一种油脂酸价检测方法和试剂盒

摘要

本发明涉及检测领域，特别是涉及一种油脂酸价检测方法和试剂盒。本发明提供一种油脂酸价检测方法，包括：提供油脂样品的样品溶解液，所述样品溶解液的溶剂包括有机溶剂；将样品溶解液与染色液接触，所述染色液选自包括吡啶的铜盐水溶液；所述染色液的pH值≥6.8且＜7.5，染色液中吡啶摩尔数与染色液中铜离子摩尔数之比≥1且＜3。本发明发明人通过对皂铜比色反应的两相——水相染色液和有机相样品溶解液的组成和配方的改进，在不使用苯的前提下，使皂铜比色的强度得到明显的改善。甚至可接近于或达到以苯作为样品溶解液时的显色强度，同时还提高了显色的稳定性，及降低配制成本和技术难度。

说明书

技术领域

本发明涉及检测领域，特别是涉及一种油脂酸价检测方法和试剂盒。

背景技术

根据现有的相关文献报道，皂铜比色技术是一种通过显色、比色检测油脂中游离脂肪酸总含量的技术。其检测反应的原理是游离脂肪酸在互不相溶的两相溶液——染色液(水相溶液)和样品溶解液(非极性有机相溶液)之间的相转移络合显色反应。虽然皂铜比色技术在现有技术中已经广泛运用，但是现有的皂铜比色技术中大多使用剧毒溶剂苯，且还存在显色强度低等各种缺陷，从而极大限制了皂铜比色的应用范围。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种油脂酸价检测方法和试剂盒，用于解决现有技术中的问题。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明一方面提供一种油脂酸价检测方法，包括：

提供油脂样品的样品溶解液，所述样品溶解液的溶剂包括有机溶剂；

将样品溶解液与染色液接触，所述染色液选自包括吡啶的铜盐水溶液；

所述染色液的pH值≥6.8且＜7.5，染色液中吡啶摩尔数与染色液中铜离子摩尔数之比≥1且＜3。

本发明一些实施方式中，还包括：将有机相与显色液接触。

本发明一些实施方式中，所述显色液包括指示剂，所述指示剂选自吡啶偶氮萘酚类指示剂、吡啶偶氮苯酚类指示剂、噻唑偶氮萘酚类指示剂或噻唑偶氮苯酚类指示剂中的一种或多种的组合。

本发明一些实施方式中，所述指示剂选自1-(2-吡啶偶氮)-2-萘酚、1-(2-噻唑偶氮)-2-萘酚、4-(2-吡啶基偶氮)-1,3-苯二酚、4-(2-噻唑基偶氮)-1,3-苯二酚中的任一种或多种的组合，所述显色液的溶剂选自水、甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、异丁醇、丙酮、四氢呋喃、二甲基亚砜、甲酸、乙酸、丙酸中一种或多种的组合。

本发明一些实施方式中，显色液的pH值为1.0～5.0。

本发明一些实施方式中，还包括：获取有机相的吸光度。

本发明一些实施方式中，还包括：与标样对比，确定油脂样品中游离脂肪酸的含量。

本发明一些实施方式中，染色液与样品溶解液的重量比例范围可以为0.01～2。

本发明一些实施方式中，所述染色液的pH值≥7.0且＜7.5。

本发明一些实施方式中，所述染色液中吡啶摩尔数与染色液中铜离子摩尔数之比≥1且＜2.5。

本发明一些实施方式中，所述染色液中吡啶摩尔数与染色液中铜离子摩尔数之比≥2且＜2.5。

本发明一些实施方式中，所述染色液中还包括缓冲体系，染色液中的缓冲体系中，缓冲盐的浓度为0.05～2.5mol/L。

本发明一些实施方式中，所述染色液中还包括缓冲体系，染色液中的缓冲体系中，缓冲盐的浓度为0.5～2mol/L。

本发明一些实施方式中，所述染色液中还包括缓冲体系，染色液中的缓冲体系中，缓冲盐的浓度为1～2mol/L。

本发明一些实施方式中，所述染色液中还包括缓冲体系，缓冲体系选自C1～C5羧酸及其相应的水溶性盐体系，优选选自甲酸/甲酸锂、乙酸/乙酸锂体系、丙酸/丙酸锂体系、丁酸/丁酸锂体系、异丁酸/异丁酸锂体系、戊酸/戊酸锂体系、异戊酸/异戊酸锂体系、甲酸/甲酸钠、乙酸/乙酸钠体系、丙酸/丙酸钠体系、丁酸/丁酸钠体系、异丁酸/异丁酸钠体系、戊酸/戊酸钠体系、异戊酸/异戊酸钠体系、甲酸/甲酸钾、乙酸/乙酸钾体系、丙酸/丙酸钾体系、丁酸/丁酸钾体系、异丁酸/异丁酸钾体系、戊酸/戊酸钾体系、异戊酸/异戊酸钾体系中的一种或多种的组合。

本发明一些实施方式中，所述缓冲体系中的缓冲盐选自钠盐和/或钾盐。

本发明一些实施方式中，所述有机溶剂选自烷基取代的苯类溶剂、C8～C16的直链烷烃类溶剂和C6～C12的环烷烃类溶剂。

本发明一些实施方式中，所述有机溶剂选自甲苯、邻二甲苯、间二甲苯、对二甲苯、乙苯、邻二乙苯、对二乙苯、间二乙苯、丙苯、异丙苯、1,2,4-三甲苯、1,2,3-三甲苯、1,3,5-三甲苯、壬烷、癸烷、十一烷、十二烷、十三烷、十四烷、十五烷、十六烷、环己烷、环辛烷、环癸烷、环十二烷中的一种或多种的组合。

本发明一些实施方式中，所述有机溶剂选自甲苯、邻二甲苯、间二甲苯、对二甲苯、乙苯中的一种或多种的组合。

本发明一些实施方式中，所述有机溶剂选自甲苯和/或邻二甲苯。

本发明一些实施方式中，所述有机溶剂选自甲苯。

本发明一些实施方式中，所述样品溶解液中，总游离脂肪酸的浓度为0.01～10mg/mL油酸当量。

本发明另一方面提供一种油脂酸价检测试剂盒，包括用于溶解样品的有机溶剂、染色液，所述染色液选自包括吡啶的铜盐水溶液，所述染色液的pH值为6.8～7.5，染色液中吡啶摩尔数与染色液中铜离子摩尔数之比为1：1～3。

附图说明

图1所示为本发明实施例6观测结果示意图。

具体实施方式

本发明通过对皂铜比色反应的两相——水相染色液和有机相样品溶解液的组成和配方的改进，在不使用苯的前提下，使皂铜比色的强度得到明显的改善，同时还提高了显色的稳定性，在此基础上完成了本发明。

本发明第一方面提供一种油脂酸价检测方法，包括：

提供油脂样品的样品溶解液，所述样品溶解液的溶剂包括有机溶剂；

将样品溶解液与染色液接触，所述染色液选自包括吡啶的铜盐水溶液；

所述染色液的pH值为6.8～7.5，染色液中吡啶摩尔数与染色液中铜离子摩尔数之比为1～3。

本发明所提供的检测方法中，可以包括：提供油脂样品的样品溶解液，所述样品溶解液的溶剂包括有机溶剂。本发明发明人发现，样品溶解液采用低毒的烷基取代的苯类溶剂(苯的烷烃衍生类溶剂)、C8～C16的直链烷烃类溶剂和C6～C12的环烷烃类溶剂时，其显色的强度会有不同程度的增强，所述烷基取代的苯类溶剂可以是包括但不限于甲苯、邻二甲苯、间二甲苯、对二甲苯、乙苯、邻二乙苯、对二乙苯、间二乙苯、丙苯、异丙苯、1,2,4-三甲苯、1,2,3-三甲苯、1,3,5-三甲苯、壬烷、癸烷、十一烷、十二烷、十三烷、十四烷、十五烷、十六烷、环己烷、环辛烷、环癸烷、环十二烷等中的一种或多种的组合，优选可以是包括但不限于甲苯、邻二甲苯、间二甲苯、对二甲苯、乙苯等中的一种或多种的组合，更优选可以是包括但不限于甲苯和/或邻二甲苯等，更优选可以是是包括但不限于甲苯等。本领域技术人员可以根据样品的种类，调节样品溶解液中样品与溶剂的使用比例，例如，总游离脂肪酸的浓度可以为0.01mg/mL～5mg/mL、0.01mg/mL～0.1mg/mL、0.1mg/mL～0.3mg/mL、0.3mg/mL～0.5mg/mL、0.5mg/mL～1mg/mL、1mg/mL～2mg/mL、2mg/mL～3mg/mL、3mg/mL～5mg/mL、或5mg/mL～10mg/mL的油酸当量。

本发明所提供的检测方法中，还可以包括：将样品溶解液与染色液接触，所述染色液选自包括吡啶的铜盐水溶液。将样品溶解液与染色液接触后，通常可以形成有机相和水相。所述染色液的pH值通常可以为6.8～7.5、6.8～6.9、6.9～7.0、7.0～7.1、7.1～7.2、7.2～7.3、7.3～7.4、或7.4～7.5，在本发明一具体实施例中，所述染色液的pH值≥6.8且＜7.5，优选为≥7.0且＜7.5。本发明发明人发现，当染色液中铜离子的摩尔数与添加的吡啶分子的摩尔数之比为1：2时，此时即使直接添加强碱溶液(如氢氧化钠、氢氧化钾的水溶液)来进一步升高染色液的pH值，其中的铜离子也不会形成大量的氢氧化铜沉淀，但随着染色液的pH值升高，皂铜比色反应的显色强度也逐步增强，但当达到pH6.8及其以上时，这种增强的辐度明显减弱，尤其的当达到pH7.0及其以上时，皂铜比色反应的显色强度达到最强，且不再随着pH值的升高而增强，而当染色的pH值升高达7.5及其以上时，会有明显的氢氧化铜沉淀析出。但是同时，在较高pH值(如pH7.0及以上)的溶液环境中，在长期的室温储存过程中，染色液中铜离子比较稳定，不易形成氢氧化铜沉淀。所述染色液中吡啶摩尔数与染色液中铜离子摩尔数之比可以为1～3、1～2.5、1～1.5、1.5～2、2～2.5、或2.5～3。在本发明一具体实施例中，所述染色液中吡啶摩尔数与染色液中铜离子摩尔数之比≥1且＜3，优选为≥1且＜2.5，更优选为≥2且＜2.5。本发明发明人发现，用吡啶将铜盐水溶液的pH值调至6.10～6.20时，皂铜比色会有最强的显色强度，若继续向染色液中添加吡啶，进一步提高染色液的pH值，反而使皂铜比色的显色强度明显的、连续的下降，这种现象并非是染色液的pH值升高而造成的，当吡啶分子的摩尔数与铜离子摩尔数之比大于等于3时，通常会完全抑制了铜离子与脂肪皂的络合反应。

本发明所提供的检测方法中，所述染色液中还可以包括缓冲体系，染色液中的缓冲体系中，缓冲盐的浓度可以为0.05～0.1mol/L、0.1～0.3mol/L、0.3～0.5mol/L、0.5～1mol/L、1～1.5mol/L、1.5～2mol/L、2～2.5mol/L、或0.05～2.5mol/L。在本发明一具体实施例中，所述染色液中缓冲盐的浓度为0.05～2.5mol/L，优选为0.5～2mol/L，更优选为1～2mol/L。本发明发明人发现，当染色液的pH值接近于7.0时，在皂铜显色反应时，染色液与样品溶解液之间会发生一定程度的乳化，且很难破乳，而当体系中引入适当的缓冲液体系时，可以明显抑制染色液和样品溶解液之间的乳化作用，且染色液中缓冲盐的浓度越高，这种破乳作用就越快、越明显。此外，本发明发明人还惊讶地发现，引入缓冲盐后，会明显增加最终皂铜显色的强度，并在皂铜比色反应中，环境温度对其检测结果的影响相对比较小，同时降低了铜盐和吡啶的添加浓度，减少了有毒试剂用量，并降低了成本。此外，本发明发明人还发现，当染色液中的添加的缓冲盐浓度大于0.5mol/L时，此时若被检测的油脂样品中含有微量的水溶性酸性物质(即使皂铜反应时，样品溶解液中含有微量的水溶性酸性物质)，例如，浓度为0.01％～0.05％的酸性物质(例如，乙酸)，并不会明显降低最终皂铜反应的显色强度。所述缓冲液中，缓冲体系选自羧酸及其相应的水溶液盐所构成的体系，所构成的缓冲溶液体系可以是包括但不限于C1～C5羧酸及其相应的水溶性盐体系，甲酸/甲酸锂、乙酸/乙酸锂体系、丙酸/丙酸锂体系、丁酸/丁酸锂体系、异丁酸/异丁酸锂体系、戊酸/戊酸锂体系、异戊酸/异戊酸锂体系、甲酸/甲酸钠、乙酸/乙酸钠体系、丙酸/丙酸钠体系、丁酸/丁酸钠体系、异丁酸/异丁酸钠体系、戊酸/戊酸钠体系、异戊酸/异戊酸钠体系、甲酸/甲酸钾、乙酸/乙酸钾体系、丙酸/丙酸钾体系、丁酸/丁酸钾体系、异丁酸/异丁酸钾体系、戊酸/戊酸钾体系、异戊酸/异戊酸钾体系等中的一种或多种的组合，优选的，所述缓冲体系中的缓冲盐选自钠盐和/或钾盐。本发明发明人发现，水溶性的、低碳数弱酸性的羧酸及其相应的水溶性盐组成的缓冲溶液体系代替纯水来配制的染色液，对皂铜比色有多个方面的显著改善作用。

本发明所提供的检测方法中，本领域技术人员可选择合适的染色液与样品溶解液的使用比例，例如，染色液与样品溶解液的重量比例范围可以为0.01～2、0.01～0.1、0.1～0.3、0.3～0.5、0.5～1、或1～2。

本发明所提供的检测方法中，还可以包括：将有机相与显色液接触，以释放出有机相中皂铜反应产生的皂铜络合物中的铜离子。所述显色液中通常包括指示剂，所述指示剂通常可以与释放的铜离子发生配位反应，生成有颜色的配位化合物，从而显色。所述指示剂可以是包括但不限于吡啶偶氮萘酚类指示剂、吡啶偶氮苯酚类指示剂、噻唑偶氮萘酚类指示剂或噻唑偶氮苯酚类指示剂中的一种或多种的组合，更具体可以是包括但不限于1-(2-吡啶偶氮)-2-萘酚、1-(2-噻唑偶氮)-2-萘酚、4-(2-吡啶基偶氮)-1,3-苯二酚、4-(2-噻唑基偶氮)-1,3-苯二酚中的任一种或多种的组合，所述显色液的溶剂可以为水、甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、异丁醇、丙酮、四氢呋喃、二甲基亚砜、甲酸、乙酸、丙酸中一种或多种的组合。本领域技术人员通常可以选择适量的有机相溶液与显色液接触，所述有机相与显色液接触时，显色液的pH值优选为1～5、1～2、2～3、3～4、或4～5。

本发明所提供的检测方法中，还可以包括：获取有机相的吸光度。染色液(水相)和样品溶解液(有机相)充分接触后，可以形成[脂肪皂阴离子-铜阳离子-吡啶]的皂铜络合物。由于皂铜络合物有一定的疏水性，所以形成的皂铜络合物，其中部分再次转移入非极性有机相——样品溶解液。由于皂铜络合物在700nm左右有较显著的吸收峰，获取有机相的吸光度，即可进一步确定油脂样品中游离脂肪酸的含量。

本发明所提供的检测方法中，还可以包括：与标样对比，确定油脂样品中游离脂肪酸的含量。由于有机相中的吸光度与皂铜络合物的含量呈正比，即通过对样品溶解液的比色检测，可定量检测皂铜络合物的含量，而通过对形成的皂铜络合物的定量测定，就可定量检测油脂样品中游离脂肪酸的总含量。

本发明第二方面提供一种油脂酸价检测试剂盒，包括用于溶解样品的有机溶剂、染色液，所述染色液选自包括吡啶的铜盐水溶液，所述染色液的pH值为6.8～7.5，染色液中吡啶摩尔数与染色液中铜离子摩尔数之比为1：1～3。

本发明所提供的油脂酸价检测试剂盒中，有机溶剂可以是烷基取代的苯类溶剂、C8～C16的直链烷烃类溶剂和C6～C12的环烷烃类溶剂，所述烷基取代的苯类溶剂可以是包括但不限于甲苯、邻二甲苯、间二甲苯、对二甲苯、乙苯、邻二乙苯、对二乙苯、间二乙苯、丙苯、异丙苯、1,2,4-三甲苯、1,2,3-三甲苯、1,3,5-三甲苯、壬烷、癸烷、十一烷、十二烷、十三烷、十四烷、十五烷、十六烷、环己烷、环辛烷、环癸烷、环十二烷等中的一种或多种的组合，优选可以是包括但不限于甲苯、邻二甲苯、间二甲苯、对二甲苯、乙苯等中的一种或多种的组合，更优选可以是包括但不限于甲苯和/或邻二甲苯等，更优选可以是包括但不限于甲苯等。

本发明所提供的油脂酸价检测试剂盒中，所述染色液的pH值通常可以为6.8～7.5、6.8～6.9、6.9～7.0、7.0～7.1、7.1～7.2、7.2～7.3、7.3～7.4、或7.4～7.5，在本发明一具体实施例中，所述染色液的pH值≥6.8且＜7.5，优选为≥7.0且＜7.5。所述染色液中吡啶摩尔数与染色液中铜离子摩尔数之比可以为1～3、1～2.5、1～1.5、1.5～2、2～2.5、或2.5～3。在本发明一具体实施例中，所述染色液中吡啶摩尔数与染色液中铜离子摩尔数之比≥1且＜3，优选为≥1且＜2.5，更优选为≥2且＜2.5。

本发明所提供的油脂酸价检测试剂盒中，所述染色液中还可以包括缓冲体系。所述染色液中缓冲盐的浓度可以为0.05～0.1mol/L、0.1～0.3mol/L、0.3～0.5mol/L、0.5～1mol/L、1～1.5mol/L、1.5～2mol/L、2～2.5mol/L、或0.05～2.5mol/L。在本发明一具体实施例中，所述染色液中缓冲盐的浓度为0.05～2.5mol/L，优选为0.5～2mol/L，更优选为1～2mol/L。所述缓冲液中，缓冲盐所构成的缓冲溶液体系可以是包括但不限于C1～C5羧酸及其相应的水溶性盐体系，甲酸/甲酸锂、乙酸/乙酸锂体系、丙酸/丙酸锂体系、丁酸/丁酸锂体系、异丁酸/异丁酸锂体系、戊酸/戊酸锂体系、异戊酸/异戊酸锂体系、甲酸/甲酸钠、乙酸/乙酸钠体系、丙酸/丙酸钠体系、丁酸/丁酸钠体系、异丁酸/异丁酸钠体系、戊酸/戊酸钠体系、异戊酸/异戊酸钠体系、甲酸/甲酸钾、乙酸/乙酸钾体系、丙酸/丙酸钾体系、丁酸/丁酸钾体系、异丁酸/异丁酸钾体系、戊酸/戊酸钾体系、异戊酸/异戊酸钾体系等中的一种或多种的组合。

本发明所提供的检测方法中，本领域技术人员可选择合适的染色液与样品溶解液的使用比例，例如，染色液与样品溶解液的重量比例范围可以为0.01～2、0.01～0.1、0.1～0.3、0.3～0.5、0.5～1、或1～2。

本发明所提供的检测方法中，还可以包括显色液。所述显色液中通常包括指示剂，所述指示剂可以是包括但不限于吡啶偶氮萘酚类指示剂、吡啶偶氮苯酚类指示剂、噻唑偶氮萘酚类指示剂或噻唑偶氮苯酚类指示剂中的一种或多种的组合，更具体可以是包括但不限于1-(2-吡啶偶氮)-2-萘酚、1-(2-噻唑偶氮)-2-萘酚、4-(2-吡啶基偶氮)-1,3-苯二酚、4-(2-噻唑基偶氮)-1,3-苯二酚中的任一种或多种的组合，溶剂为水、甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、异丁醇、丙酮、四氢呋喃、二甲基亚砜、甲酸、乙酸、丙酸中一种或多种的组合。

本发明发明人通过对皂铜比色反应的两相——水相染色液和有机相样品溶解液的组成和配方的改进，在不使用苯的前提下，使皂铜比色的强度得到明显的改善。甚至可接近于或达到以苯作为样品溶解液时的显色强度，同时还提高了显色的稳定性，及降低配制成本和技术难度。

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

须知，下列实施例中未具体注明的工艺设备或装置均采用本领域内的常规设备或装置。

此外应理解，本发明中提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还可以存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以插入其他方法步骤，除非另有说明；还应理解，本发明中提到的一个或多个设备/装置之间的组合连接关系并不排斥在所述组合设备/装置前后还可以存在其他设备/装置或在这些明确提到的两个设备/装置之间还可以插入其他设备/装置，除非另有说明。而且，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为鉴别各方法步骤的便利工具，而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容的情况下，当亦视为本发明可实施的范畴。

实施例1

在一定量的0.25mol/L的铜盐(以铜离子计)的水溶液中添加不同量的吡啶，使最终的溶液中吡啶分子的摩尔数与铜离子摩尔数之比分别为1、2、3和4，最后用10％氢氧化钠溶液和乙酸，将溶液的pH调节到6.10～6.20，再分别以此为染色液与0.2mg/mL浓度的油酸异辛烷溶液进行皂铜比色反应(传统染色液的配制方法：在0.25mol/L的铜盐(以铜离子计)水溶液中，一边搅拌，同时一边逐滴滴加吡啶，直到溶液的pH值达到6.10～6.20)。检测结果如表1所示：

表1

由表1的实验数据可知，当吡啶分子的摩尔数与铜离子摩尔数之比大于等于3时，完全抑制了铜离子与脂肪皂的络合反应。

此外，本发明还做了另一个试验，按传统方法配制染色液，但在此同时，按照质量差法，测定在将染色液的pH调节到6.10～6.20时，所添加的吡啶的总量，进一步计算所添加的吡啶摩尔数和染色液中铜离子摩尔数的比例。最后发现添加的吡啶摩尔数与染色液中铜离子摩尔数之比为2.2～2.4。

综上所述，在配制染色液时，添加吡啶量与染色液的pH值无关，即此时无需精确控制染色液的pH值到6.10～6.20。只要精确控制添加吡啶的摩尔数与染色液中铜离子摩尔数的比值在一定范围。这个比值范围为[1，3)，优选为[1，2.5)。

实施例2

在一定量的0.25mol/L的铜盐(以铜离子计)的水溶液中添加一定量的吡啶，使其中铜离子的摩尔数与吡啶分子的摩尔数之比为1：2左右，然后逐滴滴加10％的氢氧化钠溶液来升高染色液的pH值，最后以pH升高后不同pH值的染色液与0.2mg/mL浓度的油酸异辛烷溶液进行皂铜比色反应(传统染色液的配制方法：在0.25mol/L的铜盐(以铜离子计)水溶液中，一边搅拌，同时一边逐滴滴加吡啶，直到溶液的pH值达到6.10～6.20)。检测结果如表2所示：

表2

从表2的数据可知，从pH6.0开始，随着染色液的pH值升高，皂铜比色反应的显色强度也逐步增强，但当达到pH6.8及其以上时，这种增强的辐度明显减弱，尤其的当达到pH7.0及其以上时，皂铜比色反应的显色强度达到最强，且不再随着pH值的升高而增强(当铜离子的摩尔数与吡啶分子的摩尔数之比为1：1左右时，也有此现象)。且当染色的pH值升高达7.5及其以上时，会有明显的氢氧化铜沉淀析出。所以，染色液的pH值优选范围为[6.8，7.5)，更优的范围为[7.0，7.5)。

此外，本发明在该研究中发现，由于二吡啶配位络合铜离子形成的络合物的稳定性优于一吡啶配位络合铜离子形成的络合物，所以在较高pH值(如pH7.0及以上)的溶液环境中，在染色液长期的室温储存中，铜离子的二吡啶配位络合物为主要成分的染色液比较稳定，不易有氢氧化铜的沉淀析出(详细研究数据见实施例3中的“6)”)，所以，染色液中添加吡啶的摩尔数与铜离子摩尔数的最优比值范围为[2,2.5)。但是需要指出的是，当染色液的pH值接近于7.0时，在皂铜显色反应时，染色液与样品溶解液之间会发生一定程度的乳化，且很难破乳。

实施例3

1)破乳作用

本发明研究发现，当染色液中含有0.2mol/L及更高浓度的缓冲盐时(水溶性的、低碳数弱酸性的羧酸)，皂铜反应时，能明显抑制染色液和样品溶解液之间的乳化作用，且染色液中缓冲盐的浓度越高，这种破乳作用就越快、越明显。

2)明显增强皂铜显色的强度

本发明研究发现，染色液中含有一定浓度上述的缓冲盐体系，会明显增加最终皂铜显色的强度。以下述实验为例，用不同浓度是乙酸/乙酸钠缓冲溶液(pH6.0～6.6)配制的染色液(其中含0.25mol/L的铜盐(以铜离子计)和0.5mol/L的吡啶，最后用少量浓氢氧化钠水溶液调节pH到7.0)，0.2mg/mL浓度的油酸异辛烷溶液进行皂铜比色反应(传统染色液的配制方法：在0.25mol/L的铜盐(以铜离子计)水溶液中，一边搅拌，同时一边逐滴滴加吡啶，直到溶液的pH值达到6.10～6.20)。结果如表3所示：

表3

从表3的实验结果可知，染色液中只要有0.05mol/L浓度的乙酸/乙酸钠，便可有明显增强皂铜显色强度的作用，且随着乙酸/乙酸钠的浓度的升高，其对皂铜显色的增强作用也不断加强，当乙酸/乙酸钠的浓度达到2.00mol/L时，这种显色增强作用达到最大，若再进一步的升高乙酸/乙酸钠缓冲液的浓度，皂铜显色的强度反而下降了。所以染色液中缓冲盐的浓度的选择范围为[0.05，2.50]mol/L，优选为[0.5，2.00]mol/L。更为重要的是，当染色液中的缓冲液浓度达到[1.00，2.00]mol/L的范围时，即便样品溶解液用烷烃类溶剂，相比于传统方法配制的染色液，其皂铜比色的显色强度增强了一倍多，虽然仍只是用苯作为样品溶解液时，显色强度的三分之二左右，但己能够一般食品酸价检测的灵敏度要求，所以更优选的，染色液中缓冲盐的浓度的范围为[1.00，2.00]mol/L。

3)增加皂铜比色对环境温度稳定性的作用

相比于传统方法配制的染色液，含有一定浓度的缓冲盐且pH控制在[6.8,7.5)范围内改进型的染色液，在皂铜比色反应中，环境温度对其检测结果的影响相对比较小。在不同的环境温度下，用1.00mol/L丙酸/丙酸锂缓冲溶液配制的改进后的染色液(其中含0.25mol/L的铜盐(以铜离子计)、0.5mol/L的吡啶和1.00mol/L丙酸/丙酸锂缓冲体系(pH6.0～6.6)，最后用少量浓氢氧化钠水溶液调节pH到7.4)，对0.2mg/mL浓度的油酸异辛烷溶液进行皂铜比色反应，同时用传统的染色液同样进行皂铜比色(传统染色液的配制方法：在0.25mol/L的铜盐(以铜离子计)水溶液中，一边搅拌，同时一边逐滴滴加吡啶，直到溶液的pH值达到6.10～6.20)，将两者检测结果进行比较。结果如表4所示：

表4

4)降低铜离子浓度的作用

在染色液是组成试剂中，各类铜盐试剂是最昂贵的，吡啶是毒性最大的。若能降低铜盐的浓度，不仅能明显降低染色液的生产成本，而且由于吡啶的添加浓度根据铜盐浓度确定的，从而也同步降低了吡啶的添加浓度，减少了有毒试剂用量。本发明研究发现，当染色液中的添加的缓冲盐浓度大于0.5mol/L时，此时一定程度降低染色液中铜盐的浓度，并不会明显降低最终皂铜反应的显色强度。而且在本发明上述选择的缓冲盐的浓度范围内，染色液中缓冲盐的浓度越大，在不会明显降低最终皂铜反应的显色强度的前提下，铜盐浓度可降低的幅度就越大。以下述实验为例，用两种浓度——0.5mol/L和2.5mol/L丁酸/丁酸钾缓冲溶液(pH6.0～6.6)配制改进后的染色液，其中的铜盐(以铜离子计)浓度以0.25mol/L为基准，呈不同幅度的降低，同时吡啶的浓度相应的不同幅度的降低，但其摩尔浓度始终为铜盐(以铜离子计)摩尔浓度的2倍，最后都用少量浓氢氧化钠水溶液调节pH到7.1，用0.2mg/mL浓度的油酸异辛烷溶液进行皂铜比色反应。(不同铜盐浓度的传统染色液的配制方法：用纯水为溶剂，以0.25mol/L铜盐(以铜离子计)浓度为基准，配制铜盐浓度呈不同幅度的降低的水溶液，同时一边搅拌，一边逐滴滴加吡啶，直到溶液的pH值达到6.10～6.20)。结果如表5所示：

表5

从表5的数据可知，当改进的染色液中丁酸/丁酸钾缓冲溶液的浓度为0.5mol/L时，铜离子的浓度最多可降低20％，而无明显使皂铜反应的显色强度降低；当改进的染色液中丁酸/丁酸钾缓冲溶液的浓度为2.5mol/L时，铜离子的浓度最多可降低80％，而无明显使皂铜反应的显色强度降低。

5)缓冲油脂样品中水溶性酸性物质的作用

本发明研究发现，当染色液中的添加的缓冲盐浓度大于0.5mol/L时，此时若被检测的油脂样品中含有微量的水溶性酸性物质(即使皂铜反应时使样品溶解液中含有微量的水溶性酸性物质)，并不会明显降低最终皂铜反应的显色强度。而且在本发明上述选择的缓冲盐的浓度范围内，染色液中缓冲盐的浓度越大，在不会明显降低最终皂铜反应的显色强度的前提下，可耐受油脂样品中水溶性酸性或碱性物质的浓度就越大。以下述实验为例，用两种浓度——0.5mol/L和2.5mol/L异丁酸/异丁酸钠缓冲溶液(pH6.0～6.6)配制改进后的染色液(其中含0.25mol/L的铜盐(以铜离子计)、0.5mol/L的吡啶，最后用少量浓氢氧化钠水溶液调节pH到7.2)，用含有不同浓度乙酸的0.2mg/mL浓度的油酸异辛烷溶液进行皂铜比色反应。(传统染色液的配制方法：在0.25mol/L的铜盐(以铜离子计)水溶液中，一边搅拌，同时一边逐滴滴加吡啶，直到溶液的pH值达到6.10～6.20)。结果如表6所示：

表6

由表6的数据可知，传统方法配制的染色液，当样品溶解液中含有0.02及其以上的乙酸时，皂铜反应的显色强度就出现了明显的下降，且样品溶解液中乙酸的浓度越大，皂铜显色强度就降低越大；当改进的染色液中含有0.5mol/L的异戊酸/异戊酸钠的缓冲盐时，样品溶解液中乙酸的浓度达到0.05％时，才会使皂铜显色强度出现明显的下降；而当改进的染色液中含有2.5mol/L的异戊酸/异戊酸钠的缓冲盐时，样品溶解液中乙酸的浓度要达到0.09％时，才会使皂铜显色强度出现明显的下降。

6)进一步提高染色液在长期贮存中的稳定性

如本发明在上文中所述，在较高pH值(如pH7.0及以上)的溶液环境中，染色液中当铜离子与吡啶分子的摩尔比为1：2时，在长期的室温储存过程中，染色液中铜离子比较稳定，不易形成氢氧化铜沉淀。若进一步的染色液中还含有0.5mol/L及其以上浓度的缓冲盐，在本发明所选择的缓冲盐浓度范围内，其稳定性会进一步的加强，在长期的室温储存过程中，基本不会形成氢氧化铜沉淀。以下述实验为例，配制五个不同配方的染色液各250mL，其中配方1的配制方法：用纯水配制的染色液，其中含0.25mol/L的铜盐(以铜离子计)、0.25mol/L的吡啶，最后用少量浓氢氧化钠水溶液调节pH到7.25；配方2的配制方法：用纯水配制的染色液，其中含0.25mol/L的铜盐(以铜离子计)、0.5mol/L的吡啶，最后用少量浓氢氧化钠水溶液调节pH到7.25；配方3的配制方法：用1.25mol/L的乙酸/乙酸锂(pH6.0～6.6)的缓冲盐溶液配制的染色液，其中含0.25mol/L的铜盐(以铜离子计)、0.5mol/L的吡啶，最后用少量浓氢氧化钠水溶液调节pH到7.25；配方4的配制方法：用1.25mol/L的乙酸/乙酸钠(pH6.0～6.6)的缓冲盐溶液配制的染色液，其中含0.25mol/L的铜盐(以铜离子计)、0.5mol/L的吡啶，最后用少量浓氢氧化钠水溶液调节pH到7.25；配方5的配制方法：用1.25mol/L的乙酸/乙酸钾(pH6.0～6.6)的缓冲盐溶液配制的染色液，其中含0.25mol/L的铜盐(以铜离子计)、0.5mol/L的吡啶，最后用少量浓氢氧化钠水溶液调节pH到7.25。将以上这五个配方的染色液共同在室温下静置30天后，分别用中速定性滤纸过滤，取得各其自的滤下物(析出的固体沉淀)，最后将滤下物烘干后称重，结果见表7。

表7

从表7的数据可知，在染色长期的室温储存时，在较高pH值(如pH7.0及以上)的溶液环境中，用纯水配制的染色液中铜离子与吡啶分子的摩尔比为1：2时，其储存的稳定性明显优于铜离子与吡啶分子的摩尔比为1：1时；进一步的用一定浓度的缓冲盐溶液配制的染色液，可进一步明显提升染色液的储存稳定性，且这种对储存稳定性的提升效果：钾盐最优，其次为钠盐，最次为锂盐。

实施例4

本发明专利研究发现，在皂铜反应中，若染色液仍采用传统配方(传统染色液的配制方法：在0.25mol/L的铜盐(以铜离子计)水溶液中，一边搅拌，同时一边逐滴滴加吡啶，直到溶液的pH值达到6.10～6.20)，同时样品溶解液采用低毒的苯的烷烃衍生类溶剂、C8～C16的直链烷烃类溶剂和C6～C12的环烷烃类溶剂，其显色的强度也会有不同程度的增强。主要选择甲苯、邻二甲苯、间二甲苯、对二甲苯、乙苯、邻二乙苯、对二乙苯、间二乙苯、丙苯、异丙苯、1,2,4-三甲苯、1,2,3-三甲苯、1,3,5-三甲苯、壬烷、癸烷、十一烷、十二烷、十三烷、十四烷、十五烷、十六烷、环己烷、环辛烷、环癸烷、环十二烷。其中优选甲苯、邻二甲苯、间二甲苯、对二甲苯和乙苯，更优选甲苯和邻二甲苯，最优选甲苯。以不同的溶剂为样品溶解液分别配制0.2mg/mL浓度的油酸溶液，采用传统配方的染色液对都它们分别进行皂铜比色测定，结果见表8、表9和表10。

表8

表9

表10

从表8、表9和表10的数据可知，即便采用传统配方的显色液，若样品溶解液采用甲苯，皂铜比色的显色强度可达采用烷烃为样品溶解时的2倍，即采用苯为样品溶解时的三分之二。若样品溶解液采用邻二甲苯，则显色强度可接近于这个水平。

实施例5

本发明专利研究发现，在皂铜反应中，若染色液仍采用上文所述的改进配方，同时样品溶解液采用上文所述的某些种类苯的烷烃衍生类溶剂、C8～C16的直链烷烃类溶剂和C6～C12的环烷烃类溶剂，其显色的强度可以接近或达到，甚至超过以苯为样品溶解液的传统配方染色液的最佳皂铜比色显色强度。例如以不同的溶剂为样品溶解液分别配制0.2mg/mL浓度的油酸溶液，采用改进的染色液(其中含0.25mol/L的铜盐(以铜离子计)、0.5mol/L的吡啶，1.5mol/L浓度的丙酸/丙酸锂缓冲盐(pH6.0～6.6)，最后用少量浓氢氧化钠水溶液调节pH到7.3)，传统染色液的配制方法：在0.25mol/L的铜盐(以铜离子计)水溶液中，一边搅拌，同时一边逐滴滴加吡啶，直到溶液的pH值达到6.10～6.20。对都它们分别进行皂铜比色测定，结果见表11、表12和表13：

表11

表12

表13

从表11、表12和表13的数据可知，在采用改进配方的显色液时，若样品溶解液采用甲苯和邻二甲苯，皂铜比色的显色强度可超过采用(传统配方染色液+苯)的皂铜比色显色强度的；若样品溶解液采用间二甲苯、对二甲苯和乙苯，皂铜比色的显色强度可接近或达到采用(传统配方染色液+苯)的皂铜比色显色强度的水平。

实施例6

1)进一步增强显色的强度

本发明专利研究发现，在皂铜反应后，将少量的样品溶解液加入含有4-(2-噻唑基偶氮)-1,3-苯二酚指示剂的强化显色液中，可进一步增强皂铜反应的最终检测的吸光度强度。例如，以不同油酸浓度的样品溶解液(环己烷)进行皂铜显色反应后，分别将0.05mL的皂铜反应后的样品溶解液加入5mL的强化显色液(以乙醇为溶剂，含0.02mg/mL4-(2-噻唑基偶氮)-1,3-苯二酚指示剂，用甲酸调节pH到1.50)，再分别在540nm波长检测强化显色液的吸光度，结果见表14。

表14

从表14的数据可知，皂铜显色反应后，经过强化显色液进一步的增强显色，最终显色的强度被增强了数倍，虽然最佳吸收波长发生了变化，但其吸光强度依然随着样品溶解液中游离脂肪酸浓度的增加而增强。

2)仅通过肉眼对色泽比较，进行酸价的定性、判定量检测

本发明专利研究发现，在皂铜反应后，将少量的样品溶解液加入含有1-(2-吡啶偶氮)-2-萘酚指示剂的强化显色液中，可进一步增强皂铜反应的最终检测的吸光度强度。以至于最终的检测可无需检测吸光度，可直接通过肉眼对色泽的比较，来进行半定量或定性的测定酸价。例如，以不同油酸浓度的样品溶解液(正庚烷)进行皂铜显色反应后，分别将0.25mL的皂铜反应后的样品溶解液加入20mL的强化显色液(以异内醇：水＝1：1为溶剂，含0.04mg/m1-(2-吡啶偶氮)-2-萘酚指示剂和0.1mol/L的乙酸/乙酸钠缓冲液，用乙酸酸调节pH到4.50)，最后用肉眼比较各自的红色强弱，结果见图1，其中，样品溶解液中油酸浓度(从A到E，mg/mL)：0、0.10、0.20、1.0、3.0。

综上所述，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。