得的金标垫、NC膜以及吸样垫，切割成4mm±0.5mm宽的试纸条，装入盒体，即得。

作为本发明的进一步改进，上述步骤中，所述金标垫上金标S、N蛋白的喷涂量为2.0-3.0μL/cm，新型冠状病毒S抗体的喷涂量为1.0-2.0μL/cm。

本发明的有益效果在于：

该系列产品可有效辅助核酸检测，克服周期长、操作复杂、对检验场地、检验人员要求高的痛点；也可有效解决血清学抗体检测发现时间晚(发病后8-14 天才能有效检出)，部分免疫缺陷人员无法检出等痛点。为更快捷、更准确、更早期、更便利检测新冠病毒提供更多工具。

附图说明

图1为本发明一种抗原抗体混合检测新型冠状病毒的胶体金试剂盒的结构示意图；

图2为使用本发明一种抗原抗体混合检测新型冠状病毒的胶体金试剂盒的检测结果之阳性；

图3为使用本发明一种抗原抗体混合检测新型冠状病毒的胶体金试剂盒的检测结果之阳性，提示感染；

图4为使用本发明一种抗原抗体混合检测新型冠状病毒的胶体金试剂盒的检测结果之阳性，提示获得免疫；

图5为使用本发明一种抗原抗体混合检测新型冠状病毒的胶体金试剂盒的检测结果之阴性；

图6为使用本发明一种抗原抗体混合检测新型冠状病毒的胶体金试剂盒的检测结果之无效；

附图标记：1-粘贴支架，2-样本垫，3-金标垫，4-NC膜，41-抗体检测线，42- 抗原检测线，43-质控线，5-吸样垫。

具体实施方式

为更好理解本发明，下面结合实施例及附图对本发明作进一步描述，以下实施例仅是对本发明进行说明而非对其加以限定。

主要材料：

样本垫2：材质为玻璃纤维膜，经过样本垫处理液(主要含Tris、酪蛋白钠盐、PVPT0)处理过夜，样本垫2用于去除样品中的大颗粒及缓冲检测系统以保障环境体系中抗原与特异性抗体交联；

金标垫3：经过专用处理液(含Tris、ST7、牛血清白蛋白等)处理过的玻璃纤维膜，胶体金标记的确切点样量需要严格测试，以适合抗体检测线41即X 检测线显色检测已感染者，以及抗原检测线42即I检测线显色检测感染后产生已抗体者，金标抗体能与抗新型冠状病毒蛋白特异性结合形成金标复合物，还要使多余胶体金标记抗体进入质控线43而显现颜色，金标抗体胶体金标记含有6 ×His标记的新型冠状病毒蛋白不足时质控线43颜色将不会显示，成为失效条，因此金标垫3上含有6×His标记的新型冠状病毒S、N蛋白含量要高于新型冠状病毒S抗体，而过量的金标抗体和蛋白到达T区可出现假阳性，本申请金标垫3 上新型冠状病毒S抗体的喷涂量为适宜的1.0-2.0μL/cm，金标S、N蛋白的喷涂量为2.0-3.0μL/cm；

NC膜4(硝酸纤维素膜)：在硝酸纤维素膜划线的第一个区是I检测线区, 在硝酸纤维素膜划线的第二个区是X检测线区，在硝酸纤维素膜划线的第三个区是质控线区，I检测线、X检测线和质控线在此膜包被成线状，I检测线包被有S、N蛋白、X检测线包被有S抗体，用以捕获胶体金交联复合物，质控线包被鼠抗6×His单抗，当交联复合物从交联垫以毛细运动到达质控线时，该复合物将被鼠抗6×His单抗捕获，而形成可见的酒红色条带，质控线为控制线，以便检验检测系统的有效性，如质控线不出线，表明检验无效；

吸样垫5：为Whatman滤纸，促进样本层析经过样本垫2、金标垫3、NC 膜4，到达吸样垫区，以吸收多余的样本而完成检测；

粘贴支架1：为PVC支持垫，由薄PVC塑料制成以支撑上述组件。

制备方法：

试剂盒的制备方法包括以下步骤：

S1、金标垫3的制备：采用胶体金标记含有6×His标记的新型冠状病毒S 抗体制得金标S抗体，采用胶体金标记含有6×His标记的新型冠状病毒S、N蛋白制得金标S、N蛋白，并将金标S抗体和S、N蛋白喷涂在玻璃纤维膜上，干燥得到金标垫3；

S2、NC膜4的制备：将配对S抗体用双抗夹心法包被在硝酸纤维素膜上形成抗体检测线41，将S、N蛋白包被在硝酸纤维素膜上形成抗原检测线42，将鼠抗6×His单抗包被在硝酸纤维素膜上形成质控线43；

S3、切割装配：在粘贴支架1的长度方向上依次粘贴样本垫2、上面步骤制得的金标垫3、NC膜4以及吸样垫5，切割成4mm±0.5mm宽的试纸条，装入盒体，即得。

其中，所述金标S抗体和金标S、N蛋白的制备方法包括以下步骤：

S11、胶体金制备：取2mL 1wt％氯金酸加入120mL水溶液中，加热至沸腾，再加入2-5mL 1wt％柠檬酸三钠混匀，煮沸待胶体金溶液颜色由蓝经紫变紫红后，冷却；

S12、金标液制备：取1mL胶体金加入100μL0.1M、pH7.2的PB，混匀后加入0.1MNaOH溶液调节pH值至7.2-7.6，加入15-25μg含有6X His标记的新型冠状病毒S、N蛋白充分混匀，再加入100μL 10vol％的牛血清白蛋白混匀；加入 15-25μg含有6×His标记的新型冠状病毒S抗体充分混匀，再加入100μL 10vol％的牛血清白蛋白混匀；

S13、金标液纯化：将金标液混合离心后弃去上清，加入含有20wt％蔗糖的金标复溶液溶解，即得。

其中，金标复溶液由以下浓度的各组分组成：0.02M Tris，0.5％(w/v)PVP， 0.1％(w/v)X-100和0.5％(w/v)BSA。

检测原理：

检测时，本试剂盒采用免疫层析原理，可在体外检测人血清、血浆和静脉全血中的2019-nCoV抗体，也可在咽拭子、唾液和尿液中直接检测病毒本身。新型冠状病毒S抗体结合了胶体金及S、N蛋白(简称：金标混合物)，在硝酸纤维素膜条末端承载固定。其中，该混合物固定在检测区(简称：I和X区)。另外，鼠单抗固定在控制区(简称：C区)。当加入检测样本时，它通过毛细管扩散方式迁移，并再水化金共轭物。若样本中存在检测目标，血清、血浆、静脉全血中的抗S蛋白和N蛋白抗体或咽拭子、唾液、尿液中的病毒S蛋白会结合金标混合物，并在I或X区附近形成颗粒物。这些颗粒会继续沿条带迁移，如果在整个T 区产生肉眼可见的红线，此结果被判定为阳性；否则，无红色条带将被判定为阴性。在正常试验情况下，C区应显红色，以表示检测有效。

图2～6展示了不同受检情况显示的不同结果：

图2——阳性；

图3——阳性，提示感染；

图4——阳性，提示获得免疫；

图5——阴性；

图6——无效。

以上所述实施方式仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。