神经母细胞miR-200b/c高表达的慢病毒表达载体及其构建方法

摘要

本发明公开了一种神经母细胞miR‑200b/c高表达的慢病毒表达载体，包括：PCDH‑copGFP载体及miR200b/c基因序列，所述miR200b/c基因序列酶切插入PCDH‑copGFP载体中得到miR200b/c高表达的慢病毒表达载体，所述PCDH‑copGFP载体和miR200b/c的前体DNA序列均包含BamHl和EcoRI两个酶切位点,根据本发明实施例提供的神经母细胞miR‑200b/c高表达的慢病毒表达载体及构建方法，利用miR200b/c基因序列酶切插入PCDH‑copGFP载体中得到miR200b/c高表达的慢病毒表达载体，其转染效率高，可在神经母细胞中稳定地抑制miRNA‑200b/c表达，进而对基因表达起到调控作用。

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种神经母细胞miR-200b/c高表达的慢病毒表达载体及其构建方法。

背景技术

神经母细胞瘤是儿童最常见的颅外肿瘤，是婴幼儿最常见的肿瘤。有将近一半的神经母细胞瘤发生在2岁以内的婴幼儿。神经母细胞瘤约占6-10％的儿童肿瘤，15％的儿童肿瘤死亡率。神经母细胞瘤属于神经内分泌性肿瘤，可以起源于交感神经系统的任意神经脊部位。其最常见的发生部位是肾上腺，但也可以发生在颈部、胸部、腹部以及盆腔的神经组织。

miRNA是一类进化保守的内源性的非编码小分子，普遍存在于多样性生物体内参与基因调控。miRNA主要调控着编码蛋白的基因表达，其作用机制是降解与其互补结合的mRNA或抑制不完全配对的mRNA翻译，具有非常重要的生物学作用。

miR-200a具有靶向调控转录因子活化蛋白(AP)-2γ表达而抑制神经母细胞瘤细胞增殖的能力，通过调节miRNA-200b/c表达，可能在制备治疗miRNA-200b/c表达异常相关疾病药物的开发中起到作用，但现有技术尚可稳定低表达miRNA-200b/c的重组载体。因此，提供一种神经母细胞miR-200b/c高表达的慢病毒表达载体及其构建方法具有重要意义。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的目的在于提出一种神经母细胞miR-200b/c高表达的慢病毒表达载体及其构建方法。

为实现上述目的，一方面，根据本发明实施例的神经母细胞miR-200b/c高表达的慢病毒表达载体，包括：

PCDH-copGFP载体及miR200b/c基因序列，所述miR200b/c基因序列酶切插入PCDH-copGFP载体中得到miR200b/c高表达的慢病毒表达载体，所述PCDH-copGFP载体和miR200b/c的前体DNA序列均包含BamHl和EcoRI两个酶切位点。

根据本发明的一个实施例，所述miR200b/c基因序列为前体pre-miRNA；

miR200b的基因系列位置156055681—156055750，其长度为511bp，序列如下：

catctaatttccaaaagagaacttgatcttacttcaagctgttgacctctccactacctatctttggagatgagaatgcagggctttctgctgttgtcctgaaggggtgccctccttctgcaatgctctggggattaggacacttaggcatctgggccctgcccatggaatctagtcatcttcaactccctgctaggcggcctccatatccaacttgggcagccgtggccatcttactgggcagcattggatagtgtctgatctctaatactgcctggtaatgatgacggcggagccctgcatgcagcaatggagccgcctcctgatcccagcctccaggggccccagttccacacctcacctaccttatccaaggtagggctatggggcaaagagttagccttggcgatatgggtggtgggaggctttagggagagttcccccaaaccaggcacctctgagggccactctatatcctggggtgagaggctcctcccattgccctgggggc；

miR200c的基因系列位置124718322-124718390，其长度为501bp，序列如下：

cgcagtaatgggtgtgttggagggcagggacaggccgtggaatggggggggggggactggctcgcaggtggatagtagaggctacagaaagctggttttggcctcagtgatgggcaagtcagggtaggcctggtggggagcagccaggctctcccggaagtgtcccaaatgacgcggaggtgggggatgggagcaggagatctgccgcttctcttgaggggcttgggcttagccagggctgatcttgaaggtggactggttgggtaggggccctcgtcttacccagcagtgtttgggtgctggttgggagtctctaatactgccgggtaatgatggaggcccctgtcccagtgtcatcggcgtccattgcgcgtccatcgctttaggcacttttatctggcagcaacccattcctcccacacataacctggaagccccttcttccgagttaagggtggctctcgggttggctggttgcccactggaagaacacaatggcc。

另一方面，根据本发明实施例的神经母细胞miR-200b/c高表达的慢病毒表达载体的构建方法，包括：

在基因数据库mirbase上查找包含miR200b/c前体的基因序列；

通过PCR扩增得到miR200b/c前体的基因片段；

将PCDH-copGFP载体及miR200b/c前体的基因片段进行双酶切处理，得到酶切产物；

对所述酶切产物进行纯化处理，并利用T4连接酶将miR200b/c的基因片段与PCDH—copGFP载体进行连接得到连接物；

取所述连接物转化E.coli DH5α感受态细菌，并置于LB培养基中培养并抽其质粒；

挑取阳性质粒并用BamHI和EcoRI双酶切鉴定，并进行测序分析，以确定慢病毒表达载体构建成功。

根据本发明一个实施例，所述PCR扩增引物序列如下：

miR-200b的PCR引物：

上游引物：5’GCTGCTGAATTCCATCTAATTTCCAAAAG3’，含酶切点位EcoRI；

下游引物：5’TATTATGGATCCGCCCCCAGGGCAATGGG3’，含酶切点位BamHI；

miR-200c的PCR引物：

上游引物：5’GTGCAGGAATTCCGCAGTAAATGGGTGTGTTG3’，含酶切点位EcoRI；

下游引物：5’ATGATGGGATCCGGCCATTGTGTTCTTCCAGT3’，含酶切点位BamHI。

根据本发明的一个实施例，PCR反应条件为：94℃5min，94℃30s，50℃40s，72℃30s，32个循环。

根据本发明实施例提供的神经母细胞miR-200b/c高表达的慢病毒表达载体及构建方法，利用miR200b/c基因序列酶切插入PCDH-copGFP载体中得到miR200b/c高表达的慢病毒表达载体，其转染效率高，可在神经母细胞中稳定地抑制miRNA-200b/c表达，进而对基因表达起到调控作用。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图示出的结构获得其他的附图。

图1是构建慢病毒表达载体的谱图；

图2是本发明miR-200b部分测序结果图；

图3是本发明miR-200c部分测序结果图。

本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明中所用到的材料可通过市售得到或通过本领域的常规方法得到，例如：PCDH-copGFP载体购自深圳市博奥康生物科技有限公司，内切酶、T4连接酶及PCR酶购自宝生物工程(大连)有限公司，LB培养基购自北京索莱宝科技有限公司。

根据本发明实施例提供的神经母细胞miR-200b/c高表达的慢病毒表达载体，包括PCDH-copGFP载体及miR200b/c基因序列，所述miR200b/c基因序列酶切插入PCDH-copGFP载体中得到miR200b/c高表达的慢病毒表达载体，所述PCDH-copGFP载体和miR200b/c的前体DNA序列均包含BamHl和EcoRI两个酶切位点。

根据本发明实施例的神经母细胞miR-200b/c高表达的慢病毒表达载体的构建方法，包括以下步骤：

1)在基因数据库mirbase上查找包含miR200b/c前体的基因序列；

2)通过PCR扩增得到miR200b/c前体的基因片段；

3)将PCDH-copGFP载体及miR200b/c前体的基因片段进行双酶切处理，得到酶切产物；

4)对所述酶切产物进行纯化处理，并利用T4连接酶将miR200b/c的基因片段与PCDH-copGFP载体进行连接得到连接物；

5)取所述连接物转化E.coli DH5α感受态细菌，并置于LB培养基中培养并抽其质粒；

6)挑取阳性质粒并用BamHI和EcoRI双酶切鉴定，并进行测序分析，以确定慢病毒表达载体构建成功。

实验例1

miR200b/c前体的基因序列设计：在基因数据库mirbase上查找包含miR200b/c前体的基因序列，具体如下：

miR200b的基因系列位置156055681—156055750，其长度为511bp，序列如下：

catctaatttccaaaagagaacttgatcttacttcaagctgttgacctctccactacctatctttggagatgagaatgcagggctttctgctgttgtcctgaaggggtgccctccttctgcaatgctctggggattaggacacttaggcatctgggccctgcccatggaatctagtcatcttcaactccctgctaggcggcctccatatccaacttgggcagccgtggccatcttactgggcagcattggatagtgtctgatctctaatactgcctggtaatgatgacggcggagccctgcatgcagcaatggagccgcctcctgatcccagcctccaggggccccagttccacacctcacctaccttatccaaggtagggctatggggcaaagagttagccttggcgatatgggtggtgggaggctttagggagagttcccccaaaccaggcacctctgagggccactctatatcctggggtgagaggctcctcccattgccctgggggc，即SEQ ID NO：1；

miR200c的基因系列位置124718322-124718390，其长度为501bp，序列如下：

cgcagtaatgggtgtgttggagggcagggacaggccgtggaatggggggggggggactggctcgcaggtggatagtagaggctacagaaagctggttttggcctcagtgatgggcaagtcagggtaggcctggtggggagcagccaggctctcccggaagtgtcccaaatgacgcggaggtgggggatgggagcaggagatctgccgcttctcttgaggggcttgggcttagccagggctgatcttgaaggtggactggttgggtaggggccctcgtcttacccagcagtgtttgggtgctggttgggagtctctaatactgccgggtaatgatggaggcccctgtcccagtgtcatcggcgtccattgcgcgtccatcgctttaggcacttttatctggcagcaacccattcctcccacacataacctggaagccccttcttccgagttaagggtggctctcgggttggctggttgcccactggaagaacacaatggcc，即SEQ ID NO：2。

实验例2

miR200b/c的PCR扩增：

PCR扩增引物序列如下：miR-200b的PCR引物：上游引物：5’GCTGCTGAATTCCATCTAATTTCCAAAAG3’，含酶切点位EcoRI；下游引物：5’TATTATGGATCCGCCCCCAGGGCAATGGG3’，含酶切点位BamHI；

miR-200c的PCR引物：上游引物：5’GTGCAGGAATTCCGCAGTAAAT GGGTGTGTTG3’，含酶切点位EcoRI；下游引物：5’ATGATGGGATCCGG CCATTGTGTTCTTCCAGT3’，含酶切点位BamHI。

PCR反应条件为：94℃5min，94℃30s，50℃40s，72℃30s，32个循环。

实验例3

重组质粒的构建：

3.1、将PCDH-copGFP载体及miR200b/c前体的基因片段进行双酶切处理，得到酶切产物。

miR200b/c前体的基因片段酶切体系：BamI l.5ul、EcoRI 1.5ul、Buffer 5ul、BSA0.5ul、PCR产物20ul、水15ul。

PCDH-copGFP载体酶切体系：BamI l.5ul、EcoRI 1.5ul、Buffer 5ul、BSA 0.5ul、PCDH-copGFP 10ul、水30ul。

将PCDH-copGFP载体及miR200b/c前体的基因片段分别在37℃下进行水浴酶切6小时，得到酶切产物。

3.2、对所述酶切产物进行纯化处理，并利用T4连接酶将miR200b/c的基因片段与PCDH-copGFP载体进行连接得到连接物。

先对酶切产物进行电泳、割胶纯化和电泳定量处理。再离心管中加入PCDH-copGFP1.5ul、PCR纯化产物12ul、2 xLigation Master Mix 5ul、otal25ul以及去离子水，在14℃下连接4小时，得到连接物。

3.3、取所述连接物转化E.coli DH5α感受态细菌，并置于LB培养基中培养并抽其质粒。

取感受态细菌120ul，冰浴10分钟后加入连接产物6ul，混合均匀。加入400ul LB培养基，混合均匀。将菌液接种于含氨苄青霉素和IPTG(每块平板加100ul)/X-Gal(每块平板加10ul)的选择性LB培养皿中。培养皿于37℃正放30min后倒置培养过夜。挑取单个白色菌落，接种于5ml含有氨苄青霉素(100ug/m1)的LB培养基中。37℃振摇过夜，振速为200rpm。

3.4、挑取阳性质粒并用BamHI和EcoRI双酶切鉴定，并进行测序分析，以确定慢病毒表达载体构建成功。

挑取阳性质粒，经LB培养基扩增后，做菌液PCR以鉴定是否含有目的片段。具体地，挑取平板上的质粒，培养过夜，进行质粒抽提，并对该质粒进行酶切鉴定。37℃酶切4小时后电泳鉴定，将鉴定为正确的质粒交由进行测序，测序完毕后采用Blast软件进行比对，进而确定慢病毒表达载体是否构建成功。

根据本发明实施例提供的神经母细胞miR-200b/c高表达的慢病毒表达载体及构建方法，利用miR200b/c基因序列酶切插入PCDH-copGFP载体中得到miR200b/c高表达的慢病毒表达载体，其转染效率高，可在神经母细胞中稳定地抑制miRNA-200b/c表达，进而对基因表达起到调控作用。

以上所述仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是在本发明的发明构思下，利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构变换，或直接/间接运用在其他相关的技术领域均包括在本发明的专利保护范围内。

序列表

<110> 深圳市疾病预防控制中心（深圳市卫生检验中心、深圳市预防医学研究所）

<120> 神经母细胞miR-200b/c高表达的慢病毒表达载体及其构建方法

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 501

<212> DNA

<213> 人工序列(rengongxulie)

<400> 1

cgcagtaaat gggtgtgttg gagggcaggg acaggccgtg gaatgggggg ggggggactg 60

gctcgcaggt ggatagtaga ggctacagaa agctggtttt ggcctcagtg atgggcaagt 120

cagggtaggc ctggtgggga gcagccaggc tctcccggaa gtgtcccaaa tgacgcggag 180

gtgggggatg ggagcaggag atctgccgct tctcttgagg ggcttgggct tagccagggc 240

tgatcttgaa ggtggactgg ttgggtaggg gccctcgtct tacccagcag tgtttgggtg 300

ctggttggga gtctctaata ctgccgggta atgatggagg cccctgtccc agtgtcatcg 360

gcgtccattg cgcgtccatc gctttaggca cttttatctg gcagcaaccc attcctccca 420

cacataacct ggaagcccct tcttccgagt taagggtggc tctcgggttg gctggttgcc 480

cactggaaga acacaatggc c 501

<210> 2

<211> 511

<212> DNA

<213> 人工序列(rengongxulie)

<400> 2

catctaattt ccaaaagaga acttgatctt acttcaagct gttgacctct ccactaccta 60

tctttggaga tgagaatgca gggctttctg ctgttgtcct gaaggggtgc cctccttctg 120

caatgctctg gggattagga cacttaggca tctgggccct gcccatggaa tctagtcatc 180

ttcaactccc tgctaggcgg cctccatatc caacttgggc agccgtggcc atcttactgg 240

gcagcattgg atagtgtctg atctctaata ctgcctggta atgatgacgg cggagccctg 300

catgcagcaa tggagccgcc tcctgatccc agcctccagg ggccccagtt ccacacctca 360

cctaccttat ccaaggtagg gctatggggc aaagagttag ccttggcgat atgggtggtg 420

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