通过将猪主要组织相容性复合物SLA-1替换成人主要组织相容性复合物HLA-A建立用于异种移植的猪细胞系的研究

摘要

器官移植对于挽救晚期器官衰竭患者的生命具有重大意义，但是由于人类供体器官来源严重短缺，以猪作为理想的异种器官移植供体，可以提供充足的器官来源，但同时也具有不可避免的障碍，最主要是宿主抗外源移植物的免疫排斥反应，包括超急性免疫排斥反应，急性血管排斥反应及其他后续排斥反应，而引起这一系列排斥反应的因素除了与GGTA1催化的Gal抗原表位有关之外，还与供—受者的主要组织相容性复合物（major histocompatibility complex，MHC）的相容程度有密切关系。人类的主要组织相容性复合物称为人类白细胞抗原(human leucocyte antigen，HLA);猪的则称为猪白细胞抗原(swine leukocyte antigen，SLA)。为了解决异种移植的免疫排斥问题，本研究主要通过利用转录激活子样效应因子核酸酶基因打靶技术与同源重组介导的定点插入方法将GGTAl敲除的猪胎儿成纤维细胞的SLA-1替换成人的HLA-A，从而得到用于建立异种器官移植供体模型的体细胞核移植供体猪细胞系，为实现猪-人的异种器官移植奠定基础。

目录

声明

致谢

摘要

目次

1 引言

1．1 选题的目的和意义

1．2 国内外本学科领域的研究现状

1．2．1 猪是理想的异种移植供体

1．2．2 主要组织相容性抗原的研究进展

1．2．3 商效稳定的基因定点修饰技术

2 材料与方法

2．1 材料

2．1．1 细胞

2．1．2 菌株

2．1．3 主要试j14及试剂盒

2．1．4 主要实验仪器和设备

2．2 实验方法

2．2．1 分子克隆基本试剂配置

2．2．2 TALENs 设计及构建

2．2．3 Knock-In载体质粒构楚

2．2．4 感受态细菌制备

2．2．5 转化

2．2．6 基因组抽提

2．2．7 质粒DNA小量抽提

2．2．8 质粒DNA中量抽提及无菌处理

2．2．9 质粒无菌处理

2．2．10 F-140 Kit细胞裂解，直接pcr

2．2．11 PCR产物纯化回收

2．2．12 细胞培养所鲁试剂配制

2．2．13 LW5细胞的复苏

2．2．14 LW5细胞的冻存

2．2．15 TALEN效率鉴定

2．2．16 电转质粒建立KI细胞系

2．2．17 细胞Knock-In鉴定

2．2．18 RNA抽提

2．2．19 反转录

3 实验结果

3．1 构建靶向SLA-1基因的TALENs

3．2 筛选出活性最高的TALENs组合

3．3 构建Knock-In载体

3．4 在GGTA1基因敲除的LW5中将SIA-1替换成HLA-A

3．5 鉴定替换成功的细胞基因型

3．5．1 DNA水平鉴定

3．5．2 mRNA水平鉴定

4 讨论与小结

附录

参考文献

作者简历