STAT3ER慢病毒表达载体的构建及体外对神经元再生作用的研究

摘要

目的构建携带信号转导和转录激活蛋白STAT3和基因突变的雌激素受体ER的慢病毒载体,并转染受损的大鼠背根神经节神经元,研究其对神经元突起再生的作用。方法运用基因重组技术,将STAT3、ER和核糖体介导的绿色荧光蛋白(IRES-GFP)片段插入慢病毒载体pRRL-MCS+的PmeI位点构建慢病毒载体pRRL-STAT3ER-IRES-GFP,经RT-PCR、Western blotting和测序分析加以鉴定其正确性。将慢病毒载体3质粒细胞包装系统(主体质粒pRRL-STAT3ER-IRES-GFP、包装质粒pCMVdeltaR8.74和包膜质粒VSV-G)共转染293T细胞,包装慢病毒载体并测定滴度。切断大鼠左L5近神经节的神经根,摘取L5背根神经节做分离神经元培养,将pRRL-STAT3ER-IRES-GFP感染神经元细胞并观察神经元细胞核转运和突起的长度。结果构建的慢病毒载体pRRL-STAT3ER-IRES-GFP经RT-PCR和Western blotting鉴定正确,测序分析与Genbank报道的STAT3基因序列完全一致。3质粒共转染293T细胞后,测定慢病毒滴度为1010-11TU/ml。转染pRRL-STAT3ER-IRES-GFP的神经元经4-羟基三苯氧胺(4HT)激活,STAT3ER有明显的核转运,并增强突起的生长,经χ2检验与对照组有显著性差异。结论成功构建了表达小鼠STAT3ER基因的慢病毒载体并证实STAT3信号转导有利于轴突生长。