一种云杉种子表面灭菌方法及灭菌用培养皿

摘要

本发明属于种子处理领域，具体涉及一种云杉种子的表面灭菌技术。具体技术方案为：使用20％～30％，w/v，的H2O2溶液浸泡种子5～30min。使用特定培养皿进行灭菌操作，所述培养皿至少包括两层，其中一层为可盛放待灭菌种子的处理层，各层间可控进行液体流通。本发明首次提供了一种可用于云杉种子表面灭菌方法，灭菌效果高达100％；并基于该方法提供了一种种子萌芽方法，最高发芽率也高达100％。为了更便捷、准确地进行灭菌，本发明还提供了一种培养皿，可同时进行多梯度、多重复灭菌试验，有效提高了灭菌效果。

说明书

技术领域

本发明属于种子处理领域，具体涉及一种云杉种子的表面灭菌技术。

背景技术

为了研究云杉种子内生菌对种子萌发和幼苗定植的影响，首要解决的问题是通过对种子表面微生物灭菌来获取种子内生菌。但由于种子表面灭菌技术的局限性，相同的灭菌剂、灭菌浓度以及灭菌时间对不同种子表面的微生物会有不同的灭菌效果。对于云杉种子，目前较多的是采用0.3％的K

同时，现有的灭菌用设备(培养皿等)需要分次进行人为操作，难以同时间进行一批试验，分次操作也增加了种子被杂菌污染的可能性，降低了灭菌效果。

因此，亟需一种能将云杉种子表面微生物杀灭干净的技术。

发明内容

本发明的目的是提供一种云杉种子的表面灭菌和萌发的方法及装置。

为实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案是：一种云杉种子表面灭菌的方法，使用20％～30％，w/v，的H

优选的，使用特定培养皿进行灭菌操作，所述培养皿至少包括两层，其中一层为可盛放待灭菌种子的处理层，各层间可控进行液体流通。

优选的，所述培养皿包括两层，另一层为可盛放液体的废液层，废液层位于处理层下方，处理层与废液层间设置第一液体流通结构，所述第一液体流通结构包括设置于处理层下方的连通排废板，所述处理层上贯穿设置至少一个上层第一排废孔，所述连通排废板上对应设置至少一个下层第二排废孔，连通排废板可相对于处理层旋转，使上层第一排废孔旋转至与下层第二排废孔对齐，实现废液从处理层流入废液层中。

相应的，所述的云杉种子表面灭菌后种子萌芽方法，将灭菌后的种子置于PDA培养基或LB培养基上，在30℃的黑暗环境保持5～7天，随后在15℃，12h光照、12h黑暗交替环境中保持5～20天，进行萌芽。

相应的，一种可用于种子灭菌的培养皿，至少包括两层，其中一层为可盛放待处理物料的处理层，各层间可控进行液体流通。

优选的，包括两层，另一层为可盛放液体的废液层，废液层位于处理层下方，处理层与废液层间设置第一液体流通结构，所述第一液体流通结构包括设置于处理层下方的连通排废板，所述处理层上贯穿设置至少一个上层第一排废孔，所述连通排废板上对应设置至少一个下层第二排废孔，连通排废板可相对于处理层旋转，使上层第一排废孔旋转至与下层第二排废孔对齐，实现废液从处理层流入废液层中。

优选的，所述培养皿内、水平方向设置为相互独立的数格，每层对应设置为数格，连通排废板可同时调控每格内的液体释放。

优选的，所述处理层与连通排废板间设置数块独立排废板，所述独立排废板的数量与培养皿内设置的格数相等；所述独立排废板可相对于处理层和连通排废板旋转；

所述处理层上贯穿设置上层第一、第二排废孔，所述独立排废板上对应贯穿设置中层第一、第二排废孔，所述连通排废板上对应贯穿设置下层第一、第二排废孔，各孔均设置至少一个；

初始状态时，上层第一排废孔与中层第一排废孔对齐，与下层第一、二排废孔均错开，上层第二排废孔与下层第一排废孔对齐，与中层第一、二排废孔均错开；

一块独立排废板可相对于处理层和连通排废板旋转至中层第二排废孔与上层第二排废孔和下层第一排废孔对齐，实现处理层对应格内的液体排入废液层的对应格内，

连通排废板可相对于处理层和独立排废板旋转至下层第二排废孔与上层第一排废孔和中层第一排废孔对齐，实现处理层各格内的液体均排入废液层内。

优选的，培养皿包括两层，另一层为可盛放液体的液体层，液体层位于处理层上方，处理层与废液层间设置第二液体流通结构，所述第二液体流通结构设置方式与第一液体流通结构相同，或第二液体流通结构上的各排液孔与第一液体流通结构上的各排废孔镜像设置。

优选的，培养皿包括三层，从上至下依次为液体层、处理层和废液层，液体层与处理层间通过第二液体流通结构实现液体的可控流通，处理层与废液层间通过第一液体流通结构实现液体的可控流通。

本发明具有以下有益效果：本发明首次提供了一种可用于云杉种子表面灭菌的方法，灭菌效果高达100％，且该灭菌方法不会影响种子活力；并基于该方法提供了一种种子萌芽方法，最高发芽率也高达100％。为了更便捷、准确地进行灭菌，本发明还提供了一种培养皿，可同时进行多梯度、多重复灭菌试验。事实上，本发明提供的培养皿也可用于其他需要多梯度、多重复的试验上。

附图说明

图1为本发明的结构示意图；

图2为图1的A-A视图(左视剖面图)；

图3为本发明提供的培养皿盖上培养皿盖后的外壳俯视图；

图4为本发明连通排废板俯视图；

图5为本发明独立排废板俯视图；

图6为本发明处理层俯视图；

图7为一种实施方式下连通排液板俯视图；

图8为优选实施方式下连通排液板俯视图；

图9为独立排液板俯视图；

图10为液体层俯视图。

具体实施方式

本发明提供了一种云杉种子的表面灭菌和萌发的方法，具体包括如下步骤：

1、云杉种子筛选：将采收的成熟云杉种子浸泡在盛有自来水的玻璃烧杯中，20h后去除浮在表面的种子并洗去水中杂质。

2、种子风干：将漂洗后的云杉种子在室温下阴干，再转移至4℃的冰箱中保存。

3、种子表面灭菌：挑选出比较饱满的种子进行表面灭菌处理，灭菌方法为：使用20％～30％，w/v，的H

4、将灭菌后的种子置于PDA培养基或LB培养基上，在20～30℃的黑暗环境保持5～7天，随后在15℃，12h光照、12h黑暗交替环境中保持5～20天，进行萌芽。

本发明在进行种子灭菌和萌芽时，发明人发现，使用现有培养皿进行操作，加液、移液过程会花一定时间，没办法同时间进行一批试验，只能分次进行，非常耗时，而且分次进行时，难免引入不可避免的操作误差，影响试验结果。另外，本发明的目的在于灭菌，而不断打开培养皿盖加液、移液的过程，增加了种子与外界接触的可能性，从而增加了杂菌污染的可能性，难以获得准确结果，也会影响灭菌效果。为此，发明人还配套提供了一种培养皿，可在同一培养皿内可控的同时进行一批次试验，且可经由简单操作即自动实现加液、移液，无需打开培养皿盖，极大降低了试验难度，提高了灭菌效果。

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。为了便于展示，图示中的培养皿分区为4部分，实践中可以根据需要设置区间数量。如果分区较多，还可以同时设置重复，或者空白处理组。显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

在本发明的描述中，需要理解的是，术语“纵向”、“横向”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。

如图1～10所示，一种培养皿，至少包括两层，其中一层为可盛放待处理物料的处理层50，各层间可控进行液体流通。

当培养皿只包括两层时，另一层可以为可盛放液体的废液层10，也可以为液体层80。液体层80位于处理层上方，废液层10位于处理层 50下方。为避免赘述，以下以培养皿同时设置三层为例进行介绍。当同时设置三层时，培养皿从上到下依次为：液体层80、处理层50和废液层10，液体层80与处理层50间通过第二液体流通结构实现液体的可控流通，处理层50与废液层10间通过第一液体流通结构实现液体的可控流通。进行试验时，将待处理种子或其它物料放在处理层50，再放上液体层80，在液体层80内装入待处理种子或其它物料的液体(例如特定浓度的双氧水)。通过第二液体流通结构，使液体层80的液体进入处理层50，处理结束后，再通过第一液体流通结构，使处理层50内用过的废液排入废液层10。

一种实施方式下，所述第一液体流通结构包括设置于处理层50下方的连通排废板30，所述处理层50上贯穿设置至少一个上层第一排废孔52，所述连通排废板30上对应设置至少一个下层第二排废孔32，连通排废板30可相对于处理层50旋转，使上层第一排废孔52旋转至与下层第二排废孔32对齐，实现废液从处理层50流入废液层10中。图示中，为示意清楚，各排废孔均只设置了一个，实践中可以根据需要设置为数个。应当理解的是，各排废孔的大小小于处理层50盛放物料(种子)的最小宽度(直径)。

优选的方案为：所述培养皿内、水平方向设置为相互独立的数格。即：每层对应设置为数格，连通排废板30可同时调控每格内的液体释放。格子的设置方式为：处理层50、废液层10内部分别设置数块朝上延伸的处理层隔板51和废液层隔板11，处理层隔板51和废液层隔板 11分别将处理层50和废液层10分为相互独立、液体和物料互不接触的数个区间。处理层隔板51和废液层隔板11横截面形状相同，划分的数个区间形状、大小也相同且对应；处理层50一个区间内的液体可准确地落入废液层10的对应区间内。当需要将废液层10中的液体完全隔离开时，例如液体存在一定的挥发性，或对废液也有一定的研究需求时，可以将处理层隔板51和废液层隔板11设置为与处理层50、废液层10 的边缘等高，或设置为保证处理层隔板51、废液层隔板11顶部挨着上一层结构，从而在培养皿完全盖好后，形成各层中各格的顶部也不互通的区间。一般情况下，对废液层10内的液体没有那么严格的要求，故图示中示意的是处理层隔板51、废液层隔板11顶部没有与上部完全接触的情形。这样也更便于后续旋转的进行。液体层80内的液体层隔板 81与处理层隔板51和废液层隔板11的设置方式相同，不再赘述。需要说明的是，液体层80和处理层50一般对液体隔离的要求更高，其隔板也倾向于设置得更高。

应当理解的是，这种方式下，培养皿设置为多层、多格，每个格子相互独立，以在同一培养皿中同时进行不同试验。

这种设置方式下，连通排废板30只能实现同时将处理层50的废液排入废液层10中。但实践中，有时需要进行不同处理时间的试验。因此，为了实现各格间的液体在不同时间分布排入废液层10，更优选的方案为：所述处理层50与连通排废板30间设置数块独立排废板40，所述独立排废板40的数量与培养皿内设置的格数相等；所述独立排废板40 可相对于处理层50和连通排废板30旋转。所述处理层50上贯穿设置上层第一、第二排废孔52、53，所述独立排废板40上对应贯穿设置中层第一、第二排废孔42、43，所述连通排废板30上对应贯穿设置下层第一、第二排废孔31、32，各孔均设置至少一个。

初始状态时，上层第一排废孔52与中层第一排废孔42对齐，与下层第一、二排废孔31、32均错开，上层第二排废孔53与下层第一排废孔31对齐，与中层第一、二排废孔42、43均错开。当需要将处理层50 特定格内的废液排入废液层10的对应格时，可旋转该格位置范围内对应的一块独立排废板40，将其相对于处理层50和连通排废板30旋转至中层第二排废孔43与上层第二排废孔53和下层第一排废孔31对齐，从而实现处理层50对应格内的液体排入废液层10的对应格内。当需要同时将处理层50所有格子里的废液均排入废液层10时，可旋转连通排废板30，将其相对于处理层50和独立排废板40旋转至下层第二排废孔 32与上层第一排废孔52和中层第一排废孔42对齐，从而实现处理层 50各格内的液体均排入废液层10内。

处理层50与废液层10间设置第二液体流通结构，所述第二液体流通结构设置方式与第一液体流通结构相同，或第二液体流通结构上的各排液孔与第一液体流通结构上的各排废孔镜像设置。第二液体流通结构中，独立排液板70与第一液体流通结构上的独立排废板30对应，连通排液板60与第一液体流通结构上的连通排液板30对应。

为了实现独立排废板40和连通排废板30的旋转，及独立排液板70 与连通排液板60的旋转，一种实施方式为：设置中心柱20。废液层隔板11、处理层隔板51、液体层隔板81均对称设置，且在培养皿中心位置合围成一个上下对齐的孔径，以便容纳中心柱20。中心柱20插入废液层隔板11合围成的圈内，但不贯穿废液层11底部。中心柱20与废液层隔板11合围成的圈间隙配合，间隙较小，中心柱20可插稳、立在废液层内，不会相对于废液层左右晃动。中心柱20位于圈内的部分为光滑表面，与相对于废液层进行自转。

中心柱20向上延伸，穿过连通排废板30。如图4所示，中心柱20 在连通排废板30内的部分，外表面设置为第一花键21。第一花键21横截面是一个圆的一部分，具体包括一个优弧，优弧上一侧水平，一侧为凸起，水平长度大于横截面圆的一半，凸起朝向背离水平的方向倾斜。连通排废板30中心的开口形状与第一花键21形状对应，也是一个圆的一部分，包括一个优弧，优弧上一侧水平，一侧为凸起。其水平与第一花键21的水平对应，长度小于横截面圆的一半；凸起部分大于第一花键21的凸起，可容纳第一花键21的凸起在内部运动。连通排废板30 中心的开口大小大于第一花键21。以图4为例，第一花键21向右侧旋转时，第一花键21的水平处与连通排废板30的水平处接触、抵住，带动连通排废板30一起向右旋转，旋转至下层第二排废孔32与上层第一排废孔52对齐，实现排液。第一花键21向右旋转时，第一花键21的凸起可在连通排废板30中心开口的凸起内运动且不与连通排废板30接触。第一花键21的凸起可在连通排废板30中心开口的凸起内运动且不与连通排废板30接触的旋转角度，以各排废孔与排液孔的设置位置关系相关，图示中，可在不接触下最大旋转为90°。第一花键21的设置，不仅可以实现单向旋转排液和不排液，也可以为连通排废板30的组装实现快速定位，组装时，将连通排废板30水平处与第一花键21水平安装为平行即可(接近接触的状态，图中为了示意清楚，扩大了一定连通排废板30中心开口的大小)。

中心柱20继续向上延伸，穿过独立排废板40。独立排废板40在培养皿最里端位置与中心柱20不接触，中心柱20在旋转中也不会与各独立排废板40接触，中心柱20的旋转也不会带动独立排废板40运动。独立排废板40另一端伸出培养皿外边缘，在培养皿外边缘形成独立排废拨块41。如图5所示，向左拨动独立排废拨块41，带动对应的独立排废板40绕中心柱20旋转，至中层第二排废孔43旋转至与上层第二排废孔53对齐，实现单格废液排放。为更便捷地定位和组装培养皿，独立排废板40上、靠近独立排废拨块41一侧，设置第一深度限位块42，限定独立排废板40可插入培养皿中的深度，实现独立排废板40在深度上的定位。同时如图2所示，在处理层50外表面、培养皿外侧，朝向独立排废板40设置第一水平限位块52，将独立排废板40紧贴第一水平限位块52水平放在连通排废板30上，从而实现水平位置上的定位。通过第一深度限位块42和第一水平限位块52，将一块独立排废板40放在可保证不排液并实现旋转后排液的初始位置(即图5中，独立排废板40 的实线位置)。独立排液板70和液体层80上也按相同方式分别设置独立排液拨块71、第二深度限位块72和第二水平限位块82。

如图6所示，中心柱20继续向上延伸，穿过处理层50。处理层50 中间各处理层隔板51合围成的圆圈与中心柱20间隙配合，中心柱20 可在期间自转且不会带动处理层50随之运动。

当培养皿设置为三层时，一般是先将液体层80的液体排出，再将处理层50中的液体排出；即先启动第二液体流通结构，再启动第一液体流通结构。在只设置一根中心柱20的情况下，可以有多种方式达到上述目的。可以将中心柱20在第二液体流通结构中的第二花键22设置得与第一花键21形状相同，连通排液板60的中心开口也与连通排废板 30的中心开口形状、大小相同，旋转中心柱20，连通排液板60和连通排废板30同时转动。将各排废孔、排液孔顺次设置，朝向一个方向旋转一定角度时，连通排液板60上的各排液孔对齐，连通排废板30上的各排废孔错开，继续朝该角度旋转，连通排液板60上的各排液孔错开，连通排废板30上的各排废孔对齐。这种实施方式下，中心柱20顶面与液体层隔板81上表面对应设置刻度，实现中心柱20的快速定位组装及准确旋转。

还可以的实施方式为，如图7所示，将第二液体流通结构中的第二花键22设置为与连通排液板60中心开口完全对应的形状，第二花键22 的任何旋转运动，都会带动连通排液板60随之进行同向旋转。这种设置方式下，向左侧旋转中心柱20，连通排液板60旋转，实现排液，而连通排废板30不随着中心柱20的运动而运动。随后再向右旋转中心柱 20，连通排废板30和连通排液板60一起随之旋转，实现排废。

更优选的方式为，如图8所示，将第二液体流通结构中的第二花键 22设置为与第一花键21镜像的结构，连通排液板60中心开口形状也与连通排废板30中心开口形状镜像。这种设置方式下，向左旋转中心柱 20，只带动连通排液板60旋转，实现排液；向右旋转中心柱20，只带动连通排废板30旋转，实现排废。

应当理解的是，无论如何设置中心柱20，各排废孔、排液孔的位置也应当随之调整变动，以实现：初始状态，各排废孔、排液孔错开，液体维持；旋转后，需要的排废孔或排液孔对齐，液体排入下一层。另外，各排液孔、排废孔也并非只能如图示一样设置在培养皿1/8的位置，图示设置只是为了示意清楚，实践中可以根据需要选择位置。

更优选的方式为，还包括培养皿盖90，可将整个培养皿盖住。所述中心柱20向上贯穿、穿出培养皿盖90上表面，所述独立排废拨块41、独立排液拨块71在水平面上分别横向穿出培养皿盖90。为了便于组装，所述培养皿盖90的纵向上设置为4根柱子，而非完整的圆筒，4根柱子间，分别露出各块独立排液板70、独立排废板40，并为其留下充足的在水平方向上转动的空间。为了更好地固定整个培养皿结构，所述液体层80上端面向上延伸，深入培养皿盖90内部，培养皿盖90内表面对应设置一圈容纳液体层80上表面的凹槽。以便将液体层80限位固定，也使得组装好的培养皿成为一个整体。

培养皿的使用方法为：将中心柱20插入废液层10中心，再从中心柱20上方放下连通排废板30，再根据各限位块的位置，放入各独立排废板40，再从中心柱20上方放下处理层50。如果处理层50待处理物料，可以一并高温高压消毒，可以在此时将物料放入处理层50一并消毒。如果不能高温高压消毒，则将组装到一半的培养皿及其他培养皿部件高温高压消毒，随后在超净台中进行后续组装。将物料放入处理层50 后，再按相同方式依次组装连通排液板7、60、独立排液板70和液体层 80。如果物料和液体层80中的液体均可经高温高压消毒，则可一次性将物料和液体装入培养皿中，盖上培养皿盖90，消毒后直接在超净台进行试验即可，极大降低了中间的操作环节。也可以在超净台中完成装液，再盖上培养皿盖90，进行试验。

下面展示使用所述培养皿进行云杉种子灭菌的具体实施例。

实施例

1、2019年10月20日在理县采集成熟的云杉种子1kg，将采收的云杉种子浸泡在盛有自来水的玻璃烧杯中，20h后去除浮在表面的种子和水中杂质。

2、种子风干：将漂洗后的云杉种子在室温下阴干，装入袋中再转移至4℃的冰箱中保存。

3、活力测定：配制浓度为0.75％的TTC(2，3，5-氯化三苯基四氮唑)溶液，将云杉种子剥皮并用解剖刀在远离胚根部位切除少部分种子组织(包括子叶等)，随后浸泡在新的浓度为0.75％的TTC溶液中，30℃黑暗条件下反应2h后，于体视显微镜下观察种子活力，以胚根和一半以上子叶被染成红色视为有生活力的种子。

4、萌发验证：将活力测定筛选后的种子经0.5％高锰酸钾溶液浸泡 15min，然后播种在盛有脱脂棉的培养皿上，并施以超纯水，保持脱脂棉湿润状态，分别于一周和15天后统计其萌发率，验证上述种子活力。选择经活力筛选的同一批种子中较饱满的种子，进行种子灭菌。需要说明的是，活力筛选并非种子灭菌或萌芽的必经环节，只是本实施例的验证环节，证明使用的种子具有活力，且经灭菌处理后仍然保持相当的活力(萌芽率高)。

5、培养基与工具灭菌：配制LB(Luria-Bertani)培养基(胰蛋白胨10g、酵母粉5g、NaCl 10g、琼脂粉15g、1000mL水、pH＝7.0)和PDA (Potato Dextrose Agar)培养基(马铃薯200g、葡萄糖20g、水1000mL、 20g琼脂、自然pH)，分别分装到规格为500mL的三角瓶中，每个三角瓶分装200mL。将各培养基及试验用培养皿等器皿均高压(121MP)灭菌 30分钟。灭菌完成后将包裹的工具放入烘箱65℃烘干备用，其中培养基与无菌水放置室温备用。

6、以下操作均在无菌环境中进行：挑选出饱满的种子，每个实施例设置60粒种子，每个实施例设置10个重复。将消毒液放置在液体层 80，种子放置在处理层50中(在超净台中完成组装)，在培养皿盖90 上用记号笔对每格进行标记。同时旋转中心柱20，使消毒液从液体层进入处理层50的对应格内，处理到特定时间后，旋转中心柱20或旋转独立废液排放板40，排除废液。各实施例用消毒液及消毒时间如表1所示。

表1各实施例的消毒方式一览表

7、按上述方式分别消毒完成后，打开培养皿，取出各格中的种子，用无菌纸吸干种子表面水分。再分别播种到LB培养基和PDA培养基上，使用封口膜将已播种的培养皿封住，最后将培养皿放入30℃、黑暗条件下的人工气候箱中培养，分别于3天、6天后观察LB、PDA培养基上种子的污染情况，统计无菌率。无菌率(％)＝无污染种子数/供试种子数×100％。无污染种子，指种子周围没有长出肉眼可见的微生物的种子。

然后将人工气候箱参数设置为15℃，12h光照、12h黑暗交替进行，于7天和15天后分别观察种子的萌发情况，统计发芽率。发芽率(％) ＝发芽数/供试种子数×100％。

并同时设置对照组。对照组一，不做任何处理，种子风干后直接萌发。对照组二，种子风干后，用自来水中浸泡7h，再用无菌双蒸水浸泡漂洗3次，每次5min。

需要说明的是，上述培养皿的底层(废液层10)清洗、消毒后，可装入培养基后进行萌芽操作。

8、结果如表2、3所示。其中，“0.00”指种子全部被污染、种子全部未萌芽。因对照组一、二也是在培养基中进行，与在脱脂棉中萌芽相比，微生物更容易快速生长，将种子吞没、覆盖，甚至使之腐烂，从而阻止种子萌芽。需要说明的是：并不是所有的微生物都阻碍发芽,因此，抑菌率(无菌率)并不与萌发率间呈线性关系；同时，处理时间与萌发率也并非呈线性关系，处理时间过长，在杀灭微生物的同时，也可能杀灭植物本身的细胞，从而反而降低萌发率。

表2云杉种子表面的无菌率效果

表3云杉种子的萌发率效果

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形、变型、修改、替换，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。