核酸提取用磁性微球的制备方法、所制备的产品及用途

摘要

本发明涉及一种制备硅羟基磁性微球的方法，包括：合成磁性微粒；对所述磁性微粒进行亲水层修饰；以及对经修饰的磁性微粒进行功能化处理，所述功能化处理包括：将经修饰的磁性微粒分散于无水低级醇溶液；加入赋予所述磁性微粒硅羟基功能化的单体进行反应，其中，在所述功能化处理的步骤中不加入任何水且不使用除pH调节剂外的任何含水试剂。本发明改善了核酸，尤其RNA的提取效果。本发明还涉及制备得到的硅羟基磁性微球，及其在核酸提取中的用途。

说明书

技术领域

本发明涉及核酸提取领域，具体涉及用于核酸提取的磁性微球的制备。

背景技术

核酸是由核苷酸或脱氧核苷酸通过磷酸二酯键连接而成的一类生物大分子，包括核糖核酸(RNA)和脱氧核糖核酸(DNA)。作为遗传信息的载体，核酸是分子生物学领域的重要研究对象。核酸样本的质量，尤其是其提取效果后续的分析过程有着重要影响。传统的核酸提取方法包括碱裂解法、煮沸法、柱分离法等。

磁性微球法是近些年发展起来的一种新提取方法，该方法通过制备成表面上引入一些功能基团(如羟基、羧基)的超顺磁性纳米磁性微球。该磁性微球能在微观界面上与核酸分子特异性地识别和高效结合。在外加磁场的作用下，能从血液、动物组织、食品、病原微生物等样本中分离出核酸。与传统的方法相比，其具有无需剧毒试剂参与、避免多步骤高转速离心，简单易行的特点。硅羟基磁性微球是一类用于核酸提取的常见磁性微球，该磁性微球在DNA提取中效果良好；而在RNA提取中存在信号极弱，乃至提取不出来的弊端。

因此，在核酸提取领域，存在着对改善硅羟基微球对RNA提取效果的强烈需求。

发明内容

在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。

如下文中所使用，术语“具有”、“包含”或“包括”以非排他性的方式使用。因此，这些术语既可以是指其中除了这些术语引入的特征之外在本上下文中描述的实体中没有另外特征存在的情况，而且可以是指其中存在一个或多个另外特征的情况。作为实例，表述“A具有B”、“A包含B”和“A包括B”既可以是指其中除了B之外在A中没有另外要素存在的情况(即其中单独且仅由B组成的情况)，而且可以是指其中除了B之外在实体A中存在一种或多种另外要素诸如要素C、要素C和D或甚至其它要素的情况。

在本发明的具体值或比率的上下文中的术语“约”是指所述值或比率的+/-10％，或者在一个实施方案中给定值或比率的+/-5％。

如前文所述，目前所制备的硅羟基磁性微球在用于RNA提取时存在信号弱、甚至提取不出来的问题，这极大地制约了硅羟基磁性微球在核酸提取中的应用。

为了解决上述问题，本发明人对硅羟基磁性微球的制备工艺进行了研究。本发明人发现造成上述问题的原因在于：磁性微球的制备中的功能化处理步骤中往往需要将磁微粒加入到含水乙醇，或者在加入无水乙醇后再加入水或含水试剂(如分散剂等)，水的使用旨在促进水解速度、加快硅羟基化；然而，令人意外的是，该步骤中水的引入或导致所制备的磁性微球难以实现RNA提取。据此，本发明人对功能化处理步骤进行了调整，从而完成了本发明。

因此，在第一方面，本发明提供了一种制备硅羟基磁性微球的方法，包括：

合成磁性微粒；

对所述磁性微粒进行亲水层修饰；以及

对经修饰的磁性微粒进行功能化处理，所述功能化处理包括：

-将经修饰的磁性微粒分散于无水低级醇溶液；

-加入赋予所述磁性微粒硅羟基功能化的单体进行反应，

其中，在所述功能化处理的步骤中不加入任何水且不使用除pH调节剂外的任何含水试剂。

通过采用本发明的制备方法，所制备得到的硅羟基磁性微球在用于核酸，尤其是RNA的提取时效果显著提升，灵敏度高、并提高了重复性和检出率。

在具体的实施方式中，本发明的硅羟基磁性微球用于核酸提取，如DNA提取、RNA提取，或DNA/RNA共提取；尤其用于RNA提取。

如本文所使用的，“磁性微粒”可与“磁性基质材料”互换使用，是指具有超顺磁性、晶形完整均匀的磁性颗粒。根据本发明的上下文可以理解，本发明中的磁性微粒尚未进行功能化修饰和/或亲水修饰。磁性微粒(磁性种核)例如可以为Fe

磁性微粒可以通过本领域熟知的方法合成得到，这样的方法例如可以是化学共沉淀法、水热法、溶剂热法、微乳液法、直流电弧等离子体法或高温裂解法等。

如本文所使用的，“磁性微球”可与“磁珠”互换使用。

如本文所使用的，“亲水层修饰”是指使用亲水性物质修饰磁性微粒。亲水层修饰旨在改善颗粒的分散性。

在本发明中，亲水性物质可以是柠檬酸类(如柠檬酸盐)、聚乙二醇类、聚乙烯吡咯烷酮类亲水性物质。

在示例性的实施方式中，在使用柠檬酸钠作为亲水性物质的情况下，可加入0.01M柠檬酸钠并在90℃下保持1h，从而得到表面修饰的磁性微粒。

应当理解，本发明的功能化步骤是在尽可能地避免水的引入的情况下进行的；换句话说，在功能化步骤中不加入任何水并且不使用除pH调剂剂外的任何含水试剂。任何水例如可以是：超纯水、蒸馏水、留存在或有意加入至反应容器中水等；任何含水试剂例如可以是分散剂、醇/水混合液等。

在具体的实施方式中，“低级醇”是指碳链长度为3或以下的醇。

在示例性的实施方式中，低级醇可以选自甲醇、乙醇、正丙醇和异丙醇中的一种或更多种。

在功能化处理步骤中，在将经修饰的磁性微粒分散于低级醇溶液后，会形成一定浓度的磁流体。磁流体浓度定义为所使用的经修饰的磁性微粒的质量与低级醇溶液的体积之比。例如，当取300mg经修饰的磁性微粒分散于150ml低级醇中时，磁流体浓度为2mg/mL。

在本发明中，磁流体浓度可以是1-15mg/mL。例如，约1mg/mL、约2mg/mL、约3mg/mL、约4mg/mL、约5mg/mL、约6mg/mL、约7mg/mL、约8mg/mL、约9mg/mL、约10mg/mL、约11mg/mL、约12mg/mL、约13mg/mL、约14mg/mL或约15mg/mL。

在优选的实施方式中，本发明的磁流体浓度是2-14mg/mL。

通过在功能化处理步骤中选择2-14mg/mL的磁流体浓度，本发明进一步改善了所制备的磁性微球在提取核酸时的效果。

对于使用低级醇处理的子步骤的时长，本发明没有特别的限制，只要能够使经处理的磁性微粒充分分散即可。

如本文所使用的，“硅羟基功能化的单体”可与“硅羟基的供体”互换使用，是指赋予经修饰的磁性微粒硅羟基功能化的物质。

具体地，“硅羟基功能化的单体”可选自由正硅酸甲酯、正硅酸乙酯、正硅酸丙酯、正硅酸丁酯、烷基三甲氧基硅烷、烷基三乙氧基硅烷、烷基三乙丙基硅烷、二烷基二甲氧基硅烷、二烷基二乙氧基硅烷、苯基三甲氧基硅烷、苯基三乙氧基硅烷、氨丙基三甲氧基硅烷，和环氧丙基三甲氧基硅烷所组成的组中的一种或更多种。

在加入“硅羟基功能化的单体”进行反应之前或之时，本发明的方法可进一步包括待反应溶液调节至适合反应条件的步骤。合适的pH条件例如可以是8-13；例如可以通过加入弱碱性pH调节剂(如1-2mL氨水)来实现pH的调节。合适的反应温度例如可以是50-90℃。

在具体的实施方式中，加入硅羟基功能化的单体进行反应的子步骤例如可持续1-6h。

示例性地，含水试剂例如可以是含水醇(醇/水混合液)、分散剂等。

本发明的方法可进一步包括额外的步骤。例如，在功能化处理步骤之后，本发明的方法可包括磁分离、洗涤，和/或干燥步骤。

在第二方面，本发明提供了一种硅羟基磁性微球，其通过本发明的方法制备得到。

在第三方面，本发明提供了硅羟基磁性微球在提取样本中的核酸中的用途。

在具体的实施方式中，样本可选自血液、咽拭子、痰液、肺泡灌洗液、组织、食品和环境样本等。

在具体的实施方式中，核酸为DNA、RNA，或DNA和RNA两者。

在示例性的实施方式中，RNA为源自病毒的RNA，例如新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的RNA。

附图说明

图1示出了硅羟基磁性微球的制备工艺路线。

图2示出了实施例1所制备的磁性颗粒的SEM图像；

图3示出了实施例1所制备的磁性颗粒的VSM测试结果。

具体实施方式

下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。

实施例1

步骤一：磁性种核的合成

取4.0g硫酸亚铁·七水，7.0g氯化铁·六水于150mL水中，设置搅拌速度为300rpm，搅拌30min使溶液充分混匀，升温至40℃，之后加入50mL氨水，反应30min，再次升温至90℃熟化1h，得到粒径约5～15nm的超顺磁性纳米磁性颗粒。

在SEM下观察得到的磁性种核，结果如图2所示；SEM结果显示磁性种核基本呈球形，且具有良好的晶形结构，粒径约10nm。同时，使用VSM对所得到的磁性种核进行磁学实验测量，结果如图3所示；VSM结果显示磁性种核具有超顺磁。

步骤二：磁性颗粒的亲水层修饰

将上述制备的磁性种核分散200mL 0.01M柠檬酸钠水溶液，90℃保持1h，得到表面修饰的磁性颗粒。

步骤三：功能化处理

硅羟基修饰：取1g步骤二所得磁性颗粒分散于150mL无水乙醇溶液中，30min后加入1mL氨水并升温至80℃，温度保持恒定后加入5mL TEOS，2h后停止反应，得到硅羟基磁性微球。

实施例2

使用实施例1中获得的硅羟基磁性微球，利用奥盛Auto Pure32A提取仪，提取样本1(SARS-CoV-2高浓度样本5×10

使用宏石SLAN96P扩增仪对提取自样本1和样本2的RNA进行逆转录扩增，检测结果如表1所示。

*通道1至4分别代表对SARS-CoV-2的四种不同基因的检测结果，下同；

*检出率：无Ct值或Ct值大于38时视为未检出，下同。

由表1可知，高浓度样本1的实验数据表明：实施例1所制备的磁性微球的提取效果较佳，且重复性好。

而根据低浓度样本2的结果可知，实施例1所制备的磁性微球的检出率为100％，且重复性好。

对比例1

步骤一：磁性种核的合成

取4.0g硫酸亚铁·七水，7.0g氯化铁·六水于150mL水中，设置搅拌速度为300rpm，搅拌30min使溶液充分混匀，升温至40℃，之后加入50mL氨水，反应30min，再次升温至90℃熟化1h，得到粒径约5～15nm的超顺磁性纳米磁性颗粒。

步骤二：磁性颗粒的亲水层修饰

将上述制备的磁性种核分散200mL 0.01M柠檬酸钠水溶液，90℃保持1h，得到表面修饰的磁性颗粒。

步骤三：功能化处理

硅羟基修饰：取1g步骤二所得磁性颗粒分散于150mL乙醇/水溶液中，30min后加入1mL氨水并升温至77℃，温度保持恒定后加入5mL TEOS，其中TEOS与乙醇的稀释比为1:1～1:10，2h后停止反应。得到硅羟基磁性微球。

对比例2

步骤一：磁性种核的合成

取4.0g硫酸亚铁·七水，7.0g氯化铁·六水于150mL水中，设置搅拌速度为300rpm，搅拌30min使溶液充分混匀，升温至40℃，之后加入50mL氨水，反应30min，再次升温至90℃熟化1h，得到粒径约5～15nm的超顺磁性纳米磁性颗粒。

步骤二：磁性颗粒的亲水层修饰

将上述制备的磁性种核分散200mL 0.01M柠檬酸钠水溶液，90℃保持1h，得到表面修饰的磁性颗粒。

步骤三：功能化处理

硅羟基修饰：取1g步骤二所得磁性颗粒分散于120mL无水乙醇中，30min后加入2mL氨水并升温至80℃，温度保持恒定后加入5mL TEOS，其中TEOS与乙醇的稀释比为1:1～1:10，反应2h后，加入30mL超纯水，继续反应2h，停止加热，过夜搅拌。得到硅羟基磁性微球。

对比例3

步骤一：磁性种核的合成

取4.0g硫酸亚铁·七水，7.0g氯化铁·六水于150mL水中，设置搅拌速度为300rpm，搅拌30min使溶液充分混匀，升温至40℃，之后加入50mL氨水，反应30min，再次升温至90℃熟化1h，得到粒径约5～15nm的超顺磁性纳米磁性颗粒。

步骤二：磁性颗粒的亲水层修饰

将上述制备的磁性种核分散200mL 0.01M柠檬酸钠水溶液，90℃保持1h，得到表面修饰的磁性颗粒。

步骤三：功能化处理

硅羟基修饰：取1g步骤二所得磁性颗粒分散于30mL水中，搅拌30min分散，之后加入120mL无水乙醇，继续搅拌30min。加入2mL氨水并升温至80℃，温度保持恒定后加入5mLTEOS，其中TEOS与乙醇的稀释比为1:1～1:10，反应2h后，加入30mL超纯水，继续反应2h，停止加热，过夜搅拌。得到硅羟基磁性微球。

实施例3

分别使用对比例1-3中所制备的硅羟基磁性微球，按照实施例2中的提取方法和检测方法，对样本1和样本2进行测试，结果如下表2所示。

表2

对比例1-3的方法中，分别以不同的顺序在功能化处理步骤中加入了水。表2结果显示：这三种方法合成的磁性微球，对于RNA提取中几乎无效果，且只有通道2可检出部分，其余通道均未能检出。说明功能化步骤中采用醇/水反应体系合成的硅羟基磁性微球无法用于RNA的提取。

实施例4

步骤一：磁性种核的合成

取4.0g硫酸亚铁·七水，7.0g氯化铁·六水于150mL水中，设置搅拌速度为300rpm，搅拌30min使溶液充分混匀，升温至40℃，之后加入50mL氨水，反应30min，再次升温至90℃熟化1h，得到粒径约5～15nm的超顺磁性纳米磁性颗粒。

步骤二：磁性颗粒的亲水层修饰

将上述制备的磁性颗粒分散200mL 0.01M柠檬酸钠水溶液，90℃保持1h，得到表面修饰的磁性颗粒。

步骤三：功能化处理

硅羟基修饰：取步骤二所得磁性颗粒分散于150mL无水乙醇中，使磁流体浓度为2mg/mL，30min后加入2mL氨水并升温至80℃，温度保持恒定后加入5mL TEOS，反应2h后停止加热，过夜搅拌。得到硅羟基磁性微球。

实施例5

步骤一：磁性种核的合成

取4.0g硫酸亚铁·七水，7.0g氯化铁·六水于150mL水中，设置搅拌速度为300rpm，搅拌30min使溶液充分混匀，升温至40℃，之后加入50mL氨水，反应30min，再次升温至90℃熟化1h，得到粒径约5～15nm的超顺磁性纳米磁性颗粒。

步骤二：磁性颗粒的亲水层修饰

将上述制备的磁性种核分散200mL 0.01M柠檬酸钠水溶液，90℃保持1h，得到表面修饰的磁性颗粒。

步骤三：功能化处理

硅羟基修饰：取步骤二所得磁性颗粒分散于150mL无水乙醇中，使磁流体浓度为14mg/mL，30min后加入2mL氨水并升温至80℃，温度保持恒定后加入5mL TEOS，反应2h后停止加热，过夜搅拌。得到硅羟基磁性微球。

对比例4

步骤一：磁性种核的合成

取4.0g硫酸亚铁·七水，7.0g氯化铁·六水于150mL水中，设置搅拌速度为300rpm，搅拌30min使溶液充分混匀，升温至40℃，之后加入50mL氨水，反应30min，再次升温至90℃熟化1h，得到粒径约5～15nm的超顺磁性纳米磁性颗粒。

步骤二：磁性颗粒的亲水层修饰

将上述制备的磁性种核分散200mL 0.01M柠檬酸钠水溶液，90℃保持1h，得到表面修饰的磁性颗粒。

步骤三：功能化处理

硅羟基修饰：取步骤二所得磁性颗粒分散于150mL无水乙醇中，使磁流体浓度分别为1mg/mL，30min后加入2mL氨水并升温至80℃，温度保持恒定后加入5mL TEOS，反应2h后停止加热，过夜搅拌。得到硅羟基磁性微球。

对比例5

步骤一：磁性种核的合成

取4.0g硫酸亚铁·七水，7.0g氯化铁·六水于150mL水中，设置搅拌速度为300rpm，搅拌30min使溶液充分混匀，升温至40℃，之后加入50mL氨水，反应30min，再次升温至90℃熟化1h，得到粒径约5～15nm的超顺磁性纳米磁性颗粒。

步骤二：磁性颗粒的亲水层修饰

将上述制备的磁性种核分散200mL 0.01M柠檬酸钠水溶液，90℃保持1h，得到表面修饰的磁性颗粒。

步骤三：功能化处理

硅羟基修饰：取步骤二所得磁性颗粒分散于150mL无水乙醇中，使磁流体浓度为15mg/mL，30min后加入2mL氨水并升温至80℃，温度保持恒定后加入5mL TEOS，反应2h后停止加热，过夜搅拌。得到硅羟基磁性微球。

实施例6

分别使用实施例4-5和对比例4-5中所制备的硅羟基磁性微球，按照实施例2中的提取方法和检测方法，对样本1和样本2进行测试，结果如下表3所示。

表3

由表3可知，实施例4和实施例5所得磁性微球在样本1中的提取效果无明显差异；在样本2提取中，第一通道中实施例4的Ct值提前实施例5约1.5，在第三通道中实施例5的Ct值效果提前实施例4约0.6；且使用这两个实施例所制备的磁性微球时检出率均为100％。当磁流体浓度为1mg/mL(即对比例4)时，样本1的提取循环数均比实施例4滞后1.5～3Ct；样本2的提取循环数均滞后0.5～3.5Ct，且检出率低。当磁流体浓度为15mg/mL(即对比例5)时，样本1的提取循环数均比实施例4滞后0～4Ct；样本2的提取循环数滞后0.8～2.5Ct，且存在检不出现象。表明磁流体最佳浓度为2～14g/mL。

实施例7

步骤一：磁性种核的合成

取4.0g硫酸亚铁·七水，7.0g氯化铁·六水于150mL水中，设置搅拌速度为300rpm，搅拌30min使溶液充分混匀，升温至40℃，之后加入50mL氨水，反应30min，再次升温至90℃熟化1h，得到粒径约5～15nm的超顺磁性纳米磁性颗粒。

步骤二：磁性颗粒的亲水层修饰

将上述制备的磁性种核分散200mL 0.01M柠檬酸钠水溶液，90℃保持1h，得到表面修饰的磁性颗粒。

步骤三：功能化处理

硅羟基修饰：取1g步骤二所得磁性颗粒分散于150mL无水异丙醇中，30min后加入2mL氨水并升温至80℃，温度保持恒定后加入5mL TEOS，反应2h后停止加热，过夜搅拌。得到硅羟基磁性微球。

实施例8

使用实施例7所制备的硅羟基磁性微球，按照实施例2中的提取方法和检测方法，对样本1和样本2进行测试，结果如下表4所示。

表4

由表4可知，使用异丙醇作为无水低级醇的实施例7所制得的硅羟基磁性微球在提取核酸时也取得了较好的效果。