一种治疗肝纤维化的siRNA及其递送制剂

摘要

本发明涉及一种小干扰RNA，其通过NOX1 siRNA进行RNA干扰（RNAi），可以有效靶向NOX1蛋白，抑制活性氧（ROS）的产生，有效抑制肝星状细胞（HSC）的活化，进而起到治疗肝纤维化的作用。

说明书

技术领域

本发明涉及医药制剂领域，具体涉及一种治疗肝纤维化的siRNA及其递送制剂。

背景技术

RNA干扰(RNA interference，缩写为RNAi)是指一种分子生物学上由双链RNA诱发的基因沉默现象，其机制是通过阻碍特定基因的转录或翻译来抑制基因表达。当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA时，该mRNA发生降解而导致基因表达沉默。长度为20-25nt的siRNA(Small interfering RNA，小干扰核酸)能够引发RNAi，可以特异性下调或关闭特定基因的表达，并具备的高效性、易合成及易操作的特点，所以该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗领域。

肝纤维化是肝损伤的结果，是各种致病因子所导致的肝内结缔组织异常增生，肝纤维化可能导致肝功能障碍，是肝损伤发展成其他慢性疾病的主要过程。其特征在于响应于慢性损伤的炎症细胞的募集和肝星形细胞(HSC)的活化，引起细胞外基质的积聚。脂肪变性(steatosis)通常与肝炎和肝细胞损伤共存。不论其病因如何，增加的氧化应激是在所有慢性肝病中引起纤维化的常见因素。受损的肝细胞、HSC和浸润的炎症细胞是活性氧簇(ROS)的主要来源。实际上，氧化应激将诱导炎症细胞的募集和HSC的活化。因此，在慢性肝损伤背景下，将会发生肝细胞损伤、ROS产生、HSC活化和炎症细胞募集的恶性循环，从而放大对损伤的纤维化应答。

近年来，抗肝纤维化药物的研发及治疗在肝纤维化的不同靶点、抑制肝星状细胞活化与增殖、增强基质金属蛋白酶活性及抑制金属蛋白酶组织抑制剂的活性、抑制炎症反应、调节免疫反应的药物，以及纳米颗粒与抗纤维化药物结合的治疗和基因治疗方面取得了显著的进展。但目前还没有有效针对肝纤维化的治疗方法。传统药物可能存在由于给药剂量大等因素导致的不良反应，而基因治疗由于高效、靶向性强、易操作等特点成为未来抗肝纤维化不可或缺的研究方向。

活性氧(ROS)可以通过HSC中的氧化还原敏感蛋白激酶和转录因子来调节各种介体的激活和表达。NADPH氧化酶是吞噬细胞中ROS的主要来源，具有关键作用。NOX是NADPH氧化酶的催化亚基，NOX1是一种NOX的亚型，能够产生ROS。在肝纤维化的形成过程中，各种致病因素持续作用于肝星状细胞(HSC)，使其活化增殖、凋亡减少，进而使胶原蛋白合成增加，细胞外基质(extracellular matrix，ECM)过度沉积。故若能有效抑制HSC的活化增殖，即可有效阻止肝纤维化的发生及进一步发展。活性氧在肝纤维化形成过程中具有重要意义，其NADPH氧化酶(NOX)主要通过活化HSC而发挥作用。有研究表明，在肝纤维化大鼠及肝硬化患者中NOX1表达增加，研究进一步表明NOX1可能将成为一种新的肝纤维化的治疗靶点(Lan,Kisseleva et al.2015)。肝星状细胞(HSC)位于肝窦间隙，约占肝脏细胞总数的10％，一般药物只能进入肝细胞而很少能进入肝窦间隙，更难进入肝星状细胞(HSC)，因此靶向肝星状细胞(HSC)的药物很少。

发明内容

本发明的发明人意外的发现，通过NOX1 siRNA进行RNA干扰(RNAi)，可以有效靶向NOX1蛋白，抑制活性氧(ROS)的产生，有效抑制肝星状细胞(HSC)的活化，进而起到治疗肝纤维化的作用。

本发明的技术方案为，一种抑制NOX1靶基因表达的小干扰RNA，其由正义链和与其反向互补的反义链组成，所述正义链具有5’-GAGAUGUGGGAUGAUCGUGACTT-3’的核苷酸序列，所述反义链具有5’-GUCACGAUCAUCCCACAUCUCTT-3’的核苷酸序列，所述反义链与所述靶基因上的区段反向互补。

进一步地，所述小干扰RNA，其中，所述正义链和反义链上分别自5’端起的前21个核苷酸任选地进行2’-O-核糖修饰，所述2’-O-核糖修饰选自2’-O-核糖甲基修饰、2’-O-核糖氟代修饰和2’-O-MOE核糖修饰。

本发明的另一技术方案为，一种抑制NOX1靶基因表达的小干扰RNA，其由正义链和与其反向互补的反义链组成：所述正义链具有5’-CAAGCUGGUGGCCUAUAUGAUTT-3’的核苷酸序列，所述反义链具有5’-AUCAUAUAGGCCACCAGCUUGTT-3’的反义核酸序列，所述反义链与所述靶基因上的区段反向互补。

进一步地，所述小干扰RNA，其中，所述正义链和反义链上分别自5’端起的前21个核苷酸任选地进行2’-O-核糖修饰，所述2’-O-核糖修饰选自2’-O-核糖甲基修饰、2’-O-核糖氟代修饰和2’-O-MOE核糖修饰。

本发明的另一目的为提供一种有效的小干扰RNA递送制剂。

本发明提供如下技术方案：

一种递送制剂，其包含本发明所述的小干扰RNA和包载小干扰RNA的阳离子聚合物，所述阳离子聚合物为聚乙烯亚胺聚合物。

进一步地，本发明所述的递送制剂，其中，所述聚乙烯亚胺聚合物的分子式为

进一步地，本发明所述的递送制剂，其中，所述聚乙烯亚胺聚合物为法国Polyplus的辅料in vivo-jet PEI。

进一步地，本发明所述的递送制剂，其包含小干扰RNA，聚乙烯亚胺聚合物和溶剂，其中，小干扰RNA：聚乙烯亚胺聚合物：溶剂的比例为1g：0.1～0.2L：50-150L。

优选地，本发明所述的递送制剂，其中，所述小干扰RNA：聚乙烯亚胺聚合物：溶剂的比例为1g：0.16L：80-120L。

优选地，本发明所述的递送制剂，其中，所述溶剂为5％的葡萄糖水溶液。

本发明还提供所述小干扰RNA和递送制剂的治疗用途。

作为本发明的一种方案，本发明还提供所述小干扰RNA和递送制剂在制备用于治疗肝损伤或肝纤维化的药物中的用途。

作为本发明的另一方案，本发明还提供所述小干扰RNA和递送制剂在制备降低肝脏中NOX1 mRNA的表达水平的药物中的用途。

本发明能实现的技术效果为，针对目前尚无有效的治疗急性肝损伤和肝纤维化的手段，通过深入的研究，筛选并分离出了两条小干扰RNA序列，可以有效的降低肝脏中NOX1mRNA的表达水平，试验证明，可以在四氯化碳诱导的急性肝损伤和慢性肝纤维化模型起到治疗作用，本发明还利用采购自法国Polyplus公司的阳离子聚合物in vivo jet PEI包载针对NOX1的siRNA，达到良好的递送效果，在实验过程中，尚未发现明显的毒性。

附图说明

图1 NOX1 siRNA 1对CCL4诱导的急性肝损伤模型小鼠的ALT的影响；

图2 NOX1 siRNA 1对CCL4诱导的急性肝损伤模型小鼠的AST的影响；

图3 NOX1 siRNA 1对CCL4诱导的急性肝损伤模型小鼠的TBIL的影响；

图4 NOX1 siRNA 1对CCL4诱导的急性肝损伤模型小鼠的肝脏HE切片的影响；

图5 NOX1 siRNA 2对CCL4诱导的慢性肝纤维化模型小鼠的ALT的影响；

图6 NOX1 siRNA 2对CCL4诱导的慢性肝纤维化模型小鼠的AST的影响；

图7 NOX1 siRNA 2对CCL4诱导的慢性肝纤维化模型小鼠的ALT/AST的影响；

图8 NOX1 siRNA 2对CCL4诱导的慢性肝损伤模型小鼠的TBIL的影响；

图9 NOX1 siRNA 2对CCL4诱导的慢性肝纤维化模型小鼠的肝脏天狼星红切片的影响。

具体实施方式

下面实施例用于进一步详细说明本发明，但不以任何形式限制本发明。

本发明采用CCL4诱导小鼠急性肝损伤模型以及慢性肝纤维化模型，CCl4是诱导实验动物产生肝纤维化和肝硬化最广泛使用的化学性肝毒物。CCl4在模型动物的肝脏中被细胞色素酶P450代谢为三氯甲基自由基CCl3·和氯离子自由基Cl·，CCl3·会与肝细胞内核酸、蛋白质和脂质等大分子发生共价结合，引发三氯甲基过氧自由基的产生和脂质过氧化，这些反应会损伤肝脏细胞的各种膜系统(包括内质网、线粒体和质膜)，导致渗透性降低，从而导致狄氏间隙内原本静止的肝星形细胞活化，进而促使肝脏纤维化。

本发明中对对照组、模型组及治疗组的小鼠进行肝功能相关血清生化指标的检测，包括对血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)及总胆红素(TBIL)的检测。当对用肝脏有毒性的药物或毒物处理，使肝脏细胞受损或死亡时，细胞膜通透性增加，胞浆中的谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)进入血清，使血清中浓度升高。谷丙转氨酶(ALT)在肝脏分布最多，谷草转氨酶(AST)主要分布在心肌，其次是肝脏、骨骼肌和肾脏等组织中。当谷草转氨酶明显升高，谷草转氨酶/谷丙转氨酶(ALT)大于1时，提示有肝实质的广泛损害。总胆红素(TBIL)是直接胆红素和间接胆红素的总和，肝脏对胆红素的代谢起着重要作用，总胆红素(TBIL)在血清中的含量能够间接反映肝功能情况。

实施例1：NOX1 siRNA 1对小鼠中的四氯化碳诱导的急性肝损伤的作用，以及与阳性药物水飞蓟宾的比较

试剂与仪器

CCL4(购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，货号：C112040，批次：B2027005)，大豆油(金龙鱼，Q/BBAH0019S)，Nox1 siRNA1(委托苏州贝信生物技术有限公司合成，正义链核苷酸序列：5’-GAGAUGUGGGAUGAUCGUGACTT-3’，反义链核苷酸序列：5’-GUCACGAUCAUCCCACAUCUCTT-3’)，水飞蓟宾(购自大连美仑生物技术有限公司，货号：MB1962，批次：00801A)，CMC-Na(购自北京索莱宝科技有限公司，货号：C8620，批次：617O022)，in vivo-jetPEI(法国Polyplus公司)，多聚甲醛，提取肝脏组织RNA试剂盒，反转录试剂盒。

实验方法

雄性C57BL/6小鼠56只(维通利华)，实验开始时小鼠体重24±1g。在温度24～26℃，湿度60％，明暗各12h的培养条件下适应性饲养一周。用1:3的体积比混合CCL4和大豆油，除对照组外每只雄性C57BL/6小鼠一次性腹腔注射0.05mL/10g(体重)CCL4大豆油溶液，对照组腹腔注射等体积的大豆油。造模后24h后第一次给予siRNA和水飞蓟宾干预，48h后处死取样，取小鼠血清，肝脏分别冻存和4％多聚甲醛固定。

给药方法

按照每μgRNA加入0.16μl in vivo-jetPEI的比例，制备100μl注射体积的5％Glucose的递送制剂注射液。

(1)将5μgRNA 1稀释到25μl的10％glucose，加25μl ddH2O，轻轻涡旋。

(2)将0.8μl in vivo-jetPEI稀释到25μl的10％glucose，加25μl ddH2O，轻轻涡旋。

(3)将稀释的in vivo-jetPEI加入到稀释的RNA中，涡旋。

(4)室温孵育15min。

制备过程中，操作人员佩戴口罩，工作台使用前用酒精和RNA cleaner擦拭；因给药过程会存在损耗，应根据给药小鼠的数量，多配制100μl药物。

分组设计

表1.实验动物分组和药物处理说明表

注：水飞蓟宾用5‰的羧甲基纤维素钠配制。

检测指标

1.体质量及生存率观察

每天称量小鼠体质量，观察动物一般情况并记录，例如小鼠体质量、抓取应激及行为活动等。

2.血清生化指标检测

各组小鼠分别于给药48h后处死摘眼球取血，3000r/min离心10min，分离血清后用全自动生化分析仪测定其ALT、AST、TBIL的水平。

3.肝脏组织病理学检测

给药48h后处死小鼠，先摘眼球取血，待小鼠死亡，解剖，肝组织纵切，用10倍体积4％多聚甲醛固定，切片厚度3～5μm，石蜡包埋，苏木精一伊红(HE)染色，光学显微镜下观察肝脏病理学改变。

4.分子生物学指标检测

给药48h后处死小鼠，先摘眼球取血，待小鼠死亡，解剖，取小鼠肝脏组织，提取肝脏组织RNA，通过反转录PCR将其反转录为cDNA，利用实时荧光定量PCR的方法检测肝脏组织中Nox1、IL-1β、TNF-α及GAPDH的mRNA表达情况。引物：Nox1-mouse(Sense：5’-CTG ACA AGTACT ATT ACA CGA GAG-3’，Antisense：5’-CAT ATA TGC CAC CAG CTT ATG GAA G-3’)；GAPDH-mouse(Sense：5’-TCA ACG GGA AAC CCA TCA CCA T-3’，Antisense：5’-GAA CACGGA AGG CCA TGC CAG T-3’)；IL-1β-mouse(Sense：5’-CCA TGG CAC ATT CTG TTC AAA-3’，Antisense：5’-GCC CAT CAG AGG CAA GGA-3’)；TNF-α-mouse(Sense：5’-AGT CAA CCTCCT CTC TGC CG-3’，Antisense：5’-CTC CAA AGT AGA CCT GCC CG-3’)。

5.统计方法

应用GraphPad Prism 8进行数据分析和绘制统计图，独立样本用t检验，*P＜0.05表示与空白对照组相比差异显著，**P＜0.01示与空白对照组相比差异极显著，#P＜0.05表示与模型组相比差异显著，##P＜0.01表示与模型组相比差异极显著，具有统计学意义。

6.结果见附图1～4。

如图1所示，小鼠腹腔注射CCl

如图2所示，小鼠腹腔注射CCl4后48小时后，模型组小鼠血清中的AST水平与正常对照组相比非常显著的上升(**P<0.01)；与模型组相比，阳性对照药物水飞蓟宾组能够降低血清中的AST水平，但是不具有统计学差异；NOX1 siRNA 1低剂量组和高剂量组都能够显著降低血清中的AST水平(##P<0.01)，NOX1 siRNA 1低剂量组的作用强于高剂量组。

如图3所示，小鼠腹腔注射CCl

如图4所示，小鼠腹腔注射CCl4后48小时后，肝脏组织HE染色结果显示，与对照组相比，模型组细胞变性坏死增多，NOX1 siRNA 1低剂量组及阳性对照药物水飞蓟宾组均能够减少细胞坏死，NOX1 siRNA 1低剂量组的治疗效果较明显。

实施例2：NOX1 siRNA 2对小鼠中的四氯化碳诱导的急性肝损伤的作用，以及与阳性药物水飞蓟宾的比较

除所采用的RNA为Nox1 siRNA 2(委托苏州贝信生物技术有限公司合成，正义链核苷酸序列：5’-CAAGCUGGUGGCCUAUAUGAUTT-3’，反义链核苷酸序列：5’-AUCAUAUAGGCCACCAGCUUGTT-3’)外，其他操作同实施例1。

取得试验效果数据与实施例1相当。

实施例3：NOX1 siRNA 2对小鼠中的四氯化碳诱导的慢性肝纤维化模型的作用，以及与阳性药物水飞蓟宾的比较

试剂与仪器

CCL4(购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，货号：C112040，批次：B2027005)，大豆油(金龙鱼，Q/BBAH0019S)，Nox1 siRNA 2(委托苏州贝信生物技术有限公司合成，核酸序列：5’-CAAGCUGGUGGCCUAUAUGAUTT-3’，反义核酸序列：5’-AUCAUAUAGGCCACCAGCUUGTT-3’)，水飞蓟宾(购自大连美仑生物技术有限公司，货号：MB1962，批次：00801A)，CMC-Na(购自北京索莱宝科技有限公司，货号：C8620，批次：617O022)，in vivo-jetPEI，多聚甲醛，提取肝脏组织RNA试剂盒，反转录试剂盒、灌胃针，注射器，手术器械，倒置显微镜，实时荧光定量PCR仪，PCR仪，血清生化分析仪。

实验方法

雄性C57BL/6小鼠68只(维通利华)，实验开始时小鼠体重24±2g。在温度24～26℃，湿度60％，明暗各12h的培养条件下适应性饲养一周。用2:5的体积比混合CCL

给药方法

操作同实施例1，仅RNA替换为Nox1 siRNA 2。

分组设计

表2.实验动物分组和药物处理说明表

注：水飞蓟宾用5‰羧甲基纤维素钠配制。

检测指标

1.体质量及生存率观察

每3天称量小鼠体质量，观察动物一般情况并记录，例如小鼠体质量、抓取应激及行为活动等。

2.血清生化指标检测

各组小鼠分别于持续造模6周后处死并摘眼球取血，3000r/min离心10min，分离血清后用全自动生化分析仪测定其ALT、AST、TBIL的水平。

3.肝脏组织病理学检测

持续造模6周后处死小鼠，先摘眼球取血，待小鼠死亡，解剖，肝组织纵切，用10倍体积4％多聚甲醛(需确定)固定，切片厚度3～5μm，石蜡包埋，苏木精一伊红(HE)染色、天狼星红染色，光学显微镜下观察肝脏病理学改变。

4.分子生物学指标检测

持续造模6周后处死小鼠，先摘眼球取血，待小鼠死亡，解剖，取小鼠肝脏组织，提取肝脏组织RNA，通过反转录PCR将其反转录为cDNA，利用实时荧光定量PCR的方法检测肝脏组织中Nox1、IL-1β、TNF-α、α-SMA、Col-1α及GAPDH的mRNA表达情况。引物：Nox1-mouse(Sense：5’-CTG ACA AGT ACT ATT ACA CGA GAG-3’，Antisense：5’-CAT ATA TGC CAC CAGCTT ATG GAA G-3’)；GAPDH-mouse(Sense：5’-TCA ACG GGA AAC CCA TCA CCA T-3’，Antisense：5’-GAA CAC GGA AGG CCA TGC CAG T-3’)；IL-1β-mouse(Sense：5’-CCA TGGCAC ATT CTG TTC AAA-3’，Antisense：5’-GCC CAT CAG AGG CAA GGA-3’)；TNF-α-mouse(Sense：5’-AGT CAA CCT CCT CTC TGC CG-3’，Antisense：5’-CTC CAA AGT AGA CCT GCCCG-3’)；Col-1α-mouse(Sense：5’-AAG GTT CTC CTG GTG AAG CTG GT-3’，Antisense：5’-CTG AGC TCC AGC TTC TCC ATC TT-3’)；α-SMA(Sense：5’-GAA GTA TCC GAT AGA ACA CGGCAT C-3’，Antisense：5’-CCA GCA CAA TAC CAG TTG TAC GTC-3’)。

5.统计方法

应用GraphPad Prism 8进行数据分析和绘制统计图，独立样本用t检验，*P＜0.05表示与空白对照组相比差异显著，**P＜0.01示与空白对照组相比差异极显著，#P＜0.05表示与模型组相比差异显著，##P＜0.01表示与模型组相比差异极显著，具有统计学意义。

6.结果见附图5～9。

如图5所示，小鼠腹腔注射CCl4造模2周后持续给药4周，共6周后造模及给药结束，模型组小鼠血清中的ALT水平与正常对照组相比非常显著的上升(**P<0.01)；与模型组相比，阳性对照药物水飞蓟宾组能够显著降低血清中的ALT水平(##P<0.01)；NOX1 siRNA低、中、高剂量组均能够显著降低血清中的ALT水平(##P<0.01)，NOX1 siRNA中剂量组作用效果最为明显。

如图6所示，小鼠腹腔注射CCl4造模2周后持续给药4周，共6周后造模及给药结束，模型组小鼠血清中的AST水平与正常对照组相比非常显著的上升(**P<0.01)；与模型组相比，阳性对照药物水飞蓟宾组能够显著降低血清中的AST水平(##P<0.01)；NOX1 siRNA低、中、高剂量组也均能够降低血清中的AST水平(#P<0.05)，效果相似。

如图7所示，小鼠腹腔注射CCl4造模2周后持续给药4周，共6周后造模及给药结束，模型组小鼠血清中的ALT/AST水平与正常对照组相比非常显著的上升(**P<0.01)；与模型组相比，阳性对照药物水飞蓟宾组能够显著降低血清中的ALT/AST水平(##P<0.01)；NOX1siRNA低、中、高剂量组也均能够显著降低血清中的ALT/AST水平(##P<0.01)，NOX1 siRNA中剂量组作用效果最为明显。

如图8所示，小鼠腹腔注射CCl4造模2周后持续给药4周，共6周后造模及给药结束，模型组小鼠血清中的TBIL水平与正常对照组相比非常显著的上升(**P<0.01)；与模型组相比，阳性对照药物水飞蓟宾组、NOX1 siRNA低、中剂量组也均能够降低血清中的TBIL水平，但是不具有统计学差异，NOX1 siRNA高剂量组未显示明显作用效果。

如图9所示，小鼠腹腔注射CCl4造模2周后持续给药4周，共6周后造模及给药结束，肝脏组织天狼星红染色显示，与对照组相比，模型组汇管区I型胶原沉积、延伸明显，相互交联形成假小叶结构。NOX1 siRNA中剂量组及阳性对照药物水飞蓟宾组均能够减少汇管区I型胶原沉积，NOX1 siRNA中剂量组作用效果较为明显。

实施例4：NOX1 siRNA 1对小鼠中的四氯化碳诱导的慢性肝纤维化模型的作用，以及与阳性药物水飞蓟宾的比较

除所采用的RNA为Nox1 siRNA 1(委托苏州贝信生物技术有限公司合成，核酸序列：5’-GAGAUGUGGGAUGAUCGUGACTT-3’，反义核酸序列：5’-GUCACGAUCAUCCCACAUCUCTT-3’)外，其他操作同实施例3。

取得试验效果数据与实施例3基本相当。