一种用于半胱氨酸检测的复合物的合成方法、复合物及应用

摘要

本发明公开了一种用于半胱氨酸检测的复合物的合成方法，将浓度为50～100mmol/L的谷胱甘肽溶液和浓度为20～30mmol/L的氯金酸溶液按照1‑2：4‑5体积比混合，搅拌混匀，得到混合溶液；向混合溶液中加入0.5～2mol/L的强碱溶液，将混合液置于35‑39℃水浴中连续磁力搅拌0.5‑2h；置于70～90℃油浴锅中连续磁力搅拌18‑30h，将所得溶液室温下连续磁力搅拌至冷却至室温；所得溶液放入1800‑2200Da透析袋中，连续透析20‑30h，每7‑9h更换透析液，得到Au(I)‑GSH复合物。另外还公开了Au(I)‑GSH复合物以及Au(I)‑GSH复合物‑Ag+体系的两种用途。本发明解决了现有测试时间较长、误差较大、测试方法繁琐以及检测时间长等问题，是一种简便、快速、高灵敏度的生物传感器检测方法。

说明书

技术领域

本发明属于生物传感技术领域，具体涉及一种半胱氨酸含量检测的复合物合成方法，以及其在检测中的应用。

背景技术

半胱氨酸(Cys)对细胞功能至关重要，如肽和蛋白质合成、解毒和代谢。Cys的异常水平与一系列症状和疾病密切相关。Cys缺乏会导致造血功能下降、水肿、银屑病、生长迟缓以及肝损伤，而过量的Cys也会导致神经系统疾病，如阿尔茨海默氏病和帕金森氏病。因此，Cys的精确识别和含量测定对于相关的早期诊断和预后非常重要。目前已经开发了多种分析方法来监测Cys，如质谱(MS)，高效液相色谱(HPLC)，毛细管电泳，电化学和荧光光谱法。其中，高效液相色谱、电化学技术和毛细管电泳需要相对费力的样品预处理。质谱需要昂贵的仪器和专业技术。虽然荧光也有其缺点，如光漂白，但它的高灵敏度，相对简单的操作及预处理过程使这种检测技术有希望用于实际样品。

手性是医学和生物化学系统中的基本化学性质。大多数在生物体中起作用的生化系统都涉及手性相互作用。手性分子的不同对映体在生理和化学活性方面表现出显著的差异。以前的研究表明，低水平的L-Cys，在神经元活动中充当神经保护抗氧化剂，而高水平的L-Cys可导致神经元损伤。然而，D-Cys不会对大脑造成兴奋毒性损伤，并且比L-Cys能更有效地保护小脑神经元。这可能是因为在相同浓度下，D-Cys的转运活性大于L-Cys，因此，半胱氨酸对映体的选择性识别已成为生物化学和手性药物发展的一个重要研究方向。目前，包括高效液相色谱和气相色谱在内的分析方法已被用于识别氨基酸对映体。因此，设计一种高效的Cys对映体立体选择性分析传感器仍然是一项具有挑战性的任务。

发明内容

因此，本发明要解决的技术问题是，为了克服现有技术中存在的测试时间较长、误差较大、测试方法繁琐以及检测时间长等问题，提供一种简便、快速、高灵敏度的生物传感器即用于半胱氨酸检测的Au(I)-GSH的复合物的合成方法。本发明要解决的另一个技术问题是，提供Au(I)-GSH复合物-Ag+体系用于Cys定量检测的方法。本发明要解决的另一个技术问题是，D/L-Cys对映异构体的手性识别应用。

本发明的技术方案是，一种用于半胱氨酸检测的复合物的合成方法，包括Au(I)-GSH复合物的合成：

a、将浓度为50～100mmol/L的谷胱甘肽溶液和浓度为20～30mmol/L的氯金酸溶液按照1-2：4-5体积比混合，搅拌混匀，得到混合溶液；

b、向混合溶液中加入0.5～2mol/L的NaOH溶液，将混合液置于35-39℃水浴中连续磁力搅拌0.5-2h；

c、置于70～90℃油浴锅中连续磁力搅拌18-30h，将所得溶液室温下连续磁力搅拌至冷却至室温；

d、所得溶液放入1800-2200Da透析袋中，连续透析20-30h，每7-9h更换透析液，得到Au(I)-GSH复合物。

透析可以去除多余的模板分子，避免模板分子与添加的银离子结合。步骤a，b，c的搅拌速度优选为500-1200rpm。

根据本发明的一种用于半胱氨酸检测的复合物的合成方法，优选的是，步骤a所述谷胱甘肽溶液和氯金酸溶液的体积比是1-2：5；步骤a所述搅拌为磁力搅拌。

根据本发明的一种用于半胱氨酸检测的复合物的合成方法，优选的是，步骤d所述透析液的成分水。

本发明还提供了上述的合成方法得到的Au(I)-GSH复合物，具有聚集诱导发光增强特性。Au(I)-GSH复合物具有荧光特性或者吸收光谱特性。

本发明还提供了所述Au(I)-GSH复合物-Ag

本发明还提供了上述Au(I)-GSH复合物-Ag

a、用pH为3.0～5.0的柠檬酸缓冲溶液配置浓度为5-13mmol/L的Cys溶液，之后将其稀释成不同浓度的系列Cys标准溶液；

b、在室温条件下，取等量合成的Au(I)-GSH复合物置于不同离心管内，分别加入等体积的1-30mmol/L的AgNO

在作为荧光探针检测Cys的用途，优选的是，步骤b所述涡旋时间为20-40s。

本发明还提供了上述的Au(I)-GSH复合物-Ag

a、用10～100mmol/L的酒石酸/扁桃酸配置浓度为5-13mmol/L的D/L-Cys溶液；

b、在室温条件下，取Au(I)-GSH复合物置于不同离心管内，分别加入等量的AgNO

在作为D/L-Cys对映异构体的手性识别方面的应用，优选的是，步骤b所述涡旋时间为20-40s。

本发明主要涉及Au(I)-GSH的合成，Au(I)-GSH-Ag

本发明利用谷胱甘肽(GSH)作为模板和还原剂一步合成了Au(I)-GSH复合物，该复合物具有聚集诱导发光增强特性。Ag

本发明所述的传感系统的基本机理是聚集诱导发射增强效应，Au(I)-GSH复合物和Ag

本发明的有益效果是：

(1)本发明制备的Au(I)-GSH复合物以HAuCl4为Au(I)的前驱体，以GSH作为还原剂和保护剂，用“一锅合成法”合成了Au(I)-GSH复合物，合成方法简单，反应条件温和，所合成的Au(I)-GSH复合物分散性良好，具有良好的生物相容性和聚集反应迅速，无毒性，受外界干扰小等优点，因此本发明的Au(I)-GSH复合物可在生物成像和分析检测领域具有广阔的应用前景。

(2)本发明开发的Au(I)-GSH复合物-Ag

(3)本发明开发的Au(I)-GSH复合物-Ag

附图说明

图1：基于Au(I)-GSH复合物-Ag

图2a是加入不同浓度半胱氨酸后体系荧光光谱图；

图2b是以系列Cys标准溶液的浓度为横坐标，相对荧光强度(F-F0)/F0为纵坐标，绘制的浓度-荧光强度工作曲线。

图3a是体系中加入扁桃酸后，对照溶液/D-Cys/L-Cys紫外光谱；

图3b是体系中加入扁桃酸后，对照溶液/D-Cys/L-Cys荧光光谱；

图4a是体系中加入酒石酸后，对照溶液/D-Cys/L-Cys紫外光谱；

图4b是体系中加入酒石酸后，对照溶液/D-Cys/L-Cys荧光光谱。

具体实施方式

实施例1：Au(I)-GSH复合物的合成

将浓度为100mmol/L的谷胱甘肽溶液和浓度为20mmol/L的氯金酸溶液按照体积比2：5混合，磁力搅拌混匀。向混合溶液中加入1mol/L的NaOH溶液，将混合液置于37℃水浴中连续磁力搅拌1h。置于90℃油浴锅中连续磁力搅拌24h，将所得溶液室温下连续磁力搅拌至冷却至室温。所得溶液放入2000Da透析袋中，连续透析24h，每8h更换透析液，得到Au(I)-GSH复合物。

实施例2：Au(I)-GSH复合物的合成

将浓度为90mmol/L的谷胱甘肽溶液和浓度为25mmol/L的氯金酸溶液按照体积比1：2混合，磁力搅拌混匀。向混合溶液中加入1.5mol/L的NaOH溶液，将混合液置于35℃水浴中连续磁力搅拌1.2h。置于78℃油浴锅中连续磁力搅拌28h，将所得溶液室温下连续磁力搅拌至冷却至室温。所得溶液放入2200Da透析袋中，连续透析28h，每9h更换透析液，透析液为水，得到Au(I)-GSH复合物。

实施例3：Au(I)-GSH复合物的合成

将浓度为70mmol/L的谷胱甘肽溶液和浓度为28mmol/L的氯金酸溶液按照体积比1：1混合，磁力搅拌混匀。向混合溶液中加入1mol/L的KOH溶液，将混合液置于39℃水浴中连续磁力搅拌1.5h。置于80℃油浴锅中连续磁力搅拌22h，将所得溶液室温下连续磁力搅拌至冷却至室温。所得溶液放入2000Da透析袋中，连续透析30h，每8.5h更换透析液，得到Au(I)-GSH复合物。

图1是基于Au(I)-GSH复合物-Ag+传感系统的Cys浓度检测机理示意图。(Ag+与Au(I)-GSH复合物的相互作用较弱，而Cys的巯基官能团与Ag

实施例4：Au(I)-GSH复合物-Ag

用pH为4.0的柠檬酸缓冲溶液配置浓度为10mmol/L的Cys溶液，之后将其稀释成不同浓度的系列Cys标准溶液。在室温条件下，取Au(I)-GSH复合物置于不同离心管内，分别加入等量10mmol/L的AgNO

实施例5：D/L-Cys对映异构体的手性识别

用0.1mol/L的酒石酸/扁桃酸配置浓度为10mmol/L的D/L-Cys溶液。在室温条件下，取等Au(I)-GSH复合物置于不同离心管内，分别加入等量20mmol/L的AgNO3溶液，并分别加入等量不同手性的Cys标准溶液，涡旋30s后，日光及紫外灯下拍照，测定300～800nm紫外可见光谱，在激发波长为398nm，发射波长为500～800nm，狭缝为10nm的条件下用荧光法检测不同手性的Cys标准溶液所对应的荧光强度F。加入扁桃酸时，由于扁桃酸与D-Cys有更强的相互作用，仅有L-Cys引起了显著的聚集，该变化在日光及紫外灯下均可用裸眼区分。紫外光谱表明，加入L-Cys的溶液在300-400nm波长处的吸光度显著增强，而加入D-Cys的溶液几乎是单分散的，在波长300-400nm处的吸光度没有明显变化。以398nm作为激发波长，分别采集荧光光谱，加入D/L-Cys的荧光发射强度分别增强了1.2倍/2.2倍。体系中加入扁桃酸后，对照溶液/D-Cys/L-Cys紫外光谱，荧光光谱的实验结果分别对应图3a,图3b。加入酒石酸时，由于酒石酸酸与L-Cys有更强的相互作用，仅有D-Cys引起了显著的聚集，该变化在日光及紫外灯下均可用裸眼区分。紫外光谱表明，加入D-Cys的溶液在300-400nm波长处的吸光度显著增强，而加入L-Cys的溶液紫外光谱几乎是单分散的，在波长300-400nm处的吸光度没有明显变化。以398nm作为激发波长，分别采集荧光光谱，加入D/L-Cys的荧光发射强度分别增强了1.5倍/1.1倍。体系中加入酒石酸后，对照溶液/D-Cys/L-Cys紫外光谱，荧光光谱结果分别对应图4a,图4b。