通过色谱方法分离VWF和VWF前肽

摘要

本发明涉及一种通过孵育组合物将成熟冯·维勒布兰德因子(mat‑VWF)与冯·维勒布兰德因子前肽(VWF‑PP)分离的方法，所述方法包括通过破环非共价缔合的mat‑VWF和VWF‑PP来诱导mat‑VWF和VWF‑PP的解离，其中所述解离是通过以下诱导：(i)加入至少一种螯合剂，或(ii)将pH值增加到至少7的pH值，然后收集所述mat‑VWF以获得高纯度的去除前肽的成熟VWF(mat‑VWF)。

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求2018年3月21日提交的美国临时申请第62/646,109号的优先权，所述临时申请以引用的方式整体并入本文中。

发明领域

本发明涉及用于将冯·维勒布兰德因子(von Willebrand Factor，VWF)与冯·维勒布兰德因子前肽(VWF-PP)分离的方法。

发明背景

在细胞内蛋白质成熟的过程中，即将成熟的蛋白质经历翻译后修饰。这些修饰尤其包括乙酰化、甲基化、糖基化和蛋白水解裂解。在很多情况下这些修饰是蛋白质功能和活性所必需的，并且它们还可能影响蛋白质、尤其酶的效率。

前蛋白或蛋白前体是非活性的蛋白质，它们通过这些翻译后修饰中的一者或多者，尤其通过从前蛋白裂解前肽而变成活性形式。

这些蛋白质的活性形式可能是有用的治疗性和/或诊断性蛋白。然而，活性蛋白质在活的生物体的可利用量通常极低。因而，活性蛋白质从其前蛋白重组产生，所述前蛋白优选在体外通过与重组活化酶(例如蛋白酶)接触而活化。

冯·维勒布兰德因子(VWF)是一种在血浆中循环的糖蛋白，是一系列尺寸在约500至20,000kD范围内变化的多聚体。已经克隆VWF的全长cDNA；前多肽与全长前VWF原的氨基酸残基23至764对应(Eikenboom等人(1995)Haemophilia,1,77-90)。VWF的多聚体形式由通过二硫键连接在一起的250kD多肽亚基构成。VWF介导与损伤血管壁的内皮下膜的初始血小板粘附，其中较大的多聚体展现增强的止血活性。多聚VWF通过VWF的A1结构域中的相互作用，结合于血小板表面糖蛋白Gp1bα，促进血小板粘附。VWF上的其它位点介导与血管壁的结合。因此，VWF在血小板与血管壁之间形成桥，这对高剪切应力条件下的血小板粘附和初期止血来说是不可或缺的。通常，内皮细胞分泌VWF的大多聚体形式和VWF的具有较低分子量的由蛋白水解裂解产生的那些形式。异常大分子质量的多聚体存储在内皮细胞的韦伯潘力氏小体(Weibel-Pallade body)中，并在例如凝血酶和组胺的激动剂刺激后释出。

工业上，VWF、尤其重组VWF(rVWF)与rFVIII一起在基因工程化的细胞系例如工程化的CHO细胞系中一起合成和表达。共同表达的rVWF的功能是在细胞培养过程中使rFVIII稳定。rVWF在细胞中合成为VWF前肽原(前VWF原)，所述VWF前肽原含有连接至成熟VWF(matVWF)亚基的N端的大前肽(VWF-PP)。在内质网和高尔基体(Golgi apparatus)中成熟之后，VWF-PP在细胞蛋白酶弗林蛋白酶(furin)的作用下裂解，并呈相同亚基的均聚物形式分泌，所述均聚物由表达的蛋白质的二聚体组成。在一些情况下，弗林蛋白酶裂解产生异二聚体复合物，所述复合物包含与VWF前肽非共价缔合的成熟VWF。

VWF-PP可以通过在体外用弗林蛋白酶或弗林蛋白酶样蛋白酶处理而与成熟VWF分离(Schlokat U.等人(1996)Biotechnol.Appl.Biochem.24:257-267；Preininger A.等人(1999)Cytotechnology 30:1-15)。弗林蛋白酶属于前蛋白转化酶家族并且依赖于Ca

当前的常规方法通过以下来产生成熟VWF：将VWF前肽原与蛋白酶在液相中一起孵育，其中成熟本身(例如前肽从前蛋白裂解)在游离的溶液中以未结合状态发生，或者如例如在WO2000/049047中描述，通过将蛋白酶固定在固体载体上，所述固体载体与包含VWF-PP的制剂接触和一起孵育(参见例如WO2000/049047)。VWF是通过内皮细胞和巨核细胞合成为VWF前肽原(“前VWF原”)，所述VWF前肽原基本上由重复结构域组成。在信号肽裂解后，前VWF原在内质网中通过羧基端区域的二硫连键二聚。在高尔基体中，在亚基的氨基端附近形成额外的二硫连键，从而形成多聚体。装配成多聚体，随后VWF前肽通过加工前肽的蛋白酶弗林蛋白酶进行蛋白水解裂解。在裂解之后，VWF前肽仍然与VWF多聚体非共价缔合，形成成熟VWF/VWF-PP复合物。在刺激之后，复合物分泌至血液中，并且VWF前肽从VWF多聚体解离。治疗有效的成熟VWF多聚体可以通过在哺乳动物细胞系中重组表达前VWF并通过一系列体外裂解和纯化步骤将前VWF蛋白质加工成成熟VWF来产生。然而，本领域中仍然需要产生高纯度的治疗有效的成熟VWF多聚体制剂(mat-rVWF)的方法，并且本发明通过提供获得高纯度的mat-rVWF制剂的方法满足了这种需要，其中所述方法包括例如在弗林蛋白酶成熟之后加入螯合剂和/或在纯化过程期间将pH值增加至至少7的pH值，以促进VWF-前肽与mat-rVWF分离。

发明概要

本发明提供了一种获得包含高纯度的去除前肽的成熟重组rVWF(mat-rVWF)的组合物的方法，所述方法包括以下步骤：

a)提供包含mat-rVWF/rVWF-PP复合物、mat-rVWF和rVWF前肽(rVWF-PP)的溶液；

b)诱导所述mat-rVWF/rVWF-PP复合物在a)中的所述溶液中解离成mat-rVWF和rVWF-PP，其中所述解离通过破环非共价缔合的mat-rVWF和rVWF-PP而进行，其中所述解离是通过以下诱导：

i.加入至少一种螯合剂，或

ii.将pH值增加至至少7的pH值；以及

c)收集所述mat-rVWF，以获得高纯度的mat-rVWF组合物，其中所述高纯度的mat-rVWF组合物包含至少95％成熟rVWF和少于5％rVWF-PP。

在一些实施方案中，高纯度的mat-rVWF组合物包含至少96％mat-rVWF和少于4％rVWF-PP、至少97％mat-rVWF和少于3％rVWF-PP、至少98％mat-rVWF和少于2％rVWF-PP、至少99％mat-rVWF和少于1％rVWF-PP或至少99.5％mat-rVWF和少于0.5％rVWF-PP或99.9％mat-rVWF和少于0.1％rVWF-PP。

在一些实施方案中，溶液选自由以下组成的组：细胞培养基、抗体柱流过溶液和缓冲溶液。

在一些实施方案中，在步骤a)之前溶液已用弗林蛋白酶处理。

在一些实施方案中，溶液是抗体柱流过溶液。

在一些实施方案中，至少一种螯合剂是二价阳离子螯合剂。在一些实施方案中，二价阳离子螯合剂选自由以下组成的组：EDTA、EGTA、CDTA和柠檬酸盐。

在一些实施方案中，pH值增加到至少7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9或9.0。在一些实施方案中，pH值增加到至少约7.2至约7.8。在一些实施方案中，pH值增加到至少约7.6。在一些实施方案中，通过加入碱性氨基酸、Tris、NaOH、三(羟甲基)甲基甘氨酸或乙醇胺来增加pH值。

在一些实施方案中，本文所述的方法的步骤b)中的收集包括一种或多种蛋白质分离方法。在一些实施方案中，所述一种或多种蛋白质分离方法选自由以下组成的组：离子交换色谱法(IEC)、尺寸排阻色谱法(SEC)、通过膜技术的物理尺寸分离和亲和色谱法。在一些实施方案中，蛋白质分离方法是尺寸排阻色谱法(SEC)。在一些实施方案中，一种或多种蛋白质分离方法是离子交换色谱法(IEC)。在一些实施方案中，离子交换色谱法(IEC)是阳离子交换色谱法。在一些实施方案中，离子交换色谱法(IEC)是阴离子交换色谱法与阳离子交换色谱法的组合。

在一些实施方案中，一种或多种蛋白质分离方法包含缓冲液体系，其中所述缓冲液体系包含一种或多种缓冲液。在一些实施方案中，所述一种或多种缓冲液包括洗涤缓冲液，其中所述一种或多种洗涤缓冲液包括一种、两种、三种、四种和/或五种洗涤缓冲液，其中当所述一种或多种缓冲液包括五种洗涤缓冲液时，第一种、第二种、第三种和/或第五种洗涤缓冲液的pH值比第四种洗涤缓冲液高，并且当所述一种或多种缓冲液包括四种洗涤缓冲液时，第一种、第二种和/或第四种洗涤缓冲液的pH值比第三种洗涤缓冲液高。在一些实施方案中，所述方法在第一种洗涤缓冲液之后还包括病毒灭活处理步骤，并且任选地病毒灭活处理步骤的pH值比所述第三种和/或第四种洗涤缓冲液的pH值高。在一些实施方案中，一种或多种缓冲液包含所述一种或多种螯合剂。在一些实施方案中，一种或多种缓冲液展现至少7的pH值。

在一些实施方案中，或多种蛋白质分离方法包含缓冲液体系，其中所述缓冲液体系包含一种或多种上样缓冲液。在一些实施方案中，一种或多种上样缓冲液包含所述一种或多种螯合剂。在一些实施方案中，一种或多种上样缓冲液展现至少7的pH值。

在一些实施方案中，一种或多种蛋白质分离方法包含缓冲液体系，其中所述缓冲液体系包含一种或多种上样、洗涤和/或洗脱缓冲液。在一些实施方案中，一种或多种上样、洗涤和/或洗脱缓冲液包含所述一种或多种螯合剂。在一些实施方案中，一种或多种上样、洗涤和/或洗脱缓冲液展现至少7的pH值。在一些实施方案中，一种或多种上样、洗涤和/或洗脱缓冲液包含所述一种或多种螯合剂并展现至少7的pH值。

在一些实施方案中，缓冲液体系选自由以下组成的组：甘氨酸HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸)、TrisHCl(三(羟甲基)-氨基甲烷)、组氨酸、咪唑、乙酸盐柠檬酸盐、MES和2-(N-吗啉基)乙烷磺酸。

在一些实施方案中，缓冲液还包含一种或多种一价阳离子。在一些实施方案中，一种或多种一价阳离子选自由以下组成的组：Na+、K+、Li+和Cs+。在一些实施方案中，一价阳离子是Na+。

在一些实施方案中，缓冲液还包含一种或多种一价、二价和/或三价阴离子。在一些实施方案中，一种或多种一价、二价和/或三价阴离子选自由以下组成的组：Cl

在一些实施方案中，缓冲液体系包含至少一种在25℃下电导率≥0.5mS/cm的缓冲液。在一些实施方案中，缓冲液体系包含至少一种在25℃下电导率为15.0±0.2mS/cm的缓冲液。

在一些实施方案中，缓冲液还包含一种或多种非离子型洗涤剂。在一些实施方案中，非离子型洗涤剂选自由以下组成的组：Triton X100、Tween 80和Tween 20。

在一些实施方案中，缓冲液还包含一种或多种选自由以下组成的组的额外物质：非还原糖、糖醇和多元醇。

在一些实施方案中，高纯度的mat-rVWF组合物包含≤2.0％的宿主细胞(HC)杂质水平。在一些实施方案中，高纯度的mat-rVWF组合物包含≤0.6％的宿主细胞(HC)杂质水平。

在一些实施方案中，包含mat-rVWF/rVWF-PP复合物、mat-rVWF和rVWF-PP的溶液来源于rVWF的捕获步骤。

在一些实施方案中，包含mat-rVWF/rVWF-PP复合物、mat-rVWF和rVWF-PP的溶液来源于包括FVIII免疫亲和步骤和阴离子交换色谱法步骤的方法。

本发明还提供了一种用于获得包含高纯度的去除前肽的成熟重组rVWF(高纯度的mat-rVWF)的组合物的方法，所述方法包括以下步骤：

a)将包含前rVWF、mat-rVWF/rVWF-PP复合物、mat-rVWF和/或rVWF前肽(rVWF-PP)的溶液上样至阴离子交换柱上，其中所述前rVWF、mat-rVWF/rVWF-PP复合物和mat-rVWF结合于所述阴离子交换柱；

b)将a)中含有所述结合的前rVWF、mat-rVWF/rVWF-PP复合物和mat-rVWF的所述阴离子交换柱用一种或多种洗涤缓冲液洗涤；

c)将b)中包含所述结合的前rVWF、mat-rVWF/rVWF-PP复合物和mat-rVWF的所述柱用弗林蛋白酶处理，其中所述弗林蛋白酶使所述前rVWF裂解成mat-rVWF和rVWF-PP；

d)用洗脱缓冲液将所述结合的前rVWF、mat-rVWF/rVWF-PP复合物和mat-rVWF从c)中的所述柱洗脱，其中所述洗脱缓冲液诱导所述rVWF-PP从与所述rVWF-PP非共价缔合的mat-rVWF解离，并且其中所述解离是通过以下诱导：

i.将至少一种螯合剂加入至所述洗脱缓冲液中，或

ii.将所述洗脱缓冲液的pH值增加到至少7的pH值；以及

e)将所述mat-rVWF与所述rVWF-PP分开收集，以获得高纯度的mat-rVWF组合物，其中所述高纯度的mat-rVWF组合物包含至少95％成熟rVWF和少于5％rVWF-PP。

在一些实施方案中，a)和b)在单个步骤中同时发生。

在一些实施方案中，所述一种或多种缓冲液包括洗涤缓冲液，其中所述一种或多种洗涤缓冲液包括一种、两种、三种、四种和/或五种洗涤缓冲液，其中当所述一种或多种缓冲液包括五种洗涤缓冲液时，第一种、第二种、第三种和/或第五种洗涤缓冲液的pH值比第四种洗涤缓冲液高，并且当所述一种或多种缓冲液包括四种洗涤缓冲液时，第一种、第二种和/或第四种洗涤缓冲液的pH值比第三种洗涤缓冲液高。在一些实施方案中，所述方法在第一种洗涤缓冲液之后还包括病毒灭活处理步骤，并且任选地病毒灭活处理步骤的pH值比所述第三种和/或第四种洗涤缓冲液的pH值高。

在一些实施方案中，a)中的溶液包含来自单克隆抗体柱的流过物，其中所述单克隆抗体是FVIII单克隆抗体。

在一些实施方案中，a)中的溶液选自由以下组成的组：细胞培养基、抗体柱流过溶液和缓冲溶液。

在一些实施方案中，至少一种螯合剂是二价阳离子螯合剂。在一些实施方案中，二价阳离子螯合剂选自由以下组成的组：EDTA、EGTA、CDTA和柠檬酸盐。

在一些实施方案中，pH值增加到至少7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或8.0。在一些实施方案中，pH值增加到至少约7.2至约7.8。在一些实施方案中，pH值增加到至少约7.6。在一些实施方案中，通过加入碱性氨基酸增加pH值。在一些实施方案中，b)中的一种或多种洗涤缓冲液包含所述一种或多种螯合剂。在一些实施方案中，b)中的一种或多种缓冲液展现至少7的pH值。在一些实施方案中，b)中的一种或多种缓冲液包含所述一种或多种螯合剂并展现至少7的pH值。

在一些实施方案中，所述方法还包括病毒灭活步骤，其中所述病毒灭活发生在洗涤步骤和/或洗脱步骤之前、之后或同时，但在收集步骤之前。在一些实施方案中，病毒灭活处理使脂质包膜病毒灭活。在一些实施方案中，病毒灭活处理是溶剂和洗涤剂(S/D)处理。

在一些实施方案中，一种或多种缓冲液包含选自由以下组成的组的缓冲液：甘氨酸HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸)、TrisHCl(三(羟甲基)-氨基甲烷)、组氨酸、咪唑、乙酸盐柠檬酸盐、MES和2-(N-吗啉基)乙烷磺酸。

在一些实施方案中，一种或多种缓冲液还包含一种或多种一价阳离子。在一些实施方案中，一种或多种一价阳离子选自由以下组成的组：Na+、K+、Li+和Cs+。在一些实施方案中，一价阳离子是Na+。

在一些实施方案中，一种或多种缓冲液还包含一种或多种一价、二价和/或三价阴离子。在一些实施方案中，一种或多种一价、二价和/或三价阴离子选自由以下组成的组：Cl

在一些实施方案中，一种或多种缓冲液包含至少一种在25℃下电导率≥0.5mS/cm的缓冲液。在一些实施方案中，一种或多种缓冲液包含至少一种在25℃下电导率为15.0±0.2mS/cm的缓冲液。

在一些实施方案中，一种或多种缓冲液还包含一种或多种非离子型洗涤剂。在一些实施方案中，非离子型洗涤剂选自由以下组成的组：Triton X100、Tween 80和Tween 20。

在一些实施方案中，所述一种或多种缓冲液还包含一种或多种选自由以下组成的组的额外物质：非还原糖、糖醇和多元醇。

在一些实施方案中，高纯度的mat-rVWF组合物包含≤2.0％的宿主细胞(HC)杂质水平。在一些实施方案中，高纯度的mat-rVWF组合物包含≤0.6％的宿主细胞(HC)杂质水平。

在一些实施方案中，高纯度的mat-rVWF组合物用于产生药物组合物。

本发明还提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含通过根据前述权利要求中的任一项的方法产生的高纯度的mat-rVWF和药学上可接受的缓冲液。在一些实施方案中，药物组合物包含50mM甘氨酸、10mM牛磺酸、5％(w/w)蔗糖、5％(w/w)D-甘露糖醇、0.1％聚山梨醇酯80、2mM CaCl

从下面的详细描述将显而易见本发明的其它目标、优点和实施方案。

附图说明

图1示出了如实施例1中所表示的成熟rVWF在阳离子交换器上的纯化。

图2提供了纯化结果的表。

图3示出了银染色的蛋白质凝胶和蛋白质印迹，说明mat-VWF和r-VWF前肽(rVWF-PP)通过实施例1的方法的分离。

图4示出了实施例2和3的实验设置的流程图。

图5示出了实施例2的色谱图和用于实施例2和3的色谱法方案。

图6提供了实施例2的所用试剂的表和结果的表。

图7示出了实施例2的另一个色谱图和实施例3的结果的表。

图8示出了银染色的蛋白质凝胶，说明mat-rVWF和rVWF前肽(rVWF-PP)通过实施例2和实施例3的方法的分离。

图9示出了蛋白质印迹，说明rVWF和rVWF前肽通过实施例2和实施例3的方法的分离。

图10示出了实施例4的色谱图、色谱法方案和缓冲液组成。

图11提供了实施例4的结果的表。

图12示出了银染色的蛋白质凝胶和蛋白质印迹，说明mat-rVWF和rVWF前肽(rVWF-PP)通过实施例4的方法的分离。

图13示出了实施例5的色谱图、色谱法方案和缓冲液组成。

图14提供了实施例5的结果的表。

图15示出了实施例6的色谱图、色谱法方案和缓冲液组成。

图16提供了实施例6的结果的表。

图17示出了实施例7的色谱图、色谱法方案和缓冲液组成。

图18提供了实施例7的结果的表。

图19示出了实施例8的色谱图、色谱法方案和缓冲液组成。

图20提供了实施例8的结果的表。

图21示出了银染色的蛋白质凝胶，说明mat-rVWF和rVWF前肽(rVWF-PP)通过实施例8的方法的分离。

图22示出了蛋白质印迹，说明rVWF和rVWF前肽通过实施例8的方法的分离。1％琼脂糖凝胶示出产物的多聚体图案。

图23示出了蛋白质印迹，说明mat-rVWF和rVWF前肽(rVWF-PP)通过实施例8的方法的分离。

图24示出了实施例9的色谱图、色谱法方案和缓冲液组成。

图25提供了实施例9的结果的表。

图26提供了实施例9的产物的表。

图27示出了银染色的蛋白质凝胶，说明rVWF和rVWF前肽通过实施例9的方法的分离。

图28示出了蛋白质印迹，说明rVWF和rVWF前肽通过实施例9的方法的分离。1％琼脂糖凝胶示出产物的多聚体图案。

图29示出了蛋白质印迹，说明rVWF和rVWF前肽通过实施例9的方法的分离。

图30示出了如用于实施例1、2、3、6、8和9的增强阳离子交换色谱法(CEX)所获得的含有产物的洗脱份的纯度。

图31示出了实施例1、2、3、6、8和9的产物相关杂质的去除因数(depletionfactor)。

图32示出了如用于实施例4和5的增强尺寸排阻色谱法(SEC)所获得的含有产物的洗脱份的纯度。

图33示出了实施例4和5的产物相关杂质的去除因数。

图34示出了TMAE分离方法中使用的缓冲液配方和材料。

图35示出了经过弗林蛋白酶加工的成熟VWF/VWF-前肽复合物的上样条件。

图36示出了色谱法的缓冲液、条件、参数和流速的细节。

图37示出了经过弗林蛋白酶加工的成熟VWF/VWF-前肽复合物解离成成熟VWF和VWF-前肽(VWF-PP)的色谱图。其示出了VWF-PP从含有成熟VWF的洗脱份的去除。

图38示出了成熟VWF和VWF-前肽(VWF-PP)的分离的另一色谱图。其示出了VWF-PP从含有成熟VWF的洗脱份的去除。

图39A和图39B提供了用于纯化成熟VWF的示例性方法的示意图，所述方法包括分离成熟VWF和VWF-PP。

图40提供了突出本文所述的阳离子交换色谱法的一些优点的表。

图41示出了两种色谱图的示意图，所述色谱图示出使用本文所述的尺寸排阻色谱法，使用含有柠檬酸盐的SQA运行缓冲液或SQC运行缓冲液对rVWF前肽的分离。除增加残留VWF-PP的除去/分离之外，SEC参数(SEC缓冲液)的变化未引起成熟VWF纯化的变化。

图42提供了突出优化SEC缓冲液(SQC缓冲液)的一些优点的表。SQC缓冲液包括至少一种螯合剂并且显示降低纯化的成熟VWF洗脱份中的VWF-PP的量。

图43A和图43B提供了rVWF的下游加工方案的流程图。图43A示出当前使用的工艺。图43B示出本文所述的工艺，所述工艺包括改良的CAT(UNO_S)步骤。

图44提供了第一代(Gen 1)工艺和第二代(Gen 2)工艺中步骤CAT的色谱法硬件的表。

图45描绘了Gen 2工艺的洗涤和洗脱条件的表。

图46示出了UNO_Sphere S上的第一代和第二代rVWF小规模精制步骤(步骤CAT)的比较表。

图47描绘了UNO_Sphere S柱的净化和清洁程序的表。

图48描绘了CAT精制步骤的缓冲液的组成的表。

图49A和图49B示出运行VW_USS_05的色谱图。图49A示出整个色谱图，包括CIP程序。图49B描绘36％缓冲液B洗涤和梯度洗脱相。UV吸收以蓝色(280nm)和洋红色(254nm)显示。

图50描绘运行VW_UUS_05的SDS-PAGE银染色凝胶和蛋白质印迹。

图51描绘了运行VW_UUS_05的多聚体琼脂糖凝胶。

图52示出了研究的不同运行的rVWF:Ag数据。

图53示出了研究的不同运行的rVWF Risto Co活性数据。

图54示出了研究的不同运行的前肽浓度(前肽(μg/mg rVWF:Ag))数据。

图55示出了研究的不同运行的前肽浓度(前肽(μg PP/1000U Risto))数据。

图56示出了研究的不同运行的洗脱池中的分析关键结果。

图57示出成功方法发展的指标CAT-E标准。

图58提供了用于分离mat-rVWF和rVWF-PP的阴离子交换、阳离子交换和尺寸排阻色谱法的示例性实施方案。

图59示出各种VWF形式：前-VWF(又称为前-rVWF)、matVWF/VWF-PP复合物(又称为mat-rVWF/VWF-PP复合物)、matVWF(又称为mat-rVWF)和VWF-PP(又称为rVWF-PP)。

图60示出了VWF核酸和氨基酸序列。

图61示出了DF3338/042蛋白质印迹和原始分析数据。

图62示出了DF3362/023蛋白质印迹和原始分析数据。

图63示出了来自图61和图62的数据的比较。

图64示出了示例性VWF-FVIII融合蛋白的氨基酸序列，其中活性FVIII嵌入VWF基元中(VWF 764至1336-FVIII重链24至760-VWF 2218至2593-FVIII轻链1333至2351-VWF2620至2813)。

图65示出了示例性VWF-FVIII融合蛋白的氨基酸序列，其中n-糖基化富集结构域置换FVIII-B-结构域(FVIII重链19至760-vWF2218至2593-FVIII轻链1333至2351)。

图66描绘了在实施例14中描述的变化vWF纯化工艺中所用的缓冲液和组成的表。

图67示出了运行VW_USS_07的色谱图和色谱图方案。

图68示出了运行的分析关键结果。

图69示出了代表性运行的SDS-PAGE银染色凝胶。在洗涤步骤洗涤1、WSD和洗涤2期间观察到rvWF-前肽的去除。

图70描绘了在实施例15中描述的变化vWF纯化工艺中所用的缓冲液和组成的表。本实施例提供了在弗林蛋白酶裂解之后将r-vWF前肽与r-VWF多肽分离以测试额外唾液酸化的替代的变化实施方案。

图71示出了运行VW_USS_06的色谱图和色谱图方案。

图72示出了运行的分析关键结果。

图73示出了代表性运行的SDS-PAGE银染色凝胶。

图74描绘了在实施例16中描述的变化vWF纯化工艺中所用的缓冲液和组成的表。

图75示出了运行VW_USS_08的色谱图和色谱图方案。

图76示出了包括唾液酸化率的运行的分析关键结果。

图77示出了代表性运行的SDS-PAGE银染色凝胶DFM07247。

图78描绘了来自VW_USS_06和VW_USS_08运行的洗脱物的唾液酸化概况。

具体实施方式

I.简介

本文所述的方法分离成熟VWF和VWF前肽，所述成熟VWF和VWF前肽已经从包含成熟VWF和VWF前肽的非共价连接的异二聚体复合物解离。通过加入至少一种螯合剂和/或通过将包含成熟VWF和VWF前肽的溶液的pH值增加到至少7.0来促进(诱导)此分离，形成一种蛋白质分离方法。所有的如本文所述的增强阴离子交换(AEX)、阳离子交换(CEX)和/或尺寸排阻色谱法(SEC)方法可以组合成任何变体，以获得具有改良特性的r-vWF。

II.精选定义

术语“重组”在提及例如细胞或核酸、蛋白质或载体使用时指示所述细胞、核酸、蛋白质或载体已经通过引入异源核酸或蛋白质或者改变天然核酸或蛋白质而被修饰，或者细胞来源于如此修饰的细胞。因此，举例来说，重组细胞表达在细胞的天然(非重组)形式内未被发现的基因，或表达在其它方面异常表达、表达不足或一点都不表达的天然基因。

如本文所用，“重组VWF”或“rVWF”包括通过重组DNA技术获得的VWF。在某些实施方案中，本发明的rVWF蛋白可以包含例如如US 8,597,910中所述的构建体，其中关于产生重组VWF的方法的部分以引用的方式并入本文中。本发明中的VWF可以包括所有潜在形式，包括单体和多聚体形式。还应了解，本发明涵盖组合使用的VWF不同形式。举例来说，本发明的VWF可以包括不同的多聚体、不同的衍生物和生物学上活性的衍生物与非生物学上活性的衍生物。

在本发明的背景下，重组VWF涵盖来自例如哺乳动物，例如灵长类动物、人、猴、兔、猪、啮齿动物、小鼠、大鼠、仓鼠、沙鼠、犬科动物、猫科动物的VWF家族的任何成员和它的生物学上活性衍生物。还涵盖具有活性的突变和变异VWF蛋白，以及VWF蛋白的功能片段和融合蛋白。此外，本发明的VWF还可以包含促进纯化、检测或两者的标签。本文所述的VWF可以进一步用治疗性部分或适于体外或体内成像的部分修饰。

术语“VWF多聚体”是指包含至少10个亚基或12个、14个或16个亚基至约20个、22个、24个或26个亚基或更多个亚基的VWF。术语“亚基”是指VWF的单体。如本领域中已知，一般地，VWF的二聚体聚合形成更大级别的多聚体。(参见例如Turecek等人,Semin.Thromb.Hemost.,2010,36(5):510-521，出于所有目的并且尤其关于VWF的多聚体分析的所有传授内容，以引用的方式整体并入本文中)。

术语“VWF前肽原”、“前VWF原”或“前VWF”是指包含约22个氨基酸残基的信号肽、约741个氨基酸残基的VWF前肽和约2050个氨基酸残基的成熟VWF亚基的非成熟VWF多肽。前VWF亚基可以在内质网中通过其羧基端附近的二硫键二聚，形成尾-尾二聚体，然后被输送至高尔基体。在高尔基体中，在亚基的氨基端附近形成额外的头-头二硫键，从而形成多聚体。VWF前肽的蛋白水解裂解是通过加工蛋白酶弗林蛋白酶发生的，因此产生成熟VWF/VWF-PP复合物。当在VWF名称之前包括“r”时，这是指重组型式。在一些实施方案中，本文所述的方法适用于重组VWF(rVWF)。

术语“VWF复合物”或“mat-VWF/VWF-PP复合物”是指包含成熟VWF亚基和VWF前肽的非共价连接的异二聚体结构。VWF复合物可以作为VWF前肽原的前肽部分与成熟VWF部分之间的弗林蛋白酶裂解产物产生。当在VWF名称之前包括“r”时，这是指重组型式。在一些实施方案中，本文所述的方法适用于重组VWF(rVWF)。

术语“成熟VWF”或“mat-VWF”是指约2050个氨基酸残基的成熟VWF亚基。成熟VWF亚基可以是VWF前肽原或VWF复合物的一部分。成熟VWF在从VWF前肽分离(分离)后可以称为“游离的VWF”。当在VWF名称之前包括“r”时，这是指重组型式。在一些实施方案中，本文所述的方法适用于重组VWF(rVWF)。

术语“VWF前肽”或“VWF-PP”是指约741个氨基酸残基的VWF前肽。VWF前肽可以是VWF前肽原或VWF复合物的一部分。举例来说，在VWF复合物中，VWF前肽与成熟VWF亚基非共价缔合。VWF前肽在从成熟VWF分离(分离)后可以称为“游离的VWF前肽”。当在VWF名称之前包括“r”时，这是指重组型式。在一些实施方案中，本文所述的方法适用于重组VWF(rVWF)。

术语“分离的”、“纯化的”或“生物学上纯”是指基本上(substantially或essentially)不含在天然状态下发现通常相伴随的组分。纯度和均一性通常使用例如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱法的分析化学技术测定。VWF是基本上纯化的制剂中存在的主要物质。在一些实施方案中，术语“纯化的”表示核酸或蛋白质在电泳凝胶中产生基本上一条亮带(band)。在其它实施方案中，意味着核酸或蛋白质是至少50％纯，更优选至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更纯。在其它实施方案中，“纯化(Purify或purification)”意指从有待纯化的组合物除去至少一种污染物。在这种意义上讲，纯化不要求所纯化的化合物是同质的，例如100％纯。

如本文所用，术语“约”表示规定值加或减10％的近似范围。举例来说，用语“约20％”涵盖18-22％的范围。

III.实施方案的详细描述

本发明涉及一种获得包含游离的成熟重组冯·维勒布兰德因子(rVWF)的高度纯的组合物的方法，所述方法包括以下步骤：使用包含至少一种螯合剂或具有至少7的pH值的溶液(例如解离溶液)将成熟rVWF与rVWF前肽解离；将游离的成熟rVWF与rVWF前肽分离；以及收集游离的成熟rVWF组合物，所述组合物包含至少95％游离的成熟rVWF和少于5％rVWF前肽。

本发明的方法尤其适合于成熟VWF与其VWF前肽的体外分离。在一些实施方案中，通过将一种或多种螯合剂加入至包含成熟VWF和VWF-PP的溶液中，将溶液pH值增加到至少7.0或它们的组合来诱导分离。在一些实施方案中，pH值增加到pH 7.0至pH 9.0的范围。

分离方法可以包括使用一种或多种蛋白质分离方法，例如但不限于用于分离成熟VWF与VWF-PP的色谱法。所述方法可以产生高纯度的游离的成熟rVWF组合物。在一些实施方案中，游离的成熟rVWF组合物包含至少95％游离的成熟rVWF和少于5％游离的rVWF-PP和/或matVWF/VWF-PP复合物。在一些情况下，游离的成熟rVWF组合物包含至少96％游离的成熟rVWF和少于4％游离的rVWF-PP和/或matVWF/VWF-PP复合物、至少97％游离的成熟rVWF和少于3％游离的rVWF-PP和/或matVWF/VWF-PP复合物、至少98％游离的成熟rVWF和少于2％游离的rVWF-PP和/或matVWF/VWF-PP复合物、至少99％游离的成熟rVWF和少于1％游离的rVWF-PP和/或matVWF/VWF-PP复合物、至少99.5％游离的成熟rVWF和少于0.5％游离的rVWF-PP和/或matVWF/VWF-PP复合物。

a.

在本发明方法的一方面，使用阴离子交换(AEX)色谱法将成熟rVWF(mat-rVWF)与rVWF-PP分离。在一些情况下，从成熟VWF除去剩余的源自宿主细胞的杂质，例如CHO宿主细胞蛋白；工艺相关的杂质，例如重组弗林蛋白酶和低分子量病毒灭活试剂；培养基化合物，例如大豆蛋白胨；和其它产物相关杂质。

在本发明方法的另一方面，使用阴离子交换色谱法将成熟rVWF与例如残留rVWF-PP或游离的rVWF-PP的rVWF-PP分离。为了分离，起始组合物、上样溶液或上样组合物可以包含低pH值和至少一种螯合剂。上样组合物可以施加于以流过模式操作的阴离子交换器。在一些实施方案中，上样溶液包含前rVWF、mat-rVWF/rVWF-PP复合物、mat-rVWF和/或rVWF前肽(rVWF-PP)。在一些实施方案中，阴离子交换器以结合模式操作，且使用包含至少一种螯合剂的梯度洗脱缓冲液分离成熟VWF和VWF-PP。在其它实施方案中，梯度洗脱缓冲液具有中性至高pH值，例如在pH 6.0至pH 9.0范围内的pH值。在另一个实施方案中，梯度洗脱缓冲液包含一种或多种螯合剂并具有7.0或更高的pH值，例如pH 7.0至pH 9.0。举例来说，梯度洗脱缓冲液可以包括EDTA并具有8.5的pH值。

在一些实施方案中，本发明提供了一种获得包含高纯度的去除前肽的成熟重组rVWF(高纯度的mat-rVWF)的组合物的方法，所述方法包括以下步骤：(a)将包含前rVWF、mat-rVWF/rVWF-PP复合物、mat-rVWF和/或rVWF前肽(rVWF-PP)的溶液上样至阴离子交换柱上，其中所述前rVWF、mat-rVWF/rVWF-PP复合物和mat-rVWF结合于所述阴离子交换柱；(b)将a)中含有所述结合的前rVWF、mat-rVWF/rVWF-PP复合物和mat-rVWF的所述阴离子交换柱用一种或多种洗涤缓冲液洗涤；(c)将b)中包含所述结合的前rVWF、mat-rVWF/rVWF-PP复合物和mat-rVWF的所述柱用弗林蛋白酶处理，其中所述弗林蛋白酶使所述前rVWF裂解成mat-rVWF和rVWF-PP；(d)用洗脱缓冲液将所述结合的前rVWF、mat-rVWF/rVWF-PP复合物和mat-rVWF从c)中的所述柱洗脱，其中所述洗脱缓冲液诱导所述rVWF-PP从与所述rVWF-PP非共价缔合的mat-rVWF解离，并且其中所述解离是通过以下诱导：(i)将至少一种螯合剂加入至所述洗脱缓冲液中，或(ii)将所述洗脱缓冲液的pH值增加到至少7的pH值；以及(e)将所述mat-rVWF与所述rVWF-PP分开收集，以获得高纯度的mat-rVWF组合物，其中所述高纯度的mat-rVWF组合物包含至少95％成熟rVWF和少于5％rVWF-PP。

在一些实施方案中，a)和b)在单个步骤中同时发生。在一些实施方案中，a)中的溶液包含来自免疫亲和纯化方法的流过物。在一些实施方案中，a)中的溶液包含来自单克隆抗体柱的流过物，其中所述单克隆抗体是FVIII单克隆抗体。在一些实施方案中，a)中的溶液选自由以下组成的组：细胞培养基、抗体柱流过溶液和缓冲溶液。

在步骤(b)的一些实施方案中，洗涤a)中的含有所述结合的前rVWF、mat-rVWF/rVWF-PP复合物和mat-rVWF的所述阴离子交换柱采用用一种或多种洗涤缓冲液洗涤，其中一种或多种洗涤缓冲液包括一种、两种、三种、四种和/或五种洗涤缓冲液。在一些实施方案中，第二洗涤缓冲液包含用于病毒灭活的组分。在一些实施方案中，当采用四种或五种洗涤缓冲液时，第二洗涤缓冲液包含用于病毒灭活的组分。在一些实施方案中，当采用四种或五种洗涤缓冲液时，第二种或第三种洗涤缓冲液包含用于病毒灭活处理的组分。在一些实施方案中，病毒灭活处理是溶剂和洗涤剂(S/D)处理。在一些实施方案中，当采用五种洗涤缓冲液时，第一种、第二种、第三种和/或第五种洗涤缓冲液的pH值比第四种洗涤缓冲液高。在一些实施方案中，当采用五种洗涤缓冲液时，第一种、第二种、第三种和第五种洗涤缓冲液具有约pH 7至pH 8的pH值，并且第四种洗涤缓冲液具有约pH 5至6的pH值。在一些实施方案中，当采用五种洗涤缓冲液时，第一种、第二种、第三种和/或第五种洗涤缓冲液具有大约pH7.4至pH 7.5的pH值，并且第四种洗涤缓冲液具有约pH 5.5的pH值。在一些实施方案中，病毒灭活处理步骤是用pH值比第四种洗涤缓冲液高的缓冲液进行。在一些实施方案中，当采用四种洗涤缓冲液时，在第一种洗涤缓冲液之后采用病毒灭活处理步骤。在一些实施方案中，当采用四种洗涤缓冲液时，第一种、第二种和第四种洗涤缓冲液的pH值比第三种洗涤缓冲液高。在一些实施方案中，病毒灭活处理步骤是用pH值比第三种洗涤缓冲液高的缓冲液进行。在一些实施方案中，病毒灭活步骤是用pH值与第一种、第二种和/或第四种洗涤缓冲液相同的缓冲液进行。在一些实施方案中，当采用四种洗涤缓冲液时，第一种、第二种和第四种洗涤缓冲液具有约pH 7至pH 8的pH值，并且第三种洗涤缓冲液具有约pH 5至约pH 6的pH值。在一些实施方案中，当采用四种洗涤缓冲液时，第一种、第二种和第四种洗涤缓冲液具有约pH 7.4至pH 7.5的pH值，并且第三种洗涤缓冲液具有约pH5.5的pH值。

可以如本领域的技术人员所公认的，进行阴离子交换色谱法。在一些实施方案中，阴离子交换器包括(但不限于)STREAMLINE Q XL

在一些实施方案中，前VWF的上样浓度为约90IU/ml至约270IU/ml树脂，例如约90IU/ml-约270IU/ml、约100IU/ml-约270IU/ml、约110IU/ml-约270IU/ml、约120IU/ml-约270IU/ml、约130IU/ml-约270IU/ml、约130IU/ml-约270IU/ml、约140IU/ml-约270IU/ml、约150IU/ml-约270IU/ml、约90IU/ml-约250IU/ml、约100IU/ml-约250IU/ml、约110IU/ml-约250IU/ml、约120IU/ml-约250IU/ml、约130IU/ml-约250IU/ml、约130IU/ml-约250IU/ml、约140IU/ml-约250IU/ml、约150IU/ml-约250IU/ml、约90IU/ml-约200IU/ml、约100IU/ml-约200IU/ml、约110IU/ml-约200IU/ml、约120IU/ml-约200IU/ml、约130IU/ml-约200IU/ml、约130IU/ml-约200IU/ml、约140IU/ml-约200IU/ml、约150IU/ml-约200IU/ml、约90IU/ml-约100IU/ml、约100IU/ml-约150IU/ml、约150IU/ml-约200IU/ml、约200IU/ml-约250IU/ml或约250IU/ml-约270IU/ml树脂。

在一些实施方案中，阴离子交换方法包含缓冲液体系。在一些实施方案中，缓冲液体系包含一种或多种洗脱缓冲液。在一些实施方案中，缓冲液体系包含一种或多种洗涤缓冲液。在一些实施方案中，缓冲液体系包含至少一种洗脱缓冲液和至少一种洗涤缓冲液。在一些实施方案中，缓冲液体系包含至少两种洗脱缓冲液和至少两种洗涤缓冲液。

在一些实施方案中，上样浓度为约90IU/ml至约270IU/ml树脂，例如约90IU/ml-约270IU/ml、约100IU/ml-约270IU/ml、约110IU/ml-约270IU/ml、约120IU/ml-约270IU/ml、约130IU/ml-约270IU/ml、约130IU/ml-约270IU/ml、约140IU/ml-约270IU/ml、约150IU/ml-约270IU/ml、约90IU/ml-约250IU/ml、约100IU/ml-约250IU/ml、约110IU/ml-约250IU/ml、约120IU/ml-约250IU/ml、约130IU/ml-约250IU/ml、约130IU/ml-约250IU/ml、约140IU/ml-约250IU/ml、约150IU/ml-约250IU/ml、约90IU/ml-约200IU/ml、约100IU/ml-约200IU/ml、约110IU/ml-约200IU/ml、约120IU/ml-约200IU/ml、约130IU/ml-约200IU/ml、约130IU/ml-约200IU/ml、约140IU/ml-约200IU/ml、约150IU/ml-约200IU/ml、约90IU/ml-约100IU/ml、约100IU/ml-约150IU/ml、约150IU/ml-约200IU/ml、约200IU/ml-约250IU/ml或约250IU/ml-约270IU/ml树脂。

在一些实施方案中，包含前rVWF、mat-rVWF/rVWF-PP复合物、mat-rVWF和/或rVWF前肽(rVWF-PP)的起始组合物、上样溶液或上样组合物的pH值为pH 6.0至pH 9.0，例如pH6.0-pH 9.0、pH 6.3-pH 9.0、pH 6.5-pH 9.0、pH 7.0-pH 9.0、pH 7.5-pH 9.0、pH 7.7.0-pH 9.0、pH 8.0-pH 9.0、pH 6.0-pH 8.5、pH 6.5-pH 8.5、pH 7.0-pH 8.5、pH 7.5-pH 8.5、pH 6.0-pH 8.0、pH 6.5-pH 8.0、pH 7.0-pH 8.0、pH 7.5-pH 8.0、pH 6.0、pH 6.1、pH 6.2、pH 6.3、pH 6.4、pH 6.5、pH 6.6、pH 6.7、pH 6.8、pH 6.9、pH 7.0、pH 7.1、pH 7.2、pH 7.3、pH 7.4、pH 7.5、pH 7.6、pH 7.7、pH 7.8、pH 7.9、pH 8.0、pH 8.1、pH 8.2、pH 8.3、pH 8.4、pH 8.5、pH 8.6、pH 8.7、pH 8.8、pH 8.9或pH 9.0。

在一些实施方案中，包含前rVWF、mat-rVWF/rVWF-PP复合物、mat-rVWF和/或rVWF前肽(rVWF-PP)的起始组合物、上样溶液或上样组合物的电导率为约5mS/cm至约40mS/cm，例如约5mS/cm-约40mS/cm、约10mS/cm-约40mS/cm、约15mS/cm-约40mS/cm、约20mS/cm-约40mS/cm、约25mS/cm-约40mS/cm、约30mS/cm-约40mS/cm、约10mS/cm-约40mS/cm、约10mS/cm-约30mS/cm、约5mS/cm-约15mS/cm、约15mS/cm-约30mS/cm或约20mS/cm-约40mS/cm。

在一些实施方案中，包含前rVWF、mat-rVWF/rVWF-PP复合物、mat-rVWF和/或rVWF前肽(rVWF-PP)的起始组合物、上样溶液或上样组合物是用包含柠檬酸钠的缓冲液稀释，例如但不限于10mM-80mM柠檬酸钠、15mM-80mM柠檬酸钠、10mM-80mM柠檬酸钠、15mM-60mM柠檬酸钠、20mM-60mM柠檬酸钠、10mM柠檬酸钠、20mM柠檬酸钠、30mM柠檬酸钠、40mM柠檬酸钠、50mM柠檬酸钠、55mM柠檬酸钠、60mM柠檬酸钠、65mM柠檬酸钠、70mM柠檬酸钠、75mM柠檬酸钠、80mM柠檬酸钠等等。

在一些实施方案中，第一种洗涤缓冲液包含至少一种螯合剂，并且任选地具有在pH 6.0至pH 9.0范围内的pH值。在一些实施方案中，第一种洗涤缓冲液具有在pH 6.0至pH9.0范围内的pH值，并且任选地包含至少一种螯合剂。在一些实施方案中，第一种洗涤缓冲液具有在pH 6.0至pH 6.9范围内的pH值。在一些实施方案中，第二洗涤缓冲液具有在pH7.0至pH 9.0范围内的pH值。在一些实施方案中，第一种洗涤缓冲液可以包含至少一种螯合剂，并且具有在pH 6.0至pH 6.9范围内的pH值。在一些实施方案中，洗涤洗脱缓冲液具有小于7的pH值。在一个实施方案中，第二洗涤缓冲液具有大于7的pH值。在一些实施方案中，当采用两种洗涤缓冲液时，第一种洗涤缓冲液具有小于7的pH值并且第二洗涤缓冲液具有大于7的pH值。

在一些实施方案中，一种或多种洗涤缓冲液包含120mM至200mM、130mM至200mM、140mM至200mM、150mM至200mM、120mM至190mM、130mM至190mM、140mM至190mM、150mM至190mM、120mM至180mM、130mM至180mM、140mM至180mM、150mM至180mM、120mM、125mM、130mM、135mM、140mM、145mM、150mM、155mM、160mM、165mM、170mM、175mM、180mM、185mM、190mM、195mM或200mM的NaCl浓度。

在一些实施方案中，包含成熟VWF和VWF-PP的起始组合物、上样溶液或上样组合物与包含至少一种螯合剂的缓冲液接触，并且任选地，缓冲液具有在pH 6.0至pH 9.0范围内的pH值。在一些实施方案中，起始组合物、上样溶液或上样组合物与具有在pH 6.0至pH 9.0范围内的pH值的缓冲液接触，并且任选地，缓冲液包含至少一种螯合剂。在一些实施方案中，缓冲液具有在pH 7.0至pH 9.0范围内的pH值。在一些实施方案中，缓冲液是洗涤缓冲液。在一些实施方案中，缓冲液是洗脱缓冲液。在一些实施方案中，缓冲液是具有6.0至6.9的pH值的洗涤缓冲液。在一些实施方案中，缓冲液是具有7.0至9.0的pH值的洗脱缓冲液。在一些实施方案中，包含成熟VWF和VWF-PP的起始组合物、上样溶液或上样组合物首先与具有6.0至6.9的pH值的洗涤缓冲液接触，并且其次与具有7.0至9.0的pH值的至少一种洗脱缓冲液接触。

在一些实施方案中，成熟VWF在阴离子交换色谱法步骤中使用一种洗脱缓冲液洗脱。在一些实施方案中，成熟VWF在阴离子交换色谱法步骤中使用包含超过一种洗脱缓冲液的梯度洗脱法洗脱。举例来说，洗脱可以使用两种洗脱缓冲液，例如第一种洗脱缓冲液和第二种洗脱缓冲液进行。在一些实施方案中，第一种洗脱缓冲液包含至少一种螯合剂，并且任选地具有在pH 6.0至pH 9.0范围内的pH值。在一些实施方案中，第一种洗脱缓冲液具有在pH 6.0至pH 9.0范围内的pH值，并且任选地包含至少一种螯合剂。在一些实施方案中，第一种洗脱缓冲液具有在pH 6.0至pH 6.9范围内的pH值。在一些实施方案中，第二种洗脱缓冲液具有在pH 7.0至pH 9.0范围内的pH值。在一些实施方案中，第一种洗脱缓冲液可以包含至少一种螯合剂，并且具有在pH 6.0至pH 6.9范围内的pH值。在一些实施方案中，第一种洗脱缓冲液具有小于7的pH值。在一个实施方案中，第二种洗脱缓冲液具有大于7的pH值。在一些实施方案中，当采用两种洗脱缓冲液时，第一种洗脱缓冲液具有小于7的pH值并且第二种洗脱缓冲液具有大于7的pH值。

在一些实施方案中，阴离子交换色谱法步骤的洗涤缓冲液的pH值为pH 6.0至pH9.0，例如pH 6.0-pH 9.0、pH 6.3-pH 9.0、pH 6.5-pH 9.0、pH 7.0-pH 9.0、pH 7.5-pH9.0、pH 7.7.0-pH 9.0、pH 8.0-pH 9.0、pH 6.0-pH 8.5、pH 6.5-pH 8.5、pH 7.0-pH 8.5、pH 7.5-pH 8.5、pH 6.0-pH 8.0、pH 6.5-pH 8.0、pH 7.0-pH 8.0、pH 7.5-pH 8.0、pH 6.0、pH 6.1、pH 6.2、pH 6.3、pH 6.4、pH 6.5、pH 6.6、pH 6.7、pH 6.8、pH 6.9、pH 7.0、pH 7.1、pH 7.2、pH 7.3、pH 7.4、pH 7.5、pH 7.6、pH 7.7、pH 7.8、pH 7.9、pH 8.0、pH 8.1、pH 8.2、pH 8.3、pH 8.4、pH 8.5、pH 8.6、pH 8.7、pH 8.8、pH 8.9、pH 9.0。在一些实施方案中，这包括当存在两种洗脱缓冲液，例如第一种和第二种洗脱缓冲液时。

在一些实施方案中，阴离子交换色谱法步骤的洗脱缓冲液的pH值为pH 6.0至pH9.0，例如pH 6.0-pH 9.0、pH 6.3-pH 9.0、pH 6.5-pH 9.0、pH 7.0-pH 9.0、pH 7.5-pH9.0、pH 7.7.0-pH 9.0、pH 8.0-pH 9.0、pH 6.0-pH 8.5、pH 6.5-pH 8.5、pH 7.0-pH 8.5、pH 7.5-pH 8.5、pH 6.0-pH 8.0、pH 6.5-pH 8.0、pH 7.0-pH 8.0、pH 7.5-pH 8.0、pH 6.0、pH 6.1、pH 6.2、pH 6.3、pH 6.4、pH 6.5、pH 6.6、pH 6.7、pH 6.8、pH 6.9、pH 7.0、pH 7.1、pH 7.2、pH 7.3、pH 7.4、pH 7.5、pH 7.6、pH 7.7、pH 7.8、pH 7.9、pH 8.0、pH 8.1、pH 8.2、pH 8.3、pH 8.4、pH 8.5、pH 8.6、pH 8.7、pH 8.8、pH 8.9、pH 9.0。在一些实施方案中，这包括当存在两种洗脱缓冲液，例如第一种和第二种洗脱缓冲液时。

在一些实施方案中，洗脱缓冲液的pH值与步骤a)中的起始溶液相比增加，当采用两种洗脱缓冲液时与第一种洗脱缓冲液相比增加，和/或当采用洗涤缓冲液时与洗涤缓冲液相比增加。在一些实施方案中，当采用洗涤缓冲液和洗脱缓冲液时，洗涤缓冲液具有小于7的pH值并且洗脱缓冲液具有大于7的pH值。在一些实施方案中，当采用两种洗脱缓冲液时，一种洗脱缓冲液具有小于7的pH值并且另一种洗脱缓冲液具有大于7的pH值。在一些实施方案中，当采用洗涤缓冲液和两种洗脱缓冲液时，洗涤缓冲液具有小于7的pH值并且两种洗脱缓冲液均具有大于7的pH值。在一些实施方案中，当采用洗涤缓冲液和两种洗脱缓冲液时，洗涤缓冲液和第一种洗脱缓冲液具有小于7的pH值并且第二种洗脱缓冲液具有大于7的pH值。在一些实施方案中，当采用两种洗涤缓冲液和两种洗脱缓冲液时，洗涤缓冲液和第一种洗脱缓冲液具有小于7的pH值并且第二种洗脱缓冲液具有大于7的pH值。在一些实施方案中，当采用两种洗涤缓冲液和两种洗脱缓冲液时，两种洗涤缓冲液均具有小于7的pH值并且两种洗脱缓冲液均具有大于7的pH值。在一些实施方案中，当采用两种洗涤缓冲液和两种洗脱缓冲液时，第一种洗涤缓冲液具有小于7的pH值并且第二洗涤缓冲液,并且两种洗脱缓冲液具有大于7的pH值。

在一些实施方案中，如在方法的步骤(a)中所述，与包含前rVWF、mat-rVWF/rVWF-PP复合物、mat-rVWF和/或rVWF前肽(rVWF-PP)的上样溶液相比，一种或多种洗涤和/或洗脱缓冲液的pH值增加到至少7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或8.0。在一些实施方案中，将缓冲液的pH值增加到至少7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或8.0，以诱导方法的步骤(a)中的溶液中的mat-rVWF/rVWF-PP复合物解离成mat-rVWF和rVWF-PP，其中所述解离通过破环非共价缔合的mat-rVWF和rVWF-PP而发生。在一些实施方案中，上样溶液的pH值增加到至少约7.2至约7.8。在一些实施方案中，上样溶液的pH值增加到至少约7.6。在一些实施方案中，通过加入碱性氨基酸来增加上样溶液的pH值。在一些实施方案中，上样溶液的pH值增加到至少7。在一些实施方案中，一种或多种洗涤缓冲液的pH值增加到至少约7.2至约7.8。在一些实施方案中，一种或多种洗涤缓冲液的pH值增加到至少约7.6。在一些实施方案中，通过加入碱性氨基酸来增加一种或多种洗涤缓冲液的pH值。在一些实施方案中，一种或多种洗涤缓冲液展现至少7的pH值。在一些实施方案中，一种或多种洗脱缓冲液的pH值增加到至少约7.2至约7.8。在一些实施方案中，一种或多种洗脱缓冲液的pH值增加到至少约7.6。在一些实施方案中，通过加入碱性氨基酸来增加一种或多种洗脱缓冲液的pH值。在一些实施方案中，一种或多种洗脱缓冲液展现至少7的pH值。

在一些实施方案中，一种或多种缓冲液(包括洗涤和/或洗脱缓冲液)包含一种或多种螯合剂。在一些实施方案中，洗脱缓冲液包括至少一种螯合剂。螯合剂可以是二价阳离子螯合剂。在一些实施方案中，至少一种螯合剂是二价阳离子螯合剂。在一些实施方案中，二价阳离子螯合剂选自由以下组成的组：EDTA、EGTA、CDTA和柠檬酸盐。在一些实施方案中，二价阳离子螯合剂选自由以下组成的组：NTA、DTPA、EDDS、EDTA、EGTA、CDTA和柠檬酸盐。在一些实施方案中，螯合剂是NTA。在一些实施方案中，螯合剂是DTPA。在一些实施方案中，螯合剂是EDDS。在一些实施方案中，螯合剂是EDTA。在一些实施方案中，螯合剂是EGTA。在一些实施方案中，螯合剂是CDTA。在一些实施方案中，螯合剂是柠檬酸盐。在一些实施方案中，b)中的一种或多种缓冲液包含所述一种或多种螯合剂并展现至少7的pH值。

在一些实施方案中，一种或多种缓冲液(包括洗涤和/或洗脱缓冲液)包含在包括但不限于以下的范围内的柠檬酸钠：10mM-80mM柠檬酸钠、15mM-80mM柠檬酸钠、10mM-80mM柠檬酸钠、15mM-60mM柠檬酸钠、20mM-60mM柠檬酸钠、10mM柠檬酸钠、20mM柠檬酸钠、30mM柠檬酸钠、40mM柠檬酸钠、50mM柠檬酸钠、55mM柠檬酸钠、60mM柠檬酸钠、65mM柠檬酸钠、70mM柠檬酸钠、75mM柠檬酸钠、80mM柠檬酸钠等等。

在一些实施方案中，第一种洗脱缓冲液还包含在包括但不限于以下的范围内的柠檬酸钠：10mM-60mM柠檬酸钠、15mM-60mM柠檬酸钠、10mM-50mM柠檬酸钠、15mM-50mM柠檬酸钠、20mM-60mM柠檬酸钠、10mM柠檬酸钠、20mM柠檬酸钠、30mM柠檬酸钠、40mM柠檬酸钠、50mM柠檬酸钠、60mM柠檬酸钠等等。

在一些实施方案中，第二种洗脱缓冲液还包含在包括但不限于以下的范围内的柠檬酸钠：10mM-60mM柠檬酸钠、15mM-60mM柠檬酸钠、10mM-50mM柠檬酸钠、15mM-50mM柠檬酸钠、20mM-60mM柠檬酸钠、10mM柠檬酸钠、20mM柠檬酸钠、30mM柠檬酸钠、40mM柠檬酸钠、50mM柠檬酸钠、60mM柠檬酸钠等等。

在一些实施方案中，阴离子交换色谱法步骤的洗脱缓冲液A和/或洗脱缓冲液B包含约0.5mM至约20mM EDTA，例如约0.5mM-约20mM、约1mM-约20mM、约1.5mM-约20mM、约2mM-约20mM、约3mM-约20mM、约5mM-约20mM、约0.5mM-约15mM、约1mM-约10mM、约1mM-约5mM、约5mM、约0.5mM、约1mM、约2mM、约3mM、约4mM、约5mM、约6mM、约7mM、约8mM、约9mM、约10mM、约11mM、约12mM、约13mM、约14mM、约15mM、约16mM、约17mM、约18mM、约19mM、约20mM等等。

在一些实施方案中，在已经使用阴离子交换法除去rVWF-前肽之后，可以在洗脱剂中发现柠檬酸盐。在一些实施方案中，在已经使用逐步阴离子交换洗脱法除去rVWF-前肽之后，可以在洗脱剂中发现柠檬酸盐。在一些实施方案中，在已经使用梯度阴离子交换洗脱法除去rVWF-前肽之后，可以在洗脱剂中发现柠檬酸盐。在一些实施方案中，阴离子交换相对离子是柠檬酸根

本文所述的缓冲液(缓冲液体系)中的任一种可以选自由以下组成的组：甘氨酸、HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸)、TrisHCl(三(羟甲基)-氨基甲烷)、组氨酸、咪唑、乙酸盐柠檬酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐、MES、磷酸盐、TrisHCl、Bis-Tris、组氨酸、咪唑、精氨酸HCl、赖氨酸HCl和2-(N-吗啉基)乙烷磺酸，呈单一缓冲液或呈两种或更多种缓冲液的组合。在一些实施方案中，缓冲液包含甘氨酸。在一些实施方案中，缓冲液包含HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸)。在一些实施方案中，缓冲液包含TrisHCl(三(羟甲基)-氨基甲烷)。在一些实施方案中，缓冲液包含组氨酸。在一些实施方案中，缓冲液包含咪唑。在一些实施方案中，缓冲液包含乙酸盐柠檬酸盐。在一些实施方案中，缓冲液包含柠檬酸盐。在一些实施方案中，缓冲液包含乙酸盐。在一些实施方案中，缓冲液包含MES。在一些实施方案中，缓冲液包含磷酸盐。在一些实施方案中，缓冲液包含TrisHCl。在一些实施方案中，缓冲液包含Bis-Tris。在一些实施方案中，缓冲液包含组氨酸。在一些实施方案中，缓冲液包含咪唑。在一些实施方案中，缓冲液包含精氨酸HCl。在一些实施方案中，缓冲液包含赖氨酸HCl。在一些实施方案中，缓冲液包含2-(N-吗啉基)乙烷磺酸。在一些实施方案中，缓冲液包含本文中所列出的缓冲液中的一种、两种、三种或四种。

在一些实施方案中，一种或多种缓冲液选自由以下组成的组：甘氨酸HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸)、TrisHCl(三(羟甲基)-氨基甲烷)、组氨酸、咪唑、乙酸盐柠檬酸盐、MES和2-(N-吗啉基)乙烷磺酸。

在一些实施方案中，一种或多种缓冲液包含至少一种在25℃下电导率≥0.5mS/cm的缓冲液。在一些实施方案中，一种或多种缓冲液包含至少一种在25℃下电导率为20.0±0.2mS/cm的缓冲液。在一些实施方案中，一种或多种缓冲液包含至少一种在25℃下电导率为17.0±0.2mS/cm的缓冲液。在一些实施方案中，一种或多种缓冲液包含至少一种在25℃下电导率为15.0±0.2mS/cm的缓冲液。在一些实施方案中，一种或多种缓冲液包含至少一种在25℃下电导率为12.0±0.2mS/cm的缓冲液。在一些实施方案中，一种或多种缓冲液包含至少一种在25℃下电导率为10.0±0.2mS/cm的缓冲液。在一些实施方案中，一种或多种缓冲液包含至少一种在25℃下电导率为5.0±0.2mS/cm的缓冲液。在一些实施方案中，一种或多种缓冲液包含至少一种在25℃下电导率为2.0±0.2mS/cm的缓冲液。

在一些实施方案中，本发明的方法的一个或多个洗涤步骤的流速是约10cm/h至约200cm/h，例如约10cm/h、约15cm/h、约20cm/h、约25cm/h、约30cm/h、约35cm/h、约40cm/h、约45cm/h、约50cm/h、约55cm/h、约60cm/h、约65cm/h、约70cm/h、约75cm/h、约80cm/h、约85cm/h、约90cm/h、约95cm/h、约100cm/h、约105cm/h、约110cm/h、约115cm/h、约120cm/h、约125cm/h、约130cm/h、约135cm/h、约140cm/h、约145cm/h、约150cm/h、约155cm/h、约160cm/h、约165cm/h、约170cm/h、约175cm/h、约180cm/h、约185cm/h、约190cm/h、约195cm/h或约200cm/h。取决于树脂，在一些实施方案中，流速可以高达600cm/h。

在一些实施方案中，本发明的方法的一个或多个洗脱步骤的流速是约10cm/h至约200cm/h，例如约10cm/h、约15cm/h、约20cm/h、约25cm/h、约30cm/h、约35cm/h、约40cm/h、约45cm/h、约50cm/h、约55cm/h、约60cm/h、约65cm/h、约70cm/h、约75cm/h、约80cm/h、约85cm/h、约90cm/h、约95cm/h、约100cm/h、约105cm/h、约110cm/h、约115cm/h、约120cm/h、约125cm/h、约130cm/h、约135cm/h、约140cm/h、约145cm/h、约150cm/h、约155cm/h、约160cm/h、约165cm/h、约170cm/h、约175cm/h、约180cm/h、约185cm/h、约190cm/h、约195cm/h或约200cm/h。取决于树脂，在一些实施方案中，流速可以高达600cm/h。

在一些实施方案中，一种或多种缓冲液还包含一种或多种非离子型洗涤剂。在一些实施方案中，非离子型洗涤剂选自由以下组成的组：Triton-X100、Tween 80和Tween 20。在一些实施方案中，非离子型洗涤剂是Triton X-100。在一些实施方案中，非离子型洗涤剂是Tween 80。在一些实施方案中，非离子型洗涤剂是Tween 20。

在一些实施方案中，所述一种或多种缓冲液还包含一种或多种选自由以下组成的组的额外物质：非还原糖、糖醇和多元醇。在一些实施方案中，一种或多种缓冲液还包含一种或多种非还原糖。在一些实施方案中，非还原糖包括但不限于蔗糖、海藻糖、甘露糖醇、山梨糖醇、半乳糖醇和/或木糖醇。在一些实施方案中，一种或多种缓冲液还包含一种或多种糖醇。在一些实施方案中，一种或多种缓冲液还包含一种或多种多元醇。在一些实施方案中，糖醇或多元醇包括但不限于甘露糖醇、木糖醇、赤藓醇、苏糖醇、山梨糖醇和/或丙三醇。在一些实施方案中，缓冲液还包含乙二醇、丙二醇、丙三醇、1,2,3-丙三醇)、内消旋-赤藓醇和/或赤藓醇(内消旋-1,2,3,4-丁四醇)。

在一些实施方案中，缓冲液可以包括一种或多种一价阳离子。在一些实施方案中，一种或多种一价阳离子选自由以下组成的组：Na

可以通过加入氨基酸、Tris、NaOH、乙醇胺等等调整(增加)任何缓冲液的pH值。

在一些实施方案中，阴离子交换法缓冲液螯合剂组合包含柠檬酸盐、苹果酸盐(苹果酸)和酒石酸盐(酒石酸)。

b.

在本发明方法的一方面，使用阳离子交换(CEX)色谱法将成熟VWF(matVWF)与VWF-PP分离。在一些情况下，从成熟VWF除去剩余的源自宿主细胞的杂质，例如CHO宿主细胞蛋白；工艺相关的杂质，例如重组弗林蛋白酶和低分子量病毒灭活试剂；培养基化合物，例如大豆蛋白胨；和其它产物相关杂质。

在本发明方法的另一方面，使用阳离子交换色谱法将成熟VWF与例如残留VWF-PP或游离VWF-PP的VWF-PP分离。为了分离，起始组合物、上样溶液或上样组合物可以包含低pH值和至少一种螯合剂。在一些实施方案中，起始组合物、上样溶液或上样组合物包含前rVWF、mat-rVWF/rVWF-PP复合物、mat-rVWF和/或rVWF前肽(rVWF-PP)。在一些实施方案中，阳离子交换器以结合模式操作，且使用包含至少一种螯合剂的梯度洗脱缓冲液分离成熟VWF和VWF-PP。在其它实施方案中，梯度洗脱缓冲液具有中性至高pH值，例如在pH 6.0至pH9.0范围内的pH值。在另一个实施方案中，梯度洗脱缓冲液包含一种或多种螯合剂并具有7.0或更高的pH值，例如pH 7.0至pH 9.0。举例来说，梯度洗脱缓冲液可以包括EDTA并具有8.5的pH值。

在一些实施方案中，本发明提供了一种获得包含高纯度的去除前肽的成熟重组rVWF(高纯度的mat-rVWF)的组合物的方法，所述方法包括以下步骤：(a)将包含前rVWF、mat-rVWF/rVWF-PP复合物、mat-rVWF和/或rVWF前肽(rVWF-PP)的溶液上样至阳离子交换柱上，其中所述前rVWF、mat-rVWF/rVWF-PP复合物和mat-rVWF结合于所述阳离子交换柱；(b)将a)中含有所述结合的前rVWF、mat-rVWF/rVWF-PP复合物和mat-rVWF的所述阳离子交换柱用一种或多种洗涤缓冲液洗涤；(c)将b)中包含所述结合的前rVWF、mat-rVWF/rVWF-PP复合物和mat-rVWF的所述柱用弗林蛋白酶处理，其中所述弗林蛋白酶使所述前rVWF裂解成mat-rVWF和rVWF-PP；(d)用洗脱缓冲液将所述结合的前rVWF、mat-rVWF/rVWF-PP复合物和mat-rVWF从c)中的所述柱洗脱，其中所述洗脱缓冲液诱导所述rVWF-PP从与所述rVWF-PP非共价缔合的mat-rVWF解离，并且其中所述解离是通过以下诱导：(i)将至少一种螯合剂加入至所述洗脱缓冲液中，或(ii)将所述洗脱缓冲液的pH值增加到至少7的pH值；以及(e)将所述mat-rVWF与所述rVWF-PP分开收集，以获得高纯度的mat-rVWF组合物，其中所述高纯度的mat-rVWF组合物包含至少95％成熟rVWF和少于5％rVWF-PP。

在一些实施方案中，a)和b)在单个步骤中同时发生。在一些实施方案中，a)中的溶液包含来自免疫亲和纯化方法的流过物。在一些实施方案中，a)中的溶液包含来自单克隆抗体柱的流过物，其中所述单克隆抗体是FVIII单克隆抗体。在一些实施方案中，a)中的溶液选自由以下组成的组：细胞培养基、抗体柱流过溶液和缓冲溶液。

阳离子交换器可以结合模式操作以分离成熟VWF和VWF-PP。可以如本领域的技术人员所公认的，进行阳离子交换色谱法。在一些实施方案中，阳离子交换器包括(但不限于)

在步骤(b)的一些实施方案中，洗涤a)中的含有所述结合的前rVWF、mat-rVWF/rVWF-PP复合物和mat-rVWF的所述阳离子交换柱采用用一种或多种洗涤缓冲液的洗涤，其中一种或多种洗涤缓冲液包括一种、两种、三种、四种和/或五种洗涤缓冲液。在一些实施方案中，第二洗涤缓冲液包含用于病毒灭活的组分。在一些实施方案中，当采用四种或五种洗涤缓冲液时，第二洗涤缓冲液包含用于病毒灭活的组分。在一些实施方案中，当采用四种或五种洗涤缓冲液时，第二种或第三种洗涤缓冲液包含用于病毒灭活处理的组分。在一些实施方案中，病毒灭活处理是溶剂和洗涤剂(S/D)处理。在一些实施方案中，当采用五种洗涤缓冲液时，第一种、第二种、第三种和/或第五种洗涤缓冲液的pH值比第四种洗涤缓冲液高。在一些实施方案中，当采用五种洗涤缓冲液时，第一种、第二种、第三种和第五种洗涤缓冲液具有约pH 7至pH 8的pH值，并且第四种洗涤缓冲液具有约pH 5至6的pH值。在一些实施方案中，当采用五种洗涤缓冲液时，第一种、第二种、第三种和/或第五种洗涤缓冲液具有大约pH 7.4至pH 7.5的pH值，并且第四种洗涤缓冲液具有约pH 5.5的pH值。在一些实施方案中，病毒灭活处理步骤是用pH值比第四种洗涤缓冲液高的缓冲液进行。在一些实施方案中，当采用四种洗涤缓冲液时，在第一种洗涤缓冲液之后采用病毒灭活处理步骤。在一些实施方案中，当采用四种洗涤缓冲液时，第一种、第二种和第四种洗涤缓冲液的pH值比第三种洗涤缓冲液高。在一些实施方案中，病毒灭活处理步骤是用pH值比第三种洗涤缓冲液高的缓冲液进行。在一些实施方案中，病毒灭活步骤是用pH值与第一种、第二种和/或第四种洗涤缓冲液相同的缓冲液进行。在一些实施方案中，当采用四种洗涤缓冲液时，第一种、第二种和第四种洗涤缓冲液具有约pH 7至pH 8的pH值，并且第三种洗涤缓冲液具有约pH 5至约pH 6的pH值。在一些实施方案中，当采用四种洗涤缓冲液时，第一种、第二种和第四种洗涤缓冲液具有约pH 7.4至pH 7.5的pH值，并且第三种洗涤缓冲液具有约pH 5.5的pH值。

在一些实施方案中，前VWF的上样浓度为约90IU/ml至约270IU/ml树脂，例如约90IU/ml-约270IU/ml、约100IU/ml-约270IU/ml、约110IU/ml-约270IU/ml、约120IU/ml-约270IU/ml、约130IU/ml-约270IU/ml、约130IU/ml-约270IU/ml、约140IU/ml-约270IU/ml、约150IU/ml-约270IU/ml、约90IU/ml-约250IU/ml、约100IU/ml-约250IU/ml、约110IU/ml-约250IU/ml、约120IU/ml-约250IU/ml、约130IU/ml-约250IU/ml、约130IU/ml-约250IU/ml、约140IU/ml-约250IU/ml、约150IU/ml-约250IU/ml、约90IU/ml-约200IU/ml、约100IU/ml-约200IU/ml、约110IU/ml-约200IU/ml、约120IU/ml-约200IU/ml、约130IU/ml-约200IU/ml、约130IU/ml-约200IU/ml、约140IU/ml-约200IU/ml、约150IU/ml-约200IU/ml、约90IU/ml-约100IU/ml、约100IU/ml-约150IU/ml、约150IU/ml-约200IU/ml、约200IU/ml-约250IU/ml或约250IU/ml-约270IU/ml树脂。

在一些实施方案中，阳离子交换方法包含缓冲液体系。在一些实施方案中，缓冲液体系包含一种或多种洗脱缓冲液。在一些实施方案中，缓冲液体系包含一种或多种洗涤缓冲液。在一些实施方案中，缓冲液体系包含至少一种洗脱缓冲液和至少一种洗涤缓冲液。在一些实施方案中，缓冲液体系包含至少两种洗脱缓冲液和至少两种洗涤缓冲液。

在一些实施方案中，第一种洗涤缓冲液包含至少一种螯合剂，并且任选地具有在pH 6.0至pH 9.0范围内的pH值。在一些实施方案中，第一种洗涤缓冲液具有在pH 6.0至pH9.0范围内的pH值，并且任选地包含至少一种螯合剂。在一些实施方案中，第一种洗涤缓冲液具有在pH 6.0至pH 6.9范围内的pH值。在一些实施方案中，第二洗涤缓冲液具有在pH7.0至pH 9.0范围内的pH值。在一些实施方案中，第一种洗涤缓冲液可以包含至少一种螯合剂，并且具有在pH 6.0至pH 6.9范围内的pH值。在一些实施方案中，洗涤洗脱缓冲液具有小于7的pH值。在一个实施方案中，第二洗涤缓冲液具有大于7的pH值。在一些实施方案中，当采用两种洗涤缓冲液时，第一种洗涤缓冲液具有小于7的pH值并且第二洗涤缓冲液具有大于7的pH值。

在一些实施方案中，一种或多种洗涤缓冲液包含120mM至200mM、130mM至200mM、140mM至200mM、150mM至200mM、120mM至190mM、130mM至190mM、140mM至190mM、150mM至190mM、120mM至180mM、130mM至180mM、140mM至180mM、150mM至180mM、120mM、125mM、130mM、135mM、140mM、145mM、150mM、155mM、160mM、165mM、170mM、175mM、180mM、185mM、190mM、195mM或200mM的NaCl浓度。

在一些实施方案中，包含成熟VWF和VWF-PP的起始组合物、上样溶液或上样组合物与包含至少一种螯合剂的缓冲液接触，并且任选地，缓冲液具有在pH 6.0至pH 9.0范围内的pH值。在一些实施方案中，起始组合物、上样溶液或上样组合物与具有在pH 6.0至pH 9.0范围内的pH值的缓冲液接触，并且任选地，缓冲液包含至少一种螯合剂。在一些实施方案中，缓冲液具有在pH 7.0至pH 9.0范围内的pH值。在一些实施方案中，缓冲液是洗涤缓冲液。在一些实施方案中，缓冲液是洗脱缓冲液。在一些实施方案中，缓冲液是具有6.0至6.9的pH值的洗涤缓冲液。在一些实施方案中，缓冲液是具有7.0至9.0的pH值的洗脱缓冲液。在一些实施方案中，包含成熟VWF和VWF-PP的起始组合物、上样溶液或上样组合物首先与具有6.0至6.9的pH值的洗涤缓冲液接触，并且其次与具有7.0至9.0的pH值的至少一种洗脱缓冲液接触。

在一些实施方案中，成熟VWF在阴离子交换色谱法步骤中使用一种洗脱缓冲液洗脱。在一些实施方案中，成熟VWF在阴离子交换色谱法步骤中使用包含超过一种洗脱缓冲液的梯度洗脱法洗脱。举例来说，洗脱可以使用两种洗脱缓冲液，例如第一种洗脱缓冲液和第二种洗脱缓冲液进行。在一些实施方案中，第一种洗脱缓冲液包含至少一种螯合剂，并且任选地具有在pH 6.0至pH 9.0范围内的pH值。在一些实施方案中，第一种洗脱缓冲液具有在pH 6.0至pH 9.0范围内的pH值，并且任选地包含至少一种螯合剂。在一些实施方案中，第一种洗脱缓冲液具有在pH 6.0至pH 6.9范围内的pH值。在一些实施方案中，第二种洗脱缓冲液具有在pH 7.0至pH 9.0范围内的pH值。在一些实施方案中，第一种洗脱缓冲液可以包含至少一种螯合剂，并且具有在pH 6.0至pH 6.9范围内的pH值。在一些实施方案中，第一种洗脱缓冲液具有小于7的pH值。在一个实施方案中，第二种洗脱缓冲液具有大于7的pH值。在一些实施方案中，当采用两种洗脱缓冲液时，第一种洗脱缓冲液具有小于7的pH值并且第二种洗脱缓冲液具有大于7的pH值。

在一些实施方案中，阳离子交换色谱法步骤的洗涤缓冲液的pH值为pH 6.0至pH9.0，例如pH 6.0-pH 9.0、pH 6.3-pH 9.0、pH 6.5-pH 9.0、pH 7.0-pH 9.0、pH 7.5-pH9.0、pH 7.7.0-pH 9.0、pH 8.0-pH 9.0、pH 6.0-pH 8.5、pH 6.5-pH 8.5、pH 7.0-pH 8.5、pH 7.5-pH 8.5、pH 6.0-pH 8.0、pH 6.5-pH 8.0、pH 7.0-pH 8.0、pH 7.5-pH 8.0、pH 6.0、pH 6.1、pH 6.2、pH 6.3、pH 6.4、pH 6.5、pH 6.6、pH 6.7、pH 6.8、pH 6.9、pH 7.0、pH 7.1、pH 7.2、pH 7.3、pH 7.4、pH 7.5、pH 7.6、pH 7.7、pH 7.8、pH 7.9、pH 8.0、pH 8.1、pH 8.2、pH 8.3、pH 8.4、pH 8.5、pH 8.6、pH 8.7、pH 8.8、pH 8.9、pH 9.0。在一些实施方案中，这包括当存在两种洗脱缓冲液，例如第一种和第二种洗脱缓冲液时。

在一些实施方案中，阳离子交换色谱法步骤的洗脱缓冲液的pH值为pH 6.0至pH9.0，例如pH 6.0-pH 9.0、pH 6.3-pH 9.0、pH 6.5-pH 9.0、pH 7.0-pH 9.0、pH 7.5-pH9.0、pH 7.7.0-pH 9.0、pH 8.0-pH 9.0、pH 6.0-pH 8.5、pH 6.5-pH 8.5、pH 7.0-pH 8.5、pH 7.5-pH 8.5、pH 6.0-pH 8.0、pH 6.5-pH 8.0、pH 7.0-pH 8.0、pH 7.5-pH 8.0、pH 6.0、pH 6.1、pH 6.2、pH 6.3、pH 6.4、pH 6.5、pH 6.6、pH 6.7、pH 6.8、pH 6.9、pH 7.0、pH 7.1、pH 7.2、pH 7.3、pH 7.4、pH 7.5、pH 7.6、pH 7.7、pH 7.8、pH 7.9、pH 8.0、pH 8.1、pH 8.2、pH 8.3、pH 8.4、pH 8.5、pH 8.6、pH 8.7、pH 8.8、pH 8.9、pH 9.0。在一些实施方案中，这包括当存在两种洗脱缓冲液，例如第一种和第二种洗脱缓冲液时。

在一些实施方案中，洗脱缓冲液的pH值与步骤a)中的起始溶液相比增加，当采用两种洗脱缓冲液时与第一种洗脱缓冲液相比增加，和/或当采用洗涤缓冲液时与洗涤缓冲液相比增加。在一些实施方案中，当采用洗涤缓冲液和洗脱缓冲液时，洗涤缓冲液具有小于7的pH值并且洗脱缓冲液具有大于7的pH值。在一些实施方案中，当采用两种洗脱缓冲液时，一种洗脱缓冲液具有小于7的pH值并且另一种洗脱缓冲液具有大于7的pH值。在一些实施方案中，当采用洗涤缓冲液和两种洗脱缓冲液时，洗涤缓冲液具有小于7的pH值并且两种洗脱缓冲液具有大于7的pH值。在一些实施方案中，当采用洗涤缓冲液和两种洗脱缓冲液时，洗涤缓冲液和第一种洗脱缓冲液具有小于7的pH值并且第二种洗脱缓冲液具有大于7的pH值。在一些实施方案中，当采用两种洗涤缓冲液和两种洗脱缓冲液时，洗涤缓冲液和第一种洗脱缓冲液具有小于7的pH值并且第二种洗脱缓冲液具有大于7的pH值。在一些实施方案中，当采用两种洗涤缓冲液和两种洗脱缓冲液时，两种洗涤缓冲液均具有小于7的pH值并且两种洗脱缓冲液均具有大于7的pH值。在一些实施方案中，当采用两种洗涤缓冲液和两种洗脱缓冲液时，第一种洗涤缓冲液具有小于7的pH值并且第二洗涤缓冲液和两种洗脱缓冲液具有大于7的pH值。

在一些实施方案中，如在方法的步骤(a)中所述，与包含前rVWF、mat-rVWF/rVWF-PP复合物、mat-rVWF和/或rVWF前肽(rVWF-PP)的上样溶液相比，一种或多种洗涤和/或洗脱缓冲液的pH值增加到至少7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或8.0。在一些实施方案中，将缓冲液的pH值增加到至少7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或8.0，以诱导方法的步骤(a)中的溶液中的mat-rVWF/rVWF-PP复合物解离成mat-rVWF和rVWF-PP，其中所述解离通过破环非共价缔合的mat-rVWF和rVWF-PP而发生。在一些实施方案中，上样溶液的pH值增加到至少约7.2至约7.8。在一些实施方案中，上样溶液的pH值增加到至少约7.6。在一些实施方案中，通过加入碱性氨基酸来增加上样溶液的pH值。在一些实施方案中，上样溶液的pH值增加到至少7。在一些实施方案中，一种或多种洗涤缓冲液的pH值增加到至少约7.2至约7.8。在一些实施方案中，一种或多种洗涤缓冲液的pH值增加到至少约7.6。在一些实施方案中，通过加入碱性氨基酸来增加一种或多种洗涤缓冲液的pH值。在一些实施方案中，一种或多种洗涤缓冲液展现至少7的pH值。在一些实施方案中，一种或多种洗脱缓冲液的pH值增加到至少约7.2至约7.8。在一些实施方案中，一种或多种洗脱缓冲液的pH值增加到至少约7.6。在一些实施方案中，通过加入碱性氨基酸来增加一种或多种洗脱缓冲液的pH值。在一些实施方案中，一种或多种洗脱缓冲液展现至少7的pH值。

在一些实施方案中，包含前rVWF、mat-rVWF/rVWF-PP复合物、mat-rVWF和/或rVWF前肽(rVWF-PP)的上样溶液的pH值为pH 6.0至pH 9.0，例如pH 6.0-pH 9.0、pH 6.3-pH9.0、pH 6.5-pH 9.0、pH 7.0-pH 9.0、pH 7.5-pH 9.0、pH 7.7.0-pH 9.0、pH 8.0-pH 9.0、pH 6.0-pH 8.5、pH 6.5-pH 8.5、pH 7.0-pH 8.5、pH 7.5-pH 8.5、pH 6.0-pH 8.0、pH 6.5-pH 8.0、pH 7.0-pH 8.0、pH 7.5-pH 8.0、pH 6.0、pH 6.1、pH 6.2、pH 6.3、pH 6.4、pH 6.5、pH 6.6、pH 6.7、pH 6.8、pH 6.9、pH 7.0、pH 7.1、pH 7.2、pH 7.3、pH 7.4、pH 7.5、pH 7.6、pH 7.7、pH 7.8、pH 7.9、pH 8.0、pH 8.1、pH 8.2、pH 8.3、pH 8.4、pH 8.5、pH 8.6、pH 8.7、pH 8.8、pH 8.9或pH 9.0。

在一些实施方案中，包含前rVWF、mat-rVWF/rVWF-PP复合物、mat-rVWF和/或rVWF前肽(rVWF-PP)的起始组合物、上样溶液或上样组合物的电导率为约5mS/cm至约40mS/cm，例如约5mS/cm-约40mS/cm、约10mS/cm-约40mS/cm、约15mS/cm-约40mS/cm、约20mS/cm-约40mS/cm、约25mS/cm-约40mS/cm、约30mS/cm-约40mS/cm、约10mS/cm-约40mS/cm、约10mS/cm-约30mS/cm、约5mS/cm-约15mS/cm、约15mS/cm-约30mS/cm或约20mS/cm-约40mS/cm。

在一些实施方案中，将包含前rVWF、mat-rVWF/rVWF-PP复合物、mat-rVWF和/或rVWF前肽(rVWF-PP)的上样溶液用包含柠檬酸钠的缓冲液稀释，例如但不限于10mM-80mM柠檬酸钠、15mM-80mM柠檬酸钠、10mM-80mM柠檬酸钠、15mM-60mM柠檬酸钠、20mM-60mM柠檬酸钠、10mM柠檬酸钠、20mM柠檬酸钠、30mM柠檬酸钠、40mM柠檬酸钠、50mM柠檬酸钠、55mM柠檬酸钠、60mM柠檬酸钠、65mM柠檬酸钠、70mM柠檬酸钠、75mM柠檬酸钠、80mM柠檬酸钠等等。

在一些实施方案中，阳离子交换色谱法步骤的洗涤缓冲液的pH值为pH 6.0至pH9.0，例如pH 6.0-pH 9.0、pH 6.3-pH 9.0、pH 6.5-pH 9.0、pH 7.0-pH 9.0、pH 7.5-pH9.0、pH 7.7.0-pH 9.0、pH 8.0-pH 9.0、pH 6.0-pH 8.5、pH 6.5-pH 8.5、pH 7.0-pH 8.5、pH 7.5-pH 8.5、pH 6.0-pH 8.0、pH 6.5-pH 8.0、pH 7.0-pH 8.0、pH 7.5-pH 8.0、pH 6.0、pH 6.1、pH 6.2、pH 6.3、pH 6.4、pH 6.5、pH 6.6、pH 6.7、pH 6.8、pH 6.9、pH 7.0、pH 7.1、pH 7.2、pH 7.3、pH 7.4、pH 7.5、pH 7.6、pH 7.7、pH 7.8、pH 7.9、pH 8.0、pH 8.1、pH 8.2、pH 8.3、pH 8.4、pH 8.5、pH 8.6、pH 8.7、pH 8.8、pH 8.9或pH 9.0。

在一些实施方案中，阳离子交换色谱法步骤的洗脱缓冲液的pH值为pH 6.0至pH9.0，例如pH 6.0-pH 9.0、pH 6.3-pH 9.0、pH 6.5-pH 9.0、pH 7.0-pH 9.0、pH 7.5-pH9.0、pH 7.7.0-pH 9.0、pH 8.0-pH 9.0、pH 6.0-pH 8.5、pH 6.5-pH 8.5、pH 7.0-pH 8.5、pH 7.5-pH 8.5、pH 6.0-pH 8.0、pH 6.5-pH 8.0、pH 7.0-pH 8.0、pH 7.5-pH 8.0、pH 6.0、pH 6.1、pH 6.2、pH 6.3、pH 6.4、pH 6.5、pH 6.6、pH 6.7、pH 6.8、pH 6.9、pH 7.0、pH 7.1、pH 7.2、pH 7.3、pH 7.4、pH 7.5、pH 7.6、pH 7.7、pH 7.8、pH 7.9、pH 8.0、pH 8.1、pH 8.2、pH 8.3、pH 8.4、pH 8.5、pH 8.6、pH 8.7、pH 8.8、pH 8.9或pH 9.0。

在一些实施方案中，洗脱缓冲液的pH值与步骤a)中的起始溶液相比增加，当采用两种洗脱缓冲液时与第一种洗脱缓冲液相比增加，和/或当采用洗涤缓冲液时与洗涤缓冲液相比增加。在一些实施方案中，当采用洗涤缓冲液和洗脱缓冲液时，洗涤缓冲液具有小于7的pH值并且洗脱缓冲液具有大于7的pH值。在一些实施方案中，当采用两种洗脱缓冲液时，一种洗脱缓冲液具有小于7的pH值并且另一种洗脱缓冲液具有大于7的pH值。在一些实施方案中，当采用洗涤缓冲液和两种洗脱缓冲液时，洗涤缓冲液具有小于7的pH值并且两种洗脱缓冲液具有大于7的pH值。在一些实施方案中，当采用洗涤缓冲液和两种洗脱缓冲液时，洗涤缓冲液和第一种洗脱缓冲液具有小于7的pH值并且第二种洗脱缓冲液具有大于7的pH值。在一些实施方案中，当采用两种洗涤缓冲液和两种洗脱缓冲液时，洗涤缓冲液和第一种洗脱缓冲液具有小于7的pH值并且第二种洗脱缓冲液具有大于7的pH值。在一些实施方案中，当采用两种洗涤缓冲液和两种洗脱缓冲液时，两种洗涤缓冲液均具有小于7的pH值并且两种洗脱缓冲液均具有大于7的pH值。在一些实施方案中，当采用两种洗涤缓冲液和两种洗脱缓冲液时，第一种洗涤缓冲液具有小于7的pH值并且第二洗涤缓冲液和两种洗脱缓冲液具有大于7的pH值。

在一些实施方案中，如在方法的步骤(a)中所述，与包含前rVWF、mat-rVWF/rVWF-PP复合物、mat-rVWF和/或rVWF前肽(rVWF-PP)的上样溶液相比，一种或多种洗涤和/或洗脱缓冲液的pH值增加到至少7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或8.0。在一些实施方案中，将缓冲液的pH值增加到至少7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或8.0，以诱导方法的步骤(a)中的溶液中的mat-rVWF/rVWF-PP复合物解离成mat-rVWF和rVWF-PP，其中所述解离通过破环非共价缔合的mat-rVWF和rVWF-PP而发生。在一些实施方案中，上样溶液的pH值增加到至少约7.2至约7.8。在一些实施方案中，上样溶液的pH值增加到至少约7.6。在一些实施方案中，通过加入碱性氨基酸来增加上样溶液的pH值。在一些实施方案中，上样溶液的pH值增加到至少7。在一些实施方案中，一种或多种洗涤缓冲液的pH值增加到至少约7.2至约7.8。在一些实施方案中，一种或多种洗涤缓冲液的pH值增加到至少约7.6。在一些实施方案中，通过加入碱性氨基酸来增加一种或多种洗涤缓冲液的pH值。在一些实施方案中，一种或多种洗涤缓冲液展现至少7的pH值。在一些实施方案中，一种或多种洗脱缓冲液的pH值增加到至少约7.2至约7.8。在一些实施方案中，一种或多种洗脱缓冲液的pH值增加到至少约7.6。在一些实施方案中，通过加入碱性氨基酸来增加一种或多种洗脱缓冲液的pH值。在一些实施方案中，一种或多种洗脱缓冲液展现至少7的pH值。

在一些实施方案中，一种或多种缓冲液(包括洗涤和/或洗脱缓冲液)包含一种或多种螯合剂。在一些实施方案中，洗脱缓冲液包括至少一种螯合剂。螯合剂可以是二价阳离子螯合剂。在一些实施方案中，至少一种螯合剂是二价阳离子螯合剂。在一些实施方案中，二价阳离子螯合剂选自由以下组成的组：EDTA、EGTA、CDTA和柠檬酸盐。在一些实施方案中，二价阳离子螯合剂选自由以下组成的组：NTA、DTPA、EDDS、EDTA、EGTA、CDTA和柠檬酸盐。在一些实施方案中，二价阳离子螯合剂选自由以下组成的组：柠檬酸盐、EDTA、DTPA、NTA和EDDS。在一些实施方案中，螯合剂是NTA。在一些实施方案中，螯合剂是DTPA。在一些实施方案中，螯合剂是EDDS。在一些实施方案中，螯合剂是EDTA。在一些实施方案中，螯合剂是EGTA。在一些实施方案中，螯合剂是CDTA。在一些实施方案中，螯合剂是柠檬酸盐。在一些实施方案中，b)中的一种或多种缓冲液包含所述一种或多种螯合剂并展现至少7的pH值。

本文所述的任一种缓冲液(缓冲液体系)可以选自由以下组成的组：甘氨酸、HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸)、TrisHCl(Tris(羟甲基)-氨基甲烷)、组氨酸、咪唑、乙酸盐柠檬酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐、MES、磷酸盐、TrisHCl、Bis-Tris、组氨酸、咪唑、精氨酸HCl、赖氨酸HCl和2-(N-吗啉基)乙烷磺酸，呈单一缓冲液或呈两种或更多种缓冲液的组合。在一些实施方案中，一种或多种缓冲液选自由以下组成的组：甘氨酸HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸)、TrisHCl(三(羟甲基)-氨基甲烷)、组氨酸、咪唑、乙酸盐柠檬酸盐、MES和2-(N-吗啉基)乙烷磺酸。在一些实施方案中，缓冲液包含柠檬酸盐、乙酸盐、MES、HEPES、磷酸盐、TrisHCl和/或Bis-Tris。在一些实施方案中，缓冲液包含甘氨酸。在一些实施方案中，缓冲液包含HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸)。在一些实施方案中，缓冲液包含TrisHCl(三(羟甲基)-氨基甲烷)。在一些实施方案中，缓冲液包含组氨酸。在一些实施方案中，缓冲液包含咪唑。在一些实施方案中，缓冲液包含乙酸盐柠檬酸盐。在一些实施方案中，缓冲液包含柠檬酸盐。在一些实施方案中，缓冲液包含乙酸盐。在一些实施方案中，缓冲液包含MES。在一些实施方案中，缓冲液包含HEPES。在一些实施方案中，缓冲液包含磷酸盐。在一些实施方案中，缓冲液包含Tris-HCl。在一些实施方案中，缓冲液包含Bis-Tris。在一些实施方案中，缓冲液包含组氨酸。在一些实施方案中，缓冲液包含咪唑。在一些实施方案中，缓冲液包含精氨酸HCl。在一些实施方案中，缓冲液包含赖氨酸HCl。在一些实施方案中，缓冲液包含2-(N-吗啉基)乙烷磺酸。在一些实施方案中，缓冲液包含本文中所列出的缓冲液中的一种、两种、三种或四种。

在一些实施方案中，一种或多种缓冲液(包括洗涤和/或洗脱缓冲液)包含在包括但不限于以下的范围内的柠檬酸钠：10mM-80mM柠檬酸钠、15mM-80mM柠檬酸钠、10mM-80mM柠檬酸钠、15mM-60mM柠檬酸钠、20mM-60mM柠檬酸钠、10mM柠檬酸钠、20mM柠檬酸钠、30mM柠檬酸钠、40mM柠檬酸钠、50mM柠檬酸钠、55mM柠檬酸钠、60mM柠檬酸钠、65mM柠檬酸钠、70mM柠檬酸钠、75mM柠檬酸钠、80mM柠檬酸钠等等。

在一些实施方案中，第一种洗脱缓冲液还包含在包括但不限于以下的范围内的柠檬酸钠：10mM-60mM柠檬酸钠、15mM-60mM柠檬酸钠、10mM-50mM柠檬酸钠、15mM-50mM柠檬酸钠、20mM-60mM柠檬酸钠、10mM柠檬酸钠、20mM柠檬酸钠、30mM柠檬酸钠、40mM柠檬酸钠、50mM柠檬酸钠、60mM柠檬酸钠等等。

在一些实施方案中，第二种洗脱缓冲液还包含在包括但不限于以下的范围内的柠檬酸钠：10mM-60mM柠檬酸钠、15mM-60mM柠檬酸钠、10mM-50mM柠檬酸钠、15mM-50mM柠檬酸钠、20mM-60mM柠檬酸钠、10mM柠檬酸钠、20mM柠檬酸钠、30mM柠檬酸钠、40mM柠檬酸钠、50mM柠檬酸钠、60mM柠檬酸钠等等。

在一些实施方案中，阳离子交换色谱法步骤的一种或多种缓冲液(包括洗涤和/或洗脱缓冲液)包含EDTA，只要所需rVWF物质保持结合于阳离子交换树脂就行。在一些实施方案中，阳离子交换色谱法步骤的一种或多种缓冲液(包括洗涤和/或洗脱缓冲液)包含约0.5mM至约20mM EDTA，例如约0.5mM-约20mM、约1mM-约20mM、约1.5mM-约20mM、约2mM-约20mM、约3mM-约20mM、约5mM-约20mM、约0.5mM-约15mM、约1mM-约10mM、约1mM-约5mM、约5mM、约0.5mM、约1mM、约2mM、约3mM、约4mM、约5mM、约6mM、约7mM、约8mM、约9mM、约10mM、约11mM、约12mM、约13mM、约14mM、约15mM、约16mM、约17mM、约18mM、约19mM、约20mM等等，只要所需rVWF物质保持结合于阳离子交换树脂就行。在一些实施方案中，采用包含EDTA的缓冲液作为逐步阳离子交换洗脱的一部分。在一些实施方案中，采用包含EDTA的缓冲液作为梯度阳离子交换洗脱的一部分。在一些实施方案中，当采用EDTA作为用于逐步阳离子交换洗脱中的缓冲液的一部分时，反离子为Na+。在一些实施方案中，当采用EDTA作为用于梯度阳离子交换洗脱中的缓冲液的一部分时，反离子为Na+。

在一些实施方案中，在已经使用阳离子交换法除去rVWF-前肽之后，可以在洗脱剂中发现柠檬酸盐。在一些实施方案中，在已经使用逐步阳离子交换洗脱法除去rVWF-前肽之后，可以在洗脱剂中发现柠檬酸盐。在一些实施方案中，在已经使用梯度阳离子交换洗脱法除去rVWF-前肽之后，可以在洗脱剂中发现柠檬酸盐。在一些实施方案中，阳离子交换反离子是Na

在一些实施方案中，缓冲液(包括洗涤和/或洗脱缓冲液)的电导率在5mS/cm至40mS/cm，例如5mS/cm-40mS/cm、10mS/cm-40mS/cm、15mS/cm-40mS/cm、20mS/cm-40mS/cm、5mS/cm-15mS/cm、10mS/cm-25mS/cm、15mS/cm-30mS/cm、20mS/cm-30mS/cm或30mS/cm-40mS/cm范围内。

在一些实施方案中，至少一种洗涤缓冲液的电导率为约5mS/cm至约40mS/cm，例如约5mS/cm-约40mS/cm、约10mS/cm-约40mS/cm、约15mS/cm-约40mS/cm、约20mS/cm-约40mS/cm、约25mS/cm-约40mS/cm、约30mS/cm-约40mS/cm、约10mS/cm-约40mS/cm、约10mS/cm-约30mS/cm、约5mS/cm-约13mS/cm、约5mS/cm-约15mS/cm、约15mS/cm-约30mS/cm、约18mS/cm-约40mS/cm或约20mS/cm-约40mS/cm。在其它实施方案中，两种或更多种洗涤缓冲液的电导率为约5mS/cm至约40mS/cm，例如约5mS/cm-约40mS/cm、约10mS/cm-约40mS/cm、约15mS/cm-约40mS/cm、约20mS/cm-约40mS/cm、约25mS/cm-约40mS/cm、约30mS/cm-约40mS/cm、约10mS/cm-约40mS/cm、约10mS/cm-约30mS/cm、约5mS/cm-约13mS/cm、约5mS/cm-约15mS/cm、约15mS/cm-约30mS/cm、约18mS/cm-约40mS/cm或约20mS/cm-约40mS/cm。

在一些实施方案中，至少一种洗脱缓冲液的电导率为约5mS/cm至约40mS/cm，例如约5mS/cm-约40mS/cm、约10mS/cm-约40mS/cm、约15mS/cm-约40mS/cm、约20mS/cm-约40mS/cm、约25mS/cm-约40mS/cm、约30mS/cm-约40mS/cm、约10mS/cm-约40mS/cm、约10mS/cm-约30mS/cm、约5mS/cm-约13mS/cm、约5mS/cm-约15mS/cm、约15mS/cm-约30mS/cm、约18mS/cm-约40mS/cm或约20mS/cm-约40mS/cm。在其它实施方案中，两种或更多种洗涤缓冲液的电导率为约5mS/cm至约40mS/cm，例如约5mS/cm-约40mS/cm、约10mS/cm-约40mS/cm、约15mS/cm-约40mS/cm、约20mS/cm-约40mS/cm、约25mS/cm-约40mS/cm、约30mS/cm-约40mS/cm、约10mS/cm-约40mS/cm、约10mS/cm-约30mS/cm、约5mS/cm-约13mS/cm、约5mS/cm-约15mS/cm、约15mS/cm-约30mS/cm、约18mS/cm-约40mS/cm或约20mS/cm-约40mS/cm。

在一些实施方案中，洗涤缓冲液的pH值为pH 6.0至pH 9.0，例如pH 6.0-pH 9.0、pH 6.3-pH 9.0、pH 6.5-pH 9.0、pH 7.0-pH 9.0、pH 7.5-pH 9.0、pH 7.7.0-pH 9.0、pH8.0-pH 9.0、pH 6.0-pH 8.5、pH 6.5-pH 8.5、pH 7.0-pH 8.5、pH 7.5-pH 8.5、pH 6.0-pH8.0、pH 6.5-pH 8.0、pH 7.0-pH 8.0、pH 7.5-pH 8.0、pH 6.0、pH 6.1、pH 6.2、pH 6.3、pH6.4、pH 6.5、pH 6.6、pH 6.7、pH 6.8、pH 6.9、pH 7.0、pH 7.1、pH 7.2、pH 7.3、pH 7.4、pH7.5、pH 7.6、pH 7.7、pH 7.8、pH 7.9、pH 8.0、pH 8.1、pH 8.2、pH 8.3、pH 8.4、pH 8.5、pH8.6、pH 8.7、pH 8.8、pH 8.9、pH 9.0。

在一方面，本文所述的方法包括梯度洗脱步骤。梯度洗脱步骤可以除去产物杂质和工艺相关杂质以优化成熟VWF的产率。在一些情况下，与现有技术方法相比，梯度洗脱步骤将更高百分比的VWF前肽与成熟VWF分离。

在一些实施方案中，一种或多种洗脱缓冲液的电导率为约5mS/cm至约40mS/cm，例如约5mS/cm-约40mS/cm、约10mS/cm-约40mS/cm、约15mS/cm-约40mS/cm、约20mS/cm-约40mS/cm、约25mS/cm-约40mS/cm、约30mS/cm-约40mS/cm、约10mS/cm-约40mS/cm、约10mS/cm-约30mS/cm、约5mS/cm-约13mS/cm、约5mS/cm-约15mS/cm、约15mS/cm-约30mS/cm、约18mS/cm-约40mS/cm或约20mS/cm-约40mS/cm。在其它实施方案中，两种或更多种洗涤缓冲液的电导率为约5mS/cm至约40mS/cm，例如约5mS/cm-约40mS/cm、约10mS/cm-约40mS/cm、约15mS/cm-约40mS/cm、约20mS/cm-约40mS/cm、约25mS/cm-约40mS/cm、约30mS/cm-约40mS/cm、约10mS/cm-约40mS/cm、约10mS/cm-约30mS/cm、约5mS/cm-约13mS/cm、约5mS/cm-约15mS/cm、约15mS/cm-约30mS/cm、约18mS/cm-约40mS/cm或约20mS/cm-约40mS/cm。

在一些实施方案中，本发明的方法的一个或多个洗涤步骤的流速是约10cm/h至约200cm/h，例如约10cm/h、约15cm/h、约20cm/h、约25cm/h、约30cm/h、约35cm/h、约40cm/h、约45cm/h、约50cm/h、约55cm/h、约60cm/h、约65cm/h、约70cm/h、约75cm/h、约80cm/h、约85cm/h、约90cm/h、约95cm/h、约100cm/h、约105cm/h、约110cm/h、约115cm/h、约120cm/h、约125cm/h、约130cm/h、约135cm/h、约140cm/h、约145cm/h、约150cm/h、约155cm/h、约160cm/h、约165cm/h、约170cm/h、约175cm/h、约180cm/h、约185cm/h、约190cm/h、约195cm/h或约200cm/h。取决于树脂，在一些实施方案中，流速可以高达600cm/h。

在一些实施方案中，本发明的方法的一个或多个洗脱步骤的流速是约10cm/h至约200cm/h，例如约10cm/h、约15cm/h、约20cm/h、约25cm/h、约30cm/h、约35cm/h、约40cm/h、约45cm/h、约50cm/h、约55cm/h、约60cm/h、约65cm/h、约70cm/h、约75cm/h、约80cm/h、约85cm/h、约90cm/h、约95cm/h、约100cm/h、约105cm/h、约110cm/h、约115cm/h、约120cm/h、约125cm/h、约130cm/h、约135cm/h、约140cm/h、约145cm/h、约150cm/h、约155cm/h、约160cm/h、约165cm/h、约170cm/h、约175cm/h、约180cm/h、约185cm/h、约190cm/h、约195cm/h或约200cm/h。取决于树脂，在一些实施方案中，流速可以高达600cm/h。

在一些实施方案中，一种或多种缓冲液还包含一种或多种非离子型洗涤剂。在一些实施方案中，非离子型洗涤剂选自由以下组成的组：Triton-X100、Tween 80和Tween 20。在一些实施方案中，非离子型洗涤剂是Triton X-100。在一些实施方案中，非离子型洗涤剂是Tween 80。在一些实施方案中，非离子型洗涤剂是Tween 20。

在一些实施方案中，所述一种或多种缓冲液还包含一种或多种选自由以下组成的组的额外物质：非还原糖、糖醇和多元醇。在一些实施方案中，一种或多种缓冲液还包含一种或多种非还原糖。在一些实施方案中，非还原糖包括但不限于蔗糖、海藻糖、甘露糖醇、山梨糖醇、半乳糖醇和/或木糖醇。在一些实施方案中，一种或多种缓冲液还包含一种或多种糖醇。在一些实施方案中，一种或多种缓冲液还包含一种或多种多元醇。在一些实施方案中，糖醇或多元醇包括但不限于甘露糖醇、木糖醇、赤藓醇、苏糖醇、山梨糖醇和/或丙三醇。在一些实施方案中，缓冲液还包含山梨糖醇、甘露糖醇、木糖醇、蔗糖、海藻糖、乙二醇、丙二醇、丙三醇、1,2,3-丙三醇、内消旋-赤藓醇和/或赤藓醇(内消旋-1,2,3,4-丁四醇)。

可以通过加入氨基酸、Tris、NaOH、乙醇胺等等调整(增加)任何缓冲液的pH值。

本文所述的任一种缓冲液(缓冲液体系)可以选自由以下组成的组：柠檬酸盐、乙酸盐、MES、HEPES、磷酸盐、TrisHCl、Bis-Tris，呈单一缓冲液或呈两种或更多种缓冲液的组合形式。在一些实施方案中，缓冲液包含甘氨酸。在一些实施方案中，缓冲液包含柠檬酸盐。在一些实施方案中，缓冲液包含乙酸盐。在一些实施方案中，缓冲液包含MES。在一些实施方案中，缓冲液包含HEPES。在一些实施方案中，缓冲液包含磷酸盐。在一些实施方案中，缓冲液包含TrisHCl。在一些实施方案中，缓冲液包含Bis-Tris。在一些实施方案中，缓冲液包含本文中所列出的缓冲液中的一种、两种、三种或四种。

在一些实施方案中，阳离子交换法缓冲液螯合剂组合包含柠檬酸盐、苹果酸盐(苹果酸)和酒石酸盐(酒石酸)。

c.

在本发明的一方面，成熟VWF和VWF-PP通过尺寸排阻色谱法(SEC)分离。在一些情况下，从成熟VWF除去剩余的源自宿主细胞的杂质，例如CHO宿主细胞蛋白；工艺相关的杂质，例如重组弗林蛋白酶和低分子量病毒灭活试剂；培养基化合物，例如大豆蛋白胨；和其它产物相关杂质。

在本发明方法的另一方面，使用尺寸排阻色谱法将成熟VWF与例如残留VWF-PP或游离VWF-PP的VWF-PP分离。为了分离，起始组合物或上样组合物可以包含低pH值和至少一种螯合剂。在其它实施方案中，梯度洗脱缓冲液具有中性至高pH值，例如在pH 6.0至pH 9.0范围内的pH值。在另一个实施方案中，梯度洗脱缓冲液包含一种或多种螯合剂并具有7.0或更高的pH值，例如pH 7.0至pH 9.0。举例来说，梯度洗脱缓冲液可以包括EDTA并具有8.5的pH值。

在一些实施方案中，本发明提供了一种获得包含高纯度的去除前肽的成熟重组rVWF(高纯度的mat-rVWF)的组合物的方法，所述方法包括以下步骤：(a)将包含前rVWF、mat-rVWF/rVWF-PP复合物、mat-rVWF和/或rVWF前肽(rVWF-PP)的溶液上样至尺寸排阻柱上，其中所述前rVWF、mat-rVWF/rVWF-PP复合物和mat-rVWF结合于所述尺寸排阻柱；(b)将a)中含有所述结合的前rVWF、mat-rVWF/rVWF-PP复合物和mat-rVWF的所述尺寸排阻柱用一种或多种洗涤缓冲液洗涤；(c)将b)中包含所述结合的前rVWF、mat-rVWF/rVWF-PP复合物和mat-rVWF的所述柱用弗林蛋白酶处理，其中所述弗林蛋白酶使所述前rVWF裂解成mat-rVWF和rVWF-PP；(d)用洗脱缓冲液将所述结合的前rVWF、mat-rVWF/rVWF-PP复合物和mat-rVWF从c)中的所述柱洗脱，其中所述洗脱缓冲液诱导所述rVWF-PP从与所述rVWF-PP非共价缔合的mat-rVWF解离，并且其中所述解离是通过以下诱导：(i)将至少一种螯合剂加入至所述洗脱缓冲液中，或(ii)将所述洗脱缓冲液的pH值增加到至少7的pH值；以及(e)将所述mat-rVWF与所述rVWF-PP分开收集，以获得高纯度的mat-rVWF组合物，其中所述高纯度的mat-rVWF组合物包含至少95％成熟rVWF和少于5％rVWF-PP。

在一些实施方案中，a)和b)在单个步骤中同时发生。在一些实施方案中，a)中的溶液包含来自免疫亲和纯化方法的流过物。在一些实施方案中，a)中的溶液包含来自单克隆抗体柱的流过物，其中所述单克隆抗体是FVIII单克隆抗体。在一些实施方案中，a)中的溶液选自由以下组成的组：细胞培养基、抗体柱流过溶液和缓冲溶液。

在一些实施方案中，分离缓冲液具有中性至高的pH值。在其它实施方案中，缓冲液包含至少一种螯合剂。。在一些实施方案中，缓冲液包含至少一种螯合剂并具有中性至高的pH值。举例来说，分离缓冲液可以含有螯合剂并具有6.0或更高的pH值，或者在一些情况下，7.0或更高的pH值。

在一些实施方案中，前VWF的上样浓度为约90IU/ml至约270IU/ml树脂，例如约90IU/ml-约270IU/ml、约100IU/ml-约270IU/ml、约110IU/ml-约270IU/ml、约120IU/ml-约270IU/ml、约130IU/ml-约270IU/ml、约130IU/ml-约270IU/ml、约140IU/ml-约270IU/ml、约150IU/ml-约270IU/ml、约90IU/ml-约250IU/ml、约100IU/ml-约250IU/ml、约110IU/ml-约250IU/ml、约120IU/ml-约250IU/ml、约130IU/ml-约250IU/ml、约130IU/ml-约250IU/ml、约140IU/ml-约250IU/ml、约150IU/ml-约250IU/ml、约90IU/ml-约200IU/ml、约100IU/ml-约200IU/ml、约110IU/ml-约200IU/ml、约120IU/ml-约200IU/ml、约130IU/ml-约200IU/ml、约130IU/ml-约200IU/ml、约140IU/ml-约200IU/ml、约150IU/ml-约200IU/ml、约90IU/ml-约100IU/ml、约100IU/ml-约150IU/ml、约150IU/ml-约200IU/ml、约200IU/ml-约250IU/ml或约250IU/ml-约270IU/ml树脂。

在一些实施方案中，包含前rVWF、mat-rVWF/rVWF-PP复合物、mat-rVWF和/或rVWF前肽(rVWF-PP)的起始组合物、上样溶液或上样组合物的pH值为pH 6.0至pH 9.0，例如pH6.0-pH 9.0、pH 6.3-pH 9.0、pH 6.5-pH 9.0、pH 7.0-pH 9.0、pH 7.5-pH 9.0、pH 7.7.0-pH 9.0、pH 8.0-pH 9.0、pH 6.0-pH 8.5、pH 6.5-pH 8.5、pH 7.0-pH 8.5、pH 7.5-pH 8.5、pH 6.0-pH 8.0、pH 6.5-pH 8.0、pH 7.0-pH 8.0、pH 7.5-pH 8.0、pH 6.0、pH 6.1、pH 6.2、pH 6.3、pH 6.4、pH 6.5、pH 6.6、pH 6.7、pH 6.8、pH 6.9、pH 7.0、pH 7.1、pH 7.2、pH 7.3、pH 7.4、pH 7.5、pH 7.6、pH 7.7、pH 7.8、pH 7.9、pH 8.0、pH 8.1、pH 8.2、pH 8.3、pH 8.4、pH 8.5、pH 8.6、pH 8.7、pH 8.8、pH 8.9或pH 9.0。

在一些实施方案中，尺寸排阻法包含缓冲液体系。在一些实施方案中，缓冲液体系包含一种或多种分离缓冲液。在一些实施方案中，缓冲液体系包含至少一种分离缓冲液。在一些实施方案中，缓冲液体系包含至少两种分离缓冲液。在一些实施方案中，缓冲液体系包含至少第一种分离缓冲液和至少第二种分离缓冲液。

在一些实施方案中，第一种分离缓冲液包含至少一种螯合剂，并且任选地具有在pH 6.0至pH 9.0范围内的pH值。在一些实施方案中，分离洗涤缓冲液具有在pH 6.0至pH9.0范围内的pH值，并且任选地包含至少一种螯合剂。在一些实施方案中，第一种分离缓冲液具有在pH 6.0至pH 6.9范围内的pH值。在一些实施方案中，第二种分离缓冲液具有在pH7.0至pH 9.0范围内的pH值。在一些实施方案中，第一种分离缓冲液可以包含至少一种螯合剂，并且具有在pH 6.0至pH 6.9范围内的pH值。在一些实施方案中，第一种分离缓冲液具有小于7的pH值。在一些实施方案中，第二种分离缓冲液具有大于7的pH值。在一些实施方案中，当采用两种分离缓冲液时，第一种分离缓冲液具有小于7的pH值并且第二种分离缓冲液具有大于7的pH值。

在一些实施方案中，包含成熟rVWF和rVWF-PP的起始溶液与包含至少一种螯合剂的分离缓冲液接触，并且任选地，缓冲液具有在pH 6.0至pH 9.0范围内的pH值。在一些实施方案中，起始溶液与具有在pH 6.0至pH 9.0范围内的pH值的缓冲液接触，并且任选地，缓冲液包含至少一种螯合剂。在一些实施方案中，缓冲液具有在pH 7.0至pH 9.0范围内的pH值。在一些实施方案中，缓冲液是具有6.0至6.9的pH值的第一种分离缓冲液。在一些实施方案中，缓冲液是具有7.0至9.0的pH值的第二种分离缓冲液。在一些实施方案中，包含成熟rVWF和rVWF-PP的起始溶液首先与具有6.0至6.9的pH值的第一种缓冲液接触，并且与具有7.0至9.0的pH值的第二种分离缓冲液接触。

在一些实施方案中，一种或多种分离缓冲液的pH值为pH 6.0至pH 9.0，例如pH6.0-pH 9.0、pH 6.3-pH 9.0、pH 6.5-pH 9.0、pH 7.0-pH 9.0、pH 7.5-pH 9.0、pH 7.7.0-pH 9.0、pH 8.0-pH 9.0、pH 6.0-pH 8.5、pH 6.5-pH 8.5、pH 7.0-pH 8.5、pH 7.5-pH 8.5、pH 6.0-pH 8.0、pH 6.5-pH 8.0、pH 7.0-pH 8.0、pH 7.5-pH 8.0、pH 6.0、pH 6.1、pH 6.2、pH 6.3、pH 6.4、pH 6.5、pH 6.6、pH 6.7、pH 6.8、pH 6.9、pH 7.0、pH 7.1、pH 7.2、pH 7.3、pH 7.4、pH 7.5、pH 7.6、pH 7.7、pH 7.8、pH 7.9、pH 8.0、pH 8.1、pH 8.2、pH 8.3、pH 8.4、pH 8.5、pH 8.6、pH 8.7、pH 8.8、pH 8.9或pH 9.0。

在一些实施方案中，洗脱缓冲液的pH值与步骤a)中的起始溶液相比增加，当采用两种分离缓冲液时与第一种分离缓冲液相比增加，和/或当采用第二种分离缓冲液时与第一种分离缓冲液相比增加。在一些实施方案中，当采用第一种分离缓冲液和第二种分离缓冲液时，第一分离缓冲液具有小于7的pH值并且第二种分离缓冲液具有大于7的pH值。

在一些实施方案中，如在方法的步骤(a)中所述，与包含前rVWF、mat-rVWF/rVWF-PP复合物、mat-rVWF和/或rVWF前肽(rVWF-PP)的上样溶液相比，一种或多种分离缓冲液的pH值增加到至少7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或8.0。在一些实施方案中，将缓冲液的pH值增加到至少7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或8.0，以诱导方法的步骤(a)中的溶液中的mat-rVWF/rVWF-PP复合物解离成mat-rVWF和rVWF-PP，其中所述解离通过破环非共价缔合的mat-rVWF和rVWF-PP而发生。在一些实施方案中，上样溶液的pH值增加到至少约7.2至约7.8。在一些实施方案中，上样溶液的pH值增加到至少约7.6。在一些实施方案中，通过加入碱性氨基酸来增加上样溶液的pH值。在一些实施方案中，上样溶液的pH值增加到至少7。在一些实施方案中，一种或多种洗涤缓冲液的pH值增加到至少约7.2至约7.8。在一些实施方案中，一种或多种洗涤缓冲液的pH值增加到至少约7.6。在一些实施方案中，通过加入碱性氨基酸来增加一种或多种分离缓冲液的pH值。在一些实施方案中，一种或多种分离缓冲液展现至少7的pH值。

在一些实施方案中，一种或多种分离缓冲液还包含一种或多种螯合剂。在一些实施方案中，洗脱缓冲液包括至少一种螯合剂。螯合剂可以是二价阳离子螯合剂。在一些实施方案中，至少一种螯合剂是二价阳离子螯合剂。在一些实施方案中，二价阳离子螯合剂选自由以下组成的组：EDTA、EGTA、CDTA和柠檬酸盐。在一些实施方案中，二价阳离子螯合剂选自由以下组成的组：NTA、DTPA、EDDS、EDTA、EGTA、CDTA和柠檬酸盐。在一些实施方案中，螯合剂是NTA。在一些实施方案中，螯合剂是DTPA。在一些实施方案中，螯合剂是EDDS。在一些实施方案中，螯合剂是EDTA。在一些实施方案中，螯合剂是EGTA。在一些实施方案中，螯合剂是CDTA。在一些实施方案中，螯合剂是柠檬酸盐。在一些实施方案中，b)中的一种或多种缓冲液包含所述一种或多种螯合剂并展现至少7的pH值。

在一些实施方案中，一种或多种分离缓冲液包括至少一种螯合剂。螯合剂可以是二价阳离子螯合剂。在一些实施方案中，二价阳离子螯合剂选自由以下组成的组：次氮基-2,2',2”-三乙酸(NTA)、二乙烯三胺五乙酸；二乙烯三胺-N,N,N',N',N”-五乙酸(DTPA)、乙二胺-N,N'-二琥珀酸(EDDS)、乙二胺四乙酸(EDTA)、EGTA、CDTA和柠檬酸盐。在一些实施方案中，二价阳离子螯合剂选自由以下组成的组：NTA、DTPA、EDDS、EDTA和柠檬酸盐。在一些实施方案中，螯合剂是NTA。在一些实施方案中，螯合剂是DTPA。在一些实施方案中，螯合剂是EDDS。在一些实施方案中，螯合剂是EDTA。在一些实施方案中，螯合剂是EGTA。在一些实施方案中，螯合剂是CDTA。在一些实施方案中，螯合剂是柠檬酸盐。

在一些实施方案中，阴离子交换色谱法步骤的洗脱缓冲液A和/或洗脱缓冲液B包含约0.5mM至约20mM EDTA，例如约0.5mM-约20mM、约1mM-约20mM、约1.5mM-约20mM、约2mM-约20mM、约3mM-约20mM、约5mM-约20mM、约0.5mM-约15mM、约1mM-约10mM、约1mM-约5mM、约5mM、约0.5mM、约1mM、约2mM、约3mM、约4mM、约5mM、约6mM、约7mM、约8mM、约9mM、约10mM、约11mM、约12mM、约13mM、约14mM、约15mM、约16mM、约17mM、约18mM、约19mM、约20mM等等。

在一些实施方案中，一种或多种分离缓冲液包含在包括但不限于以下的范围内的柠檬酸钠：10mM-500mM柠檬酸钠、15mM-400mM柠檬酸钠、10mM-400mM柠檬酸钠、15mM-350mM柠檬酸钠、20mM-350mM柠檬酸钠、10mM柠檬酸钠、20mM柠檬酸钠、30mM柠檬酸钠、40mM柠檬酸钠、50mM柠檬酸钠、55mM柠檬酸钠、60mM柠檬酸钠、65mM柠檬酸钠、70mM柠檬酸钠、75mM柠檬酸钠、80mM柠檬酸钠、90mM柠檬酸钠、100mM柠檬酸钠、110mM柠檬酸钠、120mM柠檬酸钠、130mM柠檬酸钠、140mM柠檬酸钠、150mM柠檬酸钠、160mM柠檬酸钠、170mM柠檬酸钠、180mM柠檬酸钠、190mM柠檬酸钠、200mM柠檬酸钠、210mM柠檬酸钠、220mM柠檬酸钠、230mM柠檬酸钠、240mM柠檬酸钠、250mM柠檬酸钠、260mM柠檬酸钠、270mM柠檬酸钠、280mM柠檬酸钠、290mM柠檬酸钠、300mM柠檬酸钠、310mM柠檬酸钠、320mM柠檬酸钠、330mM柠檬酸钠、340mM柠檬酸钠、350mM柠檬酸钠、360mM柠檬酸钠、370mM柠檬酸钠、380mM柠檬酸钠、390mM柠檬酸钠、400mM柠檬酸钠、410mM柠檬酸钠、420mM柠檬酸钠、430mM柠檬酸钠、440mM柠檬酸钠、450mM柠檬酸钠、460mM柠檬酸钠、470mM柠檬酸钠、480mM柠檬酸钠、490mM柠檬酸钠、500mM柠檬酸钠、510mM柠檬酸钠、520mM柠檬酸钠、530mM柠檬酸钠、540mM柠檬酸钠、550mM柠檬酸钠、560mM柠檬酸钠、570mM柠檬酸钠、580mM柠檬酸钠、590mM柠檬酸钠或600mM柠檬酸钠等等。

在一些实施方案中，一种或多种分离缓冲液还包含在包括但不限于以下的范围内的柠檬酸钠：10mM-500mM柠檬酸钠、15mM-400mM柠檬酸钠、10mM-400mM柠檬酸钠、15mM-350mM柠檬酸钠、20mM-350mM柠檬酸钠、10mM柠檬酸钠、20mM柠檬酸钠、30mM柠檬酸钠、40mM柠檬酸钠、50mM柠檬酸钠、55mM柠檬酸钠、60mM柠檬酸钠、65mM柠檬酸钠、70mM柠檬酸钠、75mM柠檬酸钠、80mM柠檬酸钠、90mM柠檬酸钠、100mM柠檬酸钠、110mM柠檬酸钠、120mM柠檬酸钠、130mM柠檬酸钠、140mM柠檬酸钠、150mM柠檬酸钠、160mM柠檬酸钠、170mM柠檬酸钠、180mM柠檬酸钠、190mM柠檬酸钠、200mM柠檬酸钠、210mM柠檬酸钠、220mM柠檬酸钠、230mM柠檬酸钠、240mM柠檬酸钠、250mM柠檬酸钠、260mM柠檬酸钠、270mM柠檬酸钠、280mM柠檬酸钠、290mM柠檬酸钠、300mM柠檬酸钠、310mM柠檬酸钠、320mM柠檬酸钠、330mM柠檬酸钠、340mM柠檬酸钠、350mM柠檬酸钠、360mM柠檬酸钠、370mM柠檬酸钠、380mM柠檬酸钠、390mM柠檬酸钠、400mM柠檬酸钠、410mM柠檬酸钠、420mM柠檬酸钠、430mM柠檬酸钠、440mM柠檬酸钠、450mM柠檬酸钠、460mM柠檬酸钠、470mM柠檬酸钠、480mM柠檬酸钠、490mM柠檬酸钠、500mM柠檬酸钠、510mM柠檬酸钠、520mM柠檬酸钠、530mM柠檬酸钠、540mM柠檬酸钠、550mM柠檬酸钠、560mM柠檬酸钠、570mM柠檬酸钠、580mM柠檬酸钠、590mM柠檬酸钠或600mM柠檬酸钠等等。

在一些实施方案中，一种或多种分离缓冲液还包含柠檬酸钠，例如但不限于10mM-500mM柠檬酸钠、15mM-400mM柠檬酸钠、10mM-400mM柠檬酸钠、15mM-350mM柠檬酸钠、20mM-350mM柠檬酸钠、10mM柠檬酸钠、20mM柠檬酸钠、30mM柠檬酸钠、40mM柠檬酸钠、50mM柠檬酸钠、55mM柠檬酸钠、60mM柠檬酸钠、65mM柠檬酸钠、70mM柠檬酸钠、75mM柠檬酸钠、80mM柠檬酸钠、90mM柠檬酸钠、100mM柠檬酸钠、110mM柠檬酸钠、120mM柠檬酸钠、130mM柠檬酸钠、140mM柠檬酸钠、150mM柠檬酸钠、160mM柠檬酸钠、170mM柠檬酸钠、180mM柠檬酸钠、190mM柠檬酸钠、200mM柠檬酸钠、210mM柠檬酸钠、220mM柠檬酸钠、230mM柠檬酸钠、240mM柠檬酸钠、250mM柠檬酸钠、260mM柠檬酸钠、270mM柠檬酸钠、280mM柠檬酸钠、290mM柠檬酸钠、300mM柠檬酸钠、310mM柠檬酸钠、320mM柠檬酸钠、330mM柠檬酸钠、340mM柠檬酸钠、350mM柠檬酸钠、360mM柠檬酸钠、370mM柠檬酸钠、380mM柠檬酸钠、390mM柠檬酸钠、400mM柠檬酸钠、410mM柠檬酸钠、420mM柠檬酸钠、430mM柠檬酸钠、440mM柠檬酸钠、450mM柠檬酸钠、460mM柠檬酸钠、470mM柠檬酸钠、480mM柠檬酸钠、490mM柠檬酸钠、500mM柠檬酸钠、510mM柠檬酸钠、520mM柠檬酸钠、530mM柠檬酸钠、540mM柠檬酸钠、550mM柠檬酸钠、560mM柠檬酸钠、570mM柠檬酸钠、580mM柠檬酸钠、590mM柠檬酸钠或600mM柠檬酸钠等等。

在一些实施方案中，分离缓冲液的电导率为约5mS/cm至约40mS/cm，例如约5mS/cm-约40mS/cm、约10mS/cm-约40mS/cm、约15mS/cm-约40mS/cm、约20mS/cm-约40mS/cm、约25mS/cm-约40mS/cm、约30mS/cm-约40mS/cm、约10mS/cm-约40mS/cm、约10mS/cm-约30mS/cm、约5mS/cm-约13mS/cm、约5mS/cm-约15mS/cm、约15mS/cm-约30mS/cm、约18mS/cm-约40mS/cm或约20mS/cm-约40mS/cm。

本文所述的缓冲液(缓冲液体系)中的任一种可以选自由以下组成的组：柠檬酸盐、乙酸盐、MES、HEPES、磷酸盐、TrisHCl、Bis-Tris、组氨酸、咪唑、精氨酸HCl、赖氨酸HCl、甘氨酸、甘氨酰甘氨酸、硼酸盐、MOPS、二羟乙甘氨酸、三(羟甲基)甲基甘氨酸、TAPS、TAPSO和PIPES，呈单一缓冲液或呈两种或更多种缓冲液的组合。在一些实施方案中，缓冲液包含甘氨酸。在一些实施方案中，缓冲液包含柠檬酸盐、乙酸盐、MES、HEPES、磷酸盐、TrisHCl、Bis-Tris、组氨酸、咪唑、精氨酸HCl、赖氨酸HCl、甘氨酸、甘氨酰甘氨酸、硼酸盐、MOPS、二羟乙甘氨酸、三(羟甲基)甲基甘氨酸、TAPS、TAPSO和/或PIPES。在一些实施方案中，缓冲液包含柠檬酸盐。在一些实施方案中，缓冲液包含乙酸盐。在一些实施方案中，缓冲液包含MES。在一些实施方案中，缓冲液包含HEPES。在一些实施方案中，缓冲液包含磷酸盐。在一些实施方案中，缓冲液包含Tris-HCl。在一些实施方案中，缓冲液包含Bis-Tris。

在一些实施方案中，缓冲液包含组氨酸。在一些实施方案中，缓冲液包含咪唑。在一些实施方案中，缓冲液包含精氨酸HCl。在一些实施方案中，缓冲液包含赖氨酸HCl。在一些实施方案中，缓冲液包含甘氨酸。在一些实施方案中，缓冲液包含甘氨酰甘氨酸。在一些实施方案中，缓冲液包含硼酸盐。在一些实施方案中，缓冲液包含MOPS。在一些实施方案中，缓冲液包含二羟乙甘氨酸。在一些实施方案中，缓冲液包含三(羟甲基)甲基甘氨酸。在一些实施方案中，缓冲液包含TAPS。在一些实施方案中，缓冲液包含TAPSO。在一些实施方案中，缓冲液包含和PIPES。在一些实施方案中，缓冲液包含本文中所列出的缓冲液中的一种、两种、三种或四种。

在一些实施方案中，一种或多种分离缓冲液还包含一种或多种非离子型洗涤剂。在一些实施方案中，非离子型洗涤剂选自由以下组成的组：Triton-X100、Tween 80和Tween20。在一些实施方案中，非离子型洗涤剂是Triton X-100。在一些实施方案中，非离子型洗涤剂是Tween 80。在一些实施方案中，非离子型洗涤剂是Tween 20。

在一些实施方案中，在本发明的方法的一种或多种分离缓冲液步骤期间使用的流速为约10cm/h至约200cm/h，例如约10cm/h、约15cm/h、约20cm/h、约25cm/h、约30cm/h、约35cm/h、约40cm/h、约45cm/h、约50cm/h、约55cm/h、约60cm/h、约65cm/h、约70cm/h、约75cm/h、约80cm/h、约85cm/h、约90cm/h、约95cm/h、约100cm/h、约105cm/h、约110cm/h、约115cm/h、约120cm/h、约125cm/h、约130cm/h、约135cm/h、约140cm/h、约145cm/h、约150cm/h、约155cm/h、约160cm/h、约165cm/h、约170cm/h、约175cm/h、约180cm/h、约185cm/h、约190cm/h、约195cm/h或约200cm/h。取决于树脂，在一些实施方案中，流速可以高达600cm/h。

在一些实施方案中，在本发明的方法的一种或多种分离缓冲液步骤期间使用的流速为约10cm/h至约200cm/h，例如约10cm/h、约15cm/h、约20cm/h、约25cm/h、约30cm/h、约35cm/h、约40cm/h、约45cm/h、约50cm/h、约55cm/h、约60cm/h、约65cm/h、约70cm/h、约75cm/h、约80cm/h、约85cm/h、约90cm/h、约95cm/h、约100cm/h、约105cm/h、约110cm/h、约115cm/h、约120cm/h、约125cm/h、约130cm/h、约135cm/h、约140cm/h、约145cm/h、约150cm/h、约155cm/h、约160cm/h、约165cm/h、约170cm/h、约175cm/h、约180cm/h、约185cm/h、约190cm/h、约195cm/h或约200cm/h。取决于树脂，在一些实施方案中，流速可以高达600cm/h。

在一些实施方案中，所述一种或多种缓冲液还包含一种或多种选自由以下组成的组的额外物质：非还原糖、糖醇和多元醇。在一些实施方案中，一种或多种缓冲液还包含一种或多种非还原糖。在一些实施方案中，非还原糖包括但不限于蔗糖、海藻糖、甘露糖醇、山梨糖醇、半乳糖醇和/或木糖醇。在一些实施方案中，一种或多种缓冲液还包含一种或多种糖醇。在一些实施方案中，一种或多种缓冲液还包含一种或多种多元醇。在一些实施方案中，糖醇或多元醇包括但不限于甘露糖醇、木糖醇、赤藓醇、苏糖醇、山梨糖醇和/或丙三醇。在一些实施方案中，缓冲液还包含山梨糖醇、甘露糖醇、木糖醇、蔗糖、海藻糖、乙二醇、丙二醇、丙三醇、1,2,3-丙三醇、内消旋-赤藓醇和/或赤藓醇(内消旋-1,2,3,4-丁四醇)。

在一些实施方案中，尺寸排阻色谱法缓冲液螯合剂组合包含柠檬酸盐、苹果酸盐(苹果酸)和酒石酸盐(酒石酸)。

D.

在一些实施方案中，从免疫亲和纯化法获得包含前rVWF、mat-rVWF/rVWF-PP复合物、mat-rVWF和/或rVWF前肽(rVWF-PP)的溶液，包括例如单克隆抗体柱。在一些实施方案中，单克隆抗体柱包含FVIII单克隆抗体。在一些实施方案中，单克隆抗体柱包含VWF单克隆抗体。此类柱和方法是本领域中已知的，并且已经描述。参见例如Zimmerman等人(美国专利第4,361,509号；以引用的方式并入本文中以达成所有目的)，其描述了一种纯化因子VIII的方法，其中因子VIII/VWF复合物结合于单克隆抗VWF抗体，并且通过CaCl

其它方法包括也以引用的方式整体并入本文中的美国专利第6,579,723号中描述的方法，所述美国专利描述了一种使用免疫亲和色谱法程序回收高度纯化的vWF或因子VIII/vWF-复合物的方法。此类方法通过使用含有两性离子物质的洗脱剂从免疫亲和吸附剂回收VWF。两性离子物质的存在允许在整个制备期间使用温和的条件，这便于保持分子完整性、活性和所回收的蛋白质掺入药物制剂中，而无需额外的稳定剂或防腐剂。

任何此类方法可以用于本发明的纯化法，以获得包含前rVWF、mat-rVWF/rVWF-PP复合物、mat-rVWF和/或rVWF前肽(rVWF-PP)的溶液。在一些实施方案中，在本文所述的任一所述纯化程序，包括基于阳离子交换、阴离子交换和/或尺寸排阻色谱法程序的纯化程序中，免疫亲和纯化任选地在步骤(a)之前进行。

E.

在一些实施方案中，本文提供的组合物的宿主细胞(HC)杂质含量等于或小于2.0ppm，例如2.0ppm、1.9ppm、1.8ppm、1.7ppm、1.6ppm、1.5ppm、1.4ppm、.3ppm、1.2ppm、1.1ppm、1.0ppm、0.9ppm、0.8ppm、0.7ppm、0.6ppm、0.5ppm、0.4ppm、0.3ppm、0.2ppm、0.1ppm、0.09ppm、0.08ppm、0.07ppm、0.06ppm、0.05ppm、0.04ppm、0.03ppm、0.02ppm、0.01ppm或更少。在其它实施方案中，本文提供的组合物的宿主细胞杂质含量等于或小于0.6ppm，例如0.6ppm、0.5ppm、0.4ppm、0.3ppm、0.2ppm、0.1ppm、0.09ppm、0.08ppm、0.07ppm、0.06ppm、0.05ppm、0.04ppm、0.03ppm、0.02ppm、0.01ppm或更少。

在一些实施方案中，本文提供的组合物的宿主细胞(HC)杂质含量等于或小于5.0％(例如≤5.0％)。在一些实施方案中，本文提供的组合物的宿主细胞(HC)杂质含量等于或小于4.0％(例如≤4.0％)。在一些实施方案中，本文提供的组合物的宿主细胞(HC)杂质含量等于或小于3.0％(例如≤3.0％)。在一些实施方案中，本文提供的组合物的宿主细胞(HC)杂质含量等于或小于2.0％(例如≤1.0％)。在一些实施方案中，本文提供的组合物的宿主细胞(HC)杂质含量等于或小于2.0％(例如≤1.0％)。在一些实施方案中，宿主细胞(HC)杂质含量等于或小于0.9％(例如≤0.9％)。在一些实施方案中，宿主细胞(HC)杂质含量等于或小于0.8％(例如≤0.8％)。在一些实施方案中，宿主细胞(HC)杂质含量等于或小于0.7％(例如≤0.7％)。在一些实施方案中，宿主细胞(HC)杂质含量等于或小于0.6％(例如≤0.6％)。在一些实施方案中，宿主细胞(HC)杂质含量等于或小于0.5％(例如≤0.5％)。在一些实施方案中，宿主细胞(HC)杂质含量等于或小于0.4％(例如≤0.4％)。在一些实施方案中，宿主细胞(HC)杂质含量等于或小于0.3％(例如≤0.3％)。在一些实施方案中，宿主细胞(HC)杂质含量等于或小于0.2％(例如≤0.2％)。在一些实施方案中，宿主细胞(HC)杂质含量等于或小于0.1％(例如≤0.1％)。

在一些实施方案中，rVWF-PP杂质小于15％、小于10％、小于5％、小于4％、小于3％、小于2％、小于1％、小于0.5％、小于0.4％、小于0.3％、小于0.2％、小于0.1％或小于0.05％。在一些实施方案中，rVWF-PP杂质小于15％。在一些实施方案中，rVWF-PP杂质小于10％。在一些实施方案中，rVWF-PP杂质小于5％。在一些实施方案中，rVWF-PP杂质小于4％。在一些实施方案中，rVWF-PP杂质小于3％。在一些实施方案中，rVWF-PP杂质小于2％。在一些实施方案中，rVWF-PP杂质小于1％。在一些实施方案中，rVWF-PP杂质小于0.5％。在一些实施方案中，rVWF-PP杂质小于0.4％。在一些实施方案中，rVWF-PP杂质小于0.3％。在一些实施方案中，rVWF-PP杂质小于0.2％。在一些实施方案中，rVWF-PP杂质小于0.1％。在一些实施方案中，rVWF-PP杂质小于0.05％。

表1：示例性VWF-PP除去能力

F.

本发明的游离的成熟重组冯·维勒布兰德因子(rVWF)可以重组产生。本领域的技术人员认识到可用于在宿主细胞中表达重组蛋白的方法。在一些情况下，所述方法包括在例如CHO细胞的宿主细胞中表达编码rVWF的核酸序列，并在产生rVWF、前VWF原、前VWF等等的条件下培养所得宿主细胞。

在某些实施方案中，包含编码VWF的序列的核酸序列可以是表达载体。载体可以通过病毒递送或者可以是质粒。编码蛋白质的核酸序列可以是特定的基因或其生物功能部分。在一个实施方案中，蛋白质至少是VWF的生物活性部分。核酸序列还可以包含适合于控制表达蛋白质的其它序列，例如启动子序列、增强子、TATA框、转录起始位点、多聚接头、限制位点、多聚-A-序列、蛋白质加工序列、选择标志物等等，这些一般是本领域的普通技术人员已知的。

多种载体可以用于表达VWF并且可以选自真核表达载体。用于真核表达的载体的实例包括：(i)对于在酵母中的表达，例如pAO、pPIC、pYES、pMET的载体，使用例如AOX1、GAP、GAL1、AUG1等启动子；(ii)对于在昆虫细胞中的表达，例如pMT、pAc5、pIB、pMIB、pBAC等载体，使用例如PH、p10、MT、Ac5、OpIE2、gp64、polh等启动子；以及(iii)对于在哺乳动物细胞中的表达，例如pSVL、pCMV、pRc/RSV、pcDNA3、pBPV等载体，和源自于例如牛痘病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、逆转录病毒等病毒系统的载体，使用例如CMV、SV40、EF-1、UbC、RSV、ADV、BPV和β-肌动蛋白的启动子。

在一些方面，本发明的方法中所用的rVWF通过使用本领域中已知的方法在哺乳动物细胞培养物中表达而产生。在具体实施方案中，哺乳动物培养物包含CHO细胞。在其它实施方案中，rVWF与重组因子VIII(rFVIII)在相同培养物中共表达。在此类实施方案中，rVWF和rFVIII使用本领域中已知的方法一起纯化(共同纯化)或分开纯化。在其它实施方案中，rVWF在不含rFVIII的培养物中表达。

在一些实施方案中，rVWF从合适的真核宿主系统中表达并分离。真核细胞的实例包括但不限于哺乳动物细胞,例如CHO、COS、HEK293、BHK、SK-Hep和HepG2；昆虫细胞，例如SF9细胞、SF21细胞、S2细胞和High Five细胞；以及酵母细胞，例如酵母(Saccharomyces)或裂殖酵母(Schizosaccharomyces)细胞。在一个实施方案中，VWF可以在酵母细胞、昆虫细胞、鸟类细胞、哺乳动物细胞等中表达。例如，在人类细胞系、仓鼠细胞系或鼠类细胞系中。在一个具体实施方案中，细胞系是CHO、BHK或HEK细胞系。典型地，来自连续细胞系的哺乳动物细胞、例如CHO细胞可以用于表达本发明的VWF。在某些情况下，表达VWF蛋白质并从CHO细胞表达系统分离。

VWF可以在细胞培养系统中或根据本领域的技术人员公认的任何细胞培养方法产生。在一些实施方案中，可以在大型生物反应器中在适合于提供高容量特定的培养表面积的条件下进行细胞培养，以实现高细胞密度和蛋白质表达。一种用于提供此类生长条件的方式是在搅拌槽式生物反应器中使用微载体进行细胞培养。微载体上细胞生长的概念最初是van Wezel描述的(van Wezel,A.L.,Nature,1967,216:64-5)并允许细胞附着在悬浮在生长培养基中的小的固体颗粒的表面上。这些方法提供了高的表面积-体积比，因此允许有效地利用养分。此外，对于真核细胞系中分泌蛋白质的表达，表面积-体积比增加使得分泌水平较高，因此培养物上清液中的蛋白质产率较高。最终，这些方法容易按比例扩大真核表达培养物。

在细胞培养物生长期间，表达VWF的细胞可以结合于球形或多孔微载体。微载体可以是选自如Butler(1988.Spier和Griffiths,Animal Cell Biotechnology 3:283-303)中所述的基于葡聚糖、胶原蛋白、塑料、明胶和纤维素等的微载体的组的微载体。细胞也可能在球形微载体上生长成生物质，并且当它们达到最终的发酵罐生物质时并在多孔微载体上产生所表达的蛋白质之前，再次培养细胞，或反之亦然。合适的球形微载体可以包括光滑表面微载体，例如Cytodex

在另一个实施方案中，在体外通过前VWF暴露于弗林蛋白酶，VWF前肽从未成熟VWF裂解。在一些实施方案中，用于前肽裂解的弗林蛋白酶是重组弗林蛋白酶。

在某些实施方案中，在产生高分子量rVWF的细胞培养基中培养的细胞中表达rVWF。术语“细胞培养溶液”、“细胞培养基”和“细胞培养物上清液”是指本领域中一般众所周知的细胞培养工艺方面。在本发明的情况下，细胞培养溶液可以包括细胞培养基和细胞培养物上清液。细胞培养基从外部加入细胞培养溶液中，任选地与补充物一起，以提供养分和用于培养表达VWF的细胞的其它组分。细胞培养物上清液是指包含养分和来自细胞培养基的其它组分的细胞培养溶液以及在培养期间从细胞释放、代谢和/或分泌的产物。在其它实施方案中，培养基可以是无动物蛋白的，并且化学成分确定。本领域中，例如US 2006/0094104、US 2007/0212770和US 2008/0009040(二者出于所有目的并且尤其关于细胞培养基的所有传授内容，并入本文中)中已知制备无动物蛋白和化学成分确定的培养基的方法。“无蛋白”和相关术语是指来自培养物中的在生长期间天然脱落蛋白质的细胞外部或之外的来源的蛋白质。在另一个实施方案中，培养基无多肽。在另一个实施方案中，培养基无血清。在另一个实施方案中，培养基无动物蛋白。在另一个实施方案中，培养基无动物组分。在另一个实施方案中，培养基含有来自血清、例如胎牛血清的蛋白质，例如动物蛋白。在另一个实施方案中，培养物已经从外部加入重组蛋白。在另一个实施方案中，蛋白质来自于经过认证的无病原体动物。如本文所用的术语“化学成分确定”将意指培养基不包含任何不明确的补充物，例如动物组分、器官、腺体、植物或酵母的提取物。因此，化学成分确定的培养基的每种组分是准确确定的。在一个优选的实施方案中，培养基无动物组分并且无蛋白质。

在某些实施方案中，表达VWF的细胞的培养物可以维持至少约7天，或至少约14天、21天、28天，或至少约5周、6周、7周或至少约2个月或3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18个月或更长时间。为了产生重组VWF蛋白，维持细胞培养物时的细胞密度将取决于用于蛋白质表达的培养条件和培养基。本领域普通技术人员将容易地能够确定产生VWF的细胞培养物的最佳细胞密度。在一个实施方案中，培养物长时间维持在介于约0.5×10

在一特定实施方案中，用于产生rVWF的连续细胞培养物的细胞密度长时间维持在至多2.5×10

在上述细胞培养物的一个实施方案中，细胞培养溶液包含含铜培养基补充物。此类细胞培养溶液描述于例如美国专利第8,852,888号和美国专利第9,409,971号中，这些专利出于所有目的且尤其关于有关产生重组VWF的细胞培养方法和组合物的所有传授内容以引用的方式整体并入本文中。

前VWF原的多核苷酸和氨基酸序列分别示于SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2中，并分别可以GenBank登记号NM_000552(智人冯·维勒布兰德因子(VWF)mRNA)和NP_000543获得。与成熟VWF蛋白质相对应的氨基酸序列示于SEQ ID NO:3(与全长前VWF原氨基酸序列的氨基酸764-2813相对应)中。在一些实施方案中，VWF展现与SEQ ID NO:3的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％同一性。在一些实施方案中，本发明的mat-rVWF展现与SEQ ID NO:3的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％同一性。参见例如美国专利第8,597,910号、美国专利公布第2016/0129090号以及图60。

有用rVWF的一种形式具有至少在体内稳定、例如结合至少一种因子VIII(FVIII)分子并且任选地具有药理学上可接受的糖基化模式的特性。其特定实例包括没有A2结构域，因此对蛋白质水解有抗性的VWF(Lankhof等人,Thromb.Haemost.77:1008-1013,1997)，和从Val 449至Asn 730的VWF片段，包括糖蛋白lb结合结构域和胶原蛋白和肝素结合位点(Pietu等人,Biochem.Biophys.Res.Commun.164:1339-1347,1989)。在一方面，在缺乏VWF的哺乳动物中根据最新技术中已知的方法测定VWF稳定至少一种FVIII分子的能力。

本发明的rVWF可以通过本领域中已知的任何方法产生。一个特定实例公开于1986年10月23日公布的WO86/06096和1990年7月23日提交的美国专利申请第07/559,509号中，所述文献关于产生重组VWF的方法以引用的方式并入本文中。因此，本领域中已知用于实现以下的方法：(i)通过基因工程化，例如通过RNA逆转录和/或DNA扩增，产生重组DNA；(ii)通过转染，例如通过电穿孔或显微注射，将重组DNA引入原核或真核细胞中；(iii)例如以连续或分批方式培养转化细胞；(iv)例如组成性地或在诱导后表达VWF；以及(v)例如从培养基或通过收获转化细胞分离VWF，以(vi)例如通过阴离子交换色谱法或亲和色谱法获得纯化的rVWF。在一方面，在转化宿主细胞中使用本领域中众所周知的重组DNA技术制造重组VWF。举例来说，可以使用合适的限制酶从DNA切除编码多肽的序列。可替代地，在另一方面，DNA分子使用化学合成技术，例如氨基磷酸酯方法合成。另外,在又一方面，也使用这些技术的组合。

本发明还提供了在适当宿主中编码本发明多肽的载体。载体包含可操作地连接于适当表达控制序列的编码多肽的多核苷酸。在多核苷酸被插入载体中之前或之后实现此操作性连接的方法是众所周知的。表达控制序列包括启动子、激活子、增强子、操纵子、核糖体结合位点、起始信号、停止信号、cap信号、多腺苷酸化信号和与控制转录或翻译相关的其它信号。具有多核苷酸的所得载体用于转化适当宿主。这种转化可以使用本领域中众所周知的方法进行。

在实践本发明中，使用大量可利用和众所周知的宿主细胞中的任一种。具体宿主的选择取决于本领域所公认的许多因素，包括例如与所选的表达载体的相容性、被DNA分子编码的肽的毒性、转化速率、肽回收容易性、表达特征、生物安全性和成本。这些因素的平衡必须理解以下一点：不是所有的宿主细胞表达具体的DNA序列都是同等有效的。在这些通用准则内，有用的微生物宿主细胞包括但不限于细菌、酵母和其它真菌、昆虫、植物、培养的哺乳动物(包括人)细胞或本领域中已知的其它宿主。

转化的宿主细胞在常规的发酵条件下培养，以便表达所需化合物。此类发酵条件是本领域中众所周知的。最终，通过本领域中众所周知的方法从培养基或宿主细胞本身纯化多肽。

取决于用于表达本发明化合物的宿主细胞，碳水化合物(寡糖)基团任选地连接至已知是蛋白质中的糖基化位点的位点。一般地，在作为序列Asn-X-Ser/Thr的一部分时，O-连接的寡糖连接至丝氨酸(Ser)或苏氨酸(Thr)残基，而N连接的寡糖连接至天冬酰胺(Asn)残基，其中X可以是除脯氨酸外的任何氨基酸。X优选是19种天然存在的氨基酸中的一种，不计脯氨酸。见于每个类型中的N连接和O连接的寡糖和糖残基的结构是不同的。一种通常在N连接和O连接的寡糖上发现的糖类型是N-乙酰神经氨酸(称为唾液酸)。唾液酸通常是N连接和O连接的寡糖的末端残基，并且在一方面，由于其具有负电荷，故赋予糖基化化合物酸性。此类位点可以并入本发明化合物的接头中，并且优选在多肽化合物的重组产生期间通过细胞糖基化(例如在哺乳动物细胞、例如CHO、BHK、COS)。在其它方面，此类位点通过本领域中已知的合成或半合成程序糖基化。

在一些实施方案中，可以在柱上进行唾液酸化(sialysation)(又称为唾液酸化(sialylation))，作为本文所述的纯化程序(包括阴离子交换、阳离子交换、尺寸排阻和/或免疫亲和法)的一部分。在一些实施方案中，唾液酸化引起rVWF的稳定性与尚未进行唾液酸化的rVWF相比增加。在一些实施方案中，唾液酸化引起血液循环中rVWF的稳定性(例如在施用于受试者之后)与尚未进行唾液酸化的rVWF相比增加。在一些实施方案中，唾液酸化的rVWF的稳定性增加引起比尚未进行唾液酸化的rVWF增加10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多。在一些实施方案中，唾液酸化引起rVWF的半衰期与尚未进行唾液酸化的rVWF相比延长。在一些实施方案中，唾液酸化引起血液循环中rVWF的半衰期(例如在施用于受试者之后)与尚未进行唾液酸化的rVWF相比延长。在一些实施方案中，唾液酸化的rVWF的半衰期增加引起比尚未进行唾液酸化的rVWF增加10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多。在一些实施方案中，唾液酸化的rVWF的半衰期增加引起rVWF与尚未进行唾液酸化的rVWF相比在血液循环中(例如在施用于受试者之后)稳定1小时、2小时、3小时、4小时、6小时、12小时、24小时或更长时间。在一些实施方案中，唾液酸化增加2,3唾液酸化和/或2,6唾液酸化的数目。在一些实施方案中，通过加入2,3唾液酸转移酶和/或2,6唾液酸转移酶和CMP-NANA(胞苷-5′-单磷酸-N-乙酰神经氨酸钠盐)作为额外的缓冲液步骤，增加唾液酸化。在一些实施方案中，通过加入2,3唾液酸转移酶和CMP-NANA(胞苷-5′-单磷酸-N-乙酰神经氨酸钠盐)作为额外的缓冲液步骤，增加唾液酸化。在一些实施方案中，通过加入2,3唾液酸转移酶和CMP-NANA(胞苷-5′-单磷酸-N-乙酰神经氨酸钠盐)作为额外的缓冲液步骤，增加2,3唾液酸化。在一些实施方案中，为了增加唾液酸化，将结合的蛋白质(例如结合的rVWF)用唾液酸酶(例如神经氨糖酸苷酶)处理以除去2,3唾液酸化，接着施加洗涤步骤，以除去唾液酸酶和引入2,6唾液酸化。在一些实施方案中，通过加入2,6唾液酸转移酶和CMP-NANA引入2,6唾液酸化。

在一些实施方案中，通过加入2,6唾液酸转移酶和CMP-NANA(胞苷-5′-单磷酸-N-乙酰神经氨酸钠盐)作为额外的缓冲液步骤，增加2,6唾液酸化。在一些实施方案中，通过加入2,3唾液酸转移酶和/或2,6唾液酸转移酶和CMP-NANA(胞苷-5′-单磷酸-N-乙酰神经氨酸钠盐)作为额外的缓冲液步骤，增加2,3唾液酸化和/或2,6唾液酸化。在一些实施方案中，CMP-NANA通过化学方式或酶修饰，以将修饰的唾液酸转移至潜在的游离位置。在一些实施方案中，通过以下进行唾液酸化：将rVWF上样至树脂上，用如本文所述的一种或多种缓冲液洗涤以去除不必要的杂质，在允许额外唾液酸化的条件下施加一种或多种含有唾液酸转移酶和CMP-NANA的缓冲液，并用一种或多种缓冲液洗涤以去除过量的唾液酸化试剂并且用一种或多种缓冲液增强的rVWF(例如具有增加的唾液酸化的rVWF)洗脱。在一些实施方案中，唾液酸化过程作为如本文所述的阳离子交换法、阴离子交换法、尺寸排阻法、免疫亲和纯化法的一部进行。

可替代地，通过合成方法，使用例如固相合成技术制造化合物。适用技术是本领域中众所周知的，并且包括以下中所述的技术：Merrifield(1973),Chem.Polypeptides,第335-61页(Katsoyannis和Panayotis编辑)；Merrifield(1963),J.Am.Chem.Soc.85:2149；Davis等人(1985),Biochem.Intl.10:394-414；Stewart和Young(1969),Solid PhasePeptide Synthesis；美国专利第3,941,763号；Finn等人(1976),The Proteins(第3版)2:105-253；以及Erickson等人(1976),The Proteins(第3版)2:257-527’。固相合成是优选的制造各别的肽的技术，因为其是制造小型肽的最成本有效的方法。

VWF的片段、变体和类似物可以根据本领域中众所周知的方法产生。多肽的片段可以使用但不限于酶促裂解(例如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶)以及使用产生具有特定氨基酸序列的多肽片段的重组方式来制备。可以产生包含具有特定活性的蛋白质区域，例如多聚结构域或本领域中已知的任何其它可识别的VWF结构域的多肽片段。

制造多肽类似物的方法也是众所周知的。多肽的氨基酸序列类似物可以是取代、插入、添加或缺失类似物。包括多肽片段的缺失类似物缺乏对功能或免疫原性活性来说不是不可或缺的天然蛋白质的一个或多个残基。插入类似物涉及例如氨基酸添加在多肽中的非末端点。这种类似物可以包括例如但不限于免疫活性表位或仅仅单个残基的插入。包括多肽片段的添加类似物包括一个或多个氨基酸加在蛋白质的任一个末端或两个末端，并包括例如融合蛋白。还涵盖上述类似物的组合。

取代类似物典型地在蛋白质内的一个或多个位点将野生型的一个氨基酸换成另一个，并且可以被设计成调节多肽的一种或多种特性，并且不会完全丧失其它功能或特性。在一方面，取代为保守取代。“保守氨基酸取代”是氨基酸经具有侧链或类似化学特性的氨基酸取代。用于保守取代的类似氨基酸包括具有以下侧链的氨基酸：酸性侧链(谷氨酸、天冬氨酸)、碱性侧链(精氨酸、赖氨酸、组氨酸)；极性酰胺侧链(谷氨酰胺、天冬酰胺)；疏水性脂肪族侧链(亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、甘氨酸)；芳香族侧链(苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸)；小的侧链(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸)；或脂肪族羟基侧链(丝氨酸、苏氨酸)。

在一方面，类似物与其所源自的重组VWF基本上同源或基本上同一。类似物包括保留野生型多肽的至少一些生物活性，例如凝血活性的类似物。

所涵盖的多肽变体包括但不限于通过例如以下的技术化学修饰的多肽：泛素化；糖基化，包括聚唾液酸化(或聚唾液酸化)；缀合于治疗或诊断剂；标记；共价聚合物连接，例如聚乙二醇化(用聚乙二醇衍生化)；引入不可水解的键；以及通过例如鸟氨酸的在人蛋白质中通常不存在的氨基酸的化学合成进行的插入或取代。变体保留本发明的未修饰分子的相同或基本上相同的结合特性。此类化学修饰可以包括剂直接或间接(例如通过接头)连接至VWF多肽。在间接连接的情况下，预期接头可以是可水解的或不可水解的。

在一方面，制备聚乙二醇化多肽类似物包括以下步骤：(a)使多肽与聚乙二醇(例如PEG的反应性酯或醛衍生物)在使结合构建体多肽连接至一个或多个PEG基团的条件下反应；和(b)获得反应产物。一般说来，酰化反应的最佳反应条件基于已知参数和所需结果来确定。举例来说，PEG:蛋白质的比率越大，聚乙二醇化产物的百分比越大。在一些实施方案中，结合构建体在N端具有单个PEG部分。聚乙二醇(PEG)可以连接至凝血因子，以例如提供更长的体内半衰期。PEG基团可以具有任何合宜的分子量并且是线性或分支链的。PEG的平均分子量在约2千道尔顿(“kD”)至约100kDa、约5kDa至约50kDa或约5kDa至约10kDa范围内。在某些方面，PEG基团通过酰化或还原性烷基化附接至凝血因子，通过PEG部分上的天然或工程化反应基团(例如醛、氨基、硫醇或酯基)连接至凝血因子上的反应基团(例如醛、氨基或酯基)或通过本领域中已知的任何其它技术。

用于制备聚唾液酸化多肽的方法描述于以下中：美国专利公布20060160948,Fernandes et Gregoriadis；Biochim.Biophys.Acta 1341:26-34,1997；及Saenko等,Haemophilia 12:42-51,2006。简单地说，将含有0.1M NaIO

在另一方面，进一步涵盖本发明的多肽是与作为多肽的第二剂的融合蛋白。在一个实施方案中，作为多肽的第二剂不限于是酶、生长因子、抗体、细胞因子、趋化因子、细胞表面受体、细胞表面受体的胞外域、细胞粘着分子或上述蛋白质的片段或活性结构域。在相关实施方案中，第二剂是凝血因子，例如因子VIII、因子VII和/或因子IX。在一些实施方案中，第二剂是融合蛋白。所涵盖的融合蛋白通过本领域中众所周知的化学或重组技术制造。在一些实施方案中，融合蛋白是rVWF-FVIII融合蛋白。在一些实施方案中，融合蛋白是rVWF-FVIII融合蛋白，其中活性FVIII嵌入VWF基元中。在一些实施方案中，融合蛋白是rVWF-FVIII融合蛋白，其中活性FVIII嵌入VWF基元中，使得VWF是全长。在一些实施方案中，融合蛋白是rVWF-FVIII融合蛋白，其中活性FVIII嵌入VWF基元中，其中VWF序列的一部分缺失并被FVIII序列置换。在rVWF-FVIII融合蛋白的一些实施方案中，FVIII是B结构域缺失的FVIII。在rVWF-FVIII融合蛋白的一些实施方案中，富集N-糖基化的结构域置换FVIII-B-结构域。在rVWF-FVIII融合蛋白的一些实施方案中，富集vWF-N糖基化的结构域与全长FVIII和/或其截短形式稠合。

在rVWF-FVIII融合蛋白的一些实施方案中，融合蛋白包含：

·包含VWF肽的位置764至1336的VWF肽，

·包含FVIII重链肽的位置24至760的FVIII肽，

·包含VWF肽的位置2218至2593的VWF肽，

·包含FVIII轻链肽的位置1333至2351的FVIII肽，和

·包含VWF肽的位置2620至2813的VWF肽。

在rVWF-FVIII融合蛋白的此实施方案中，氨基酸的位置从第一个位置开始数起，包括Pro和/或信号肽。在rVWF-FVIII融合蛋白的此实施方案中，VWF中的位置764与成熟rVWF(mat-rVWF)的位置1对应，并且FVIII中的位置20与成熟FVIII肽的位置1对应。在rVWF-FVIII融合蛋白的一些实施方案中，融合蛋白序列提供于图64中。

在rVWF-FVIII融合蛋白的一些实施方案中，融合蛋白包含：

·包含FVIII重链肽的位置FVIII重链19至760的FVIII肽，

·包含VWF肽的位置2218至2593的VWF肽，和

·包含FVIII轻链肽的位置1333至2351的FVIII肽。

在rVWF-FVIII融合蛋白的此实施方案中，氨基酸的位置从第一个位置开始数起，包括Pro和/或信号肽。在rVWF-FVIII融合蛋白的此实施方案中，VWF中的位置764与成熟rVWF(mat-rVWF)的位置1对应，并且FVIII中的位置20与成熟FVIII肽的位置1对应。在rVWF-FVIII融合蛋白的一些实施方案中，融合蛋白序列提供于图65中。

在另一方面，还涵盖前VWF原和前VWF多肽将在本发明的制剂中提供治疗益处。举例来说，美国专利第7,005,502号描述了一种药物制剂，所述药物制剂包含大量的诱导凝血酶在体外产生的前VWF。除天然存在的成熟VWF的重组的生物活性片段、变体或其它类似物外，本发明涵盖在本文所述的制剂中使用前VWF原(SEQ ID NO:2中所示)或前VWF多肽(SEQID NO:2的氨基酸残基23至764)的重组的生物活性片段、变体或类似物。

熟练工作人员可能容易产生编码片段、变体和类似物的多核苷酸，以编码与天然存在的分子具有相同或类似的生物活性的天然存在的分子的生物活性片段、变体或类似物。在各个方面，这些多核苷酸使用PCR技术、DNA编码分子的消化/接合等来制备。因此，本领域普通技术人员将能够使用本领域中已知的任何方法，包括(但不限于)位点特异性诱变，在DNA链中产生单碱基变化，以引起改变之密码子和错义突变。如本文所用，短语“中等严格的杂交条件”意指例如在50％甲酰胺中在42℃下杂交，以及在0.1×SSC、0.1％SDS中在60℃下洗涤。本领域的技术人员应了解，这些条件基于有待杂交的序列的长度和GC核苷酸碱基含量而变化。本领域中标准的公式适于确定确切的杂交条件。参见Sambrook等人,9.47-9.51in Molecular Cloning,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor,New York(1989)。

G.

在一些实施方案中，本文所述的方法还包括病毒灭活步骤。病毒灭活步骤可以发生在洗涤步骤和/或洗脱步骤之前、之后或同时，但在收集步骤之前。病毒灭活处理可以使脂质包膜病毒灭活。在一些实施方案中，病毒灭活处理是溶剂和洗涤剂(S/D)处理。在一些实施方案中，病毒灭活处理包括使用乙二醇、部分醇中的丙二醇和/或一种或多种有机溶剂。

如本文所用，术语“灭活病毒”或“病毒灭活”是指病毒不再能感染细胞、复制和增殖并且本质上除去病毒的工艺。因而，术语“病毒灭活”一般是指完全不含传染性病毒污染物的本文公开的流体的制造工艺。使用本文公开的方法的任何病毒灭活度都是合乎需要的。然而，需要实现符合严格药物安全准则所需的病毒灭活度。这些准则由WHO规定并且是本领域的技术人员众所周知的。

本文公开的方法还可以包括在孵育之后从混合物除去病毒的步骤。如本文所用，术语“除去病毒”或“病毒除去”是指从本文公开的混合物去除病毒，使得病毒颗粒有效地从混合物提取出的工艺。病毒可以是活病毒或灭活病毒。除去典型地通过尺寸排阻色谱法或正吸附色谱法来实现，其中所关注蛋白质结合于包括例如如本文所述的阴离子交换树脂或阳离子交换树脂的色谱树脂。在除去之后，病毒残留量是当施用于有需要的受试者，包括例如人时基本上没有长期或永久不利影响的量。

在一个实施方案中，除去病毒之后的混合物基本上不含病毒。如本文所用，术语“基本上不含病毒”意指通过用于检测或证实病毒存在或活性的仪器或方法只能检测到或证实痕量的病毒并且这点痕量的病毒不足以对人的健康构成危害。在此实施方案的一个方面中，除去病毒之后的混合物完全不含病毒。如本文所用，术语“完全不含病毒”意指在用于检测或证实病毒存在或活性的仪器或方法的检测范围内不能检测到或证实病毒的存在。基本上不含或完全不含病毒的混合物内所含的蛋白质可以用于制造安全施用于人的药物组合物，因为病毒不足以对人的健康构成危害。

在此实施方案的其它方面中，除去病毒之后的混合物包含小于10PFU/mL病毒，例如小于1PFU/mL病毒、小于1×10

在此实施方案的其它方面，除去病毒之后的混合物包含小于针对病毒的ID50，例如比针对病毒的ID50小至少10倍、比针对病毒的ID50小至少100倍、比针对病毒的ID50小至少200倍、比针对病毒的ID50小至少300倍、比针对病毒的ID50小至少400倍、比针对病毒的ID50小至少500倍、比针对病毒的ID50小至少600倍、比针对病毒的ID50小至少700倍、比针对病毒的ID50小至少800倍、比针对病毒的ID50小至少900倍或比针对病毒的ID50小至少1000倍。

病毒灭活可以结合蛋白质纯化一起进行，或者不一起进行。在一些实施方案中，所述方法包括将蛋白质固定在载体上；以及将固定的蛋白质用包含非离子型洗涤剂和有机溶剂的洗涤剂-溶剂混合物处理。在一些实施方案中，载体是色谱树脂。在某些实施方案中，洗涤剂-溶剂混合物包含1％Triton X-100、0.3％磷酸三正丁酯和0.3％聚山梨醇酯80(Tween80)。溶剂-洗涤剂混合物处理可以持续长时间，例如30分钟至1小时，同时蛋白质保持固定在色谱树脂上，例如在阳离子交换树脂上；和/或溶剂-洗涤剂处理可以在2℃至10℃下发生。这种病毒灭活方法意外地可以使在用洗涤剂-溶剂混合物处理期间蛋白质聚集体的形成与在蛋白质未固定，呈溶液形式时用溶剂-洗涤剂混合物处理相比大量减少，例如超过50％。

在一些实施方案中，含有脂质涂层的病毒灭活的方法包括以下步骤：i)提供包含具有活性的蛋白质的流体；ii)将有机溶剂和表面活性剂与流体混合，由此建立混合物；以及iii)将混合物孵育至多约120分钟；其中步骤(ii)和(iii)都在不高于约20℃的温度下进行；其中孵育之后的混合物基本上不含活的含脂质涂层的病毒；并且其中孵育之后的蛋白质的活性是步骤(i)中提供的活性的至少25％。

在其它实施方案中，可以从包括以下步骤的方法获得基本上不含含有脂质涂层的病毒的蛋白质：i)提供包含具有活性的蛋白质的流体；ii)将有机溶剂和表面活性剂与流体混合，由此建立混合物；以及iii)将混合物孵育至多约120分钟；其中步骤(ii)和(iii)都在不高于约20℃的温度下进行；其中孵育之后的混合物基本上不含活的含脂质涂层的病毒；并且其中孵育之后的蛋白质的活性是步骤(a)中提供的活性的至少25％。

在另一个实施方案中，含有脂质涂层的病毒灭活的方法包括以下步骤：i)提供包含具有活性的凝血蛋白(例如VWF)的流体；ii)将有机溶剂和表面活性剂与流体混合，由此建立混合物；以及iii)将混合物孵育至多约120分钟；其中步骤(ii)和(iii)都在不高于约20℃的温度下进行；其中孵育之后的混合物基本上不含活的含脂质涂层的病毒；并且其中孵育之后的因子VIII的活性是步骤(i)中提供的活性的至少25％。

在一些情况下，有机溶剂是醚、醇、磷酸二烷酯或磷酸三烷酯。在某些实施方案中，醚选自甲醚、乙醚、乙基丙基醚、甲基丁基醚、甲基异丙基醚和/或甲基异丁基醚。

在一些实施方案中，醇选自甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、正戊醇和/或异戊醇。在一些实施方案中，磷酸二烷酯选自磷酸二-(正丁基)酯、磷酸二-(叔丁基)酯、磷酸二-(正己基)酯、磷酸二-(2-乙基己基)酯、磷酸二-(正癸基)酯和/或磷酸乙酯二(正丁基)酯。在一些实施方案中，磷酸三烷酯选自磷酸三-(正丁基)酯、磷酸三-(叔丁基)酯、磷酸三-(正己基)酯、磷酸三-(2-乙基己基)酯和/或磷酸三-(正癸基)酯。

在一些情况下，有机溶剂的最终浓度是约0.1％(v/v)至约5.0％(v/v)、约0.1％(v/v)至约1.0％(v/v)、约0.2％(v/v)至约0.5％(v/v)或约0.2％(v/v)至约0.4％(v/v)、0.3％(v/v)。

在一些情况下，表面活性剂选自离子型表面活性剂、两性离子(两性)表面活性剂和/或非离子型表面活性剂。离子型表面活性剂可以是阴离子表面活性剂或阳离子表面活性剂。

在某些实施方案中，阴离子表面活性剂选自烷基硫酸盐、烷基醚硫酸盐、多库酯(docusate)、磺酸盐氟表面活性剂、烷基苯磺酸盐、烷基芳基醚磷酸盐、烷基醚磷酸盐；烷基羧酸盐、月桂酰肌氨酸钠和/或羧酸盐氟表面活性剂。在一些实施方案中，烷基硫酸盐选自十二烷基硫酸铵或十二烷基硫酸钠(SDS)。在其它实施方案中，烷基醚硫酸盐是月桂醇聚醚硫酸钠和/或肉豆蔻醇聚醚硫酸钠。在一些实施方案中，多库酯是磺基丁二酸二辛酯钠。

在一些实施方案中，磺酸盐氟表面活性剂选自全氟辛烷磺酸盐(PFOS)和/或全氟丁烷磺酸盐。在一些实施方案中，烷基羧酸盐选自脂肪酸盐和/或硬脂酸钠。在一些实施方案中，羧酸盐氟表面活性剂是全氟壬酸盐和全氟辛酸盐。在一些实施方案中，阳离子表面活性剂选自烷基三甲基铵盐、氯化十六烷吡啶鎓(CPC)、聚乙氧基化牛脂胺(POEA)、氯化苯甲烃铵(BAC)、氯化苄乙氧铵(BZT)、5-溴-5-硝基-1,3-二噁烷、二甲基二-十八烷基氯化铵、二-十八烷基二甲基溴化铵(DODAB)、pH依赖性伯胺、pH依赖性仲胺和/或pH依赖性叔胺。在一些实施方案中，烷基三甲基铵盐选自十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)和/或十六烷基三甲基氯化铵(CTAC)。在一些实施方案中，伯胺在pH<10变得带正电，或仲胺在pH<4下变得带电。

在一些实施方案中，阳离子表面活性剂是奥替尼啶二盐酸盐(octenidinedihydrochloride)。

在一些实施方案中，两性离子表面活性剂选自3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基铵基]-1-丙烷磺酸盐(CHAPS)、磺基甜菜碱、甜菜碱和/或卵磷脂。在一些实施方案中，磺基甜菜碱是椰油酰胺丙基羟基磺基甜菜碱。在一些实施方案中，甜菜碱是椰油酰胺基丙基甜菜碱。

在一些实施方案中，非离子型表面活性剂选自聚氧乙二醇脱水山梨糖醇烷基酯、泊洛沙姆(poloxamer)、烷基酚聚乙二醇醚、聚乙二醇烷基芳基醚、聚氧乙二醇烷基醚、2-十二烷氧基乙醇

在一些实施方案中，泊洛沙姆选自泊洛沙姆124(

在一些实施方案中，聚氧乙二醇烷基醚选自八乙二醇单十二烷基醚、五乙二醇单十二烷基醚、

在一些情况下，聚氧乙二醇辛基酚醚选自聚氧化乙烯(4-5)对叔辛基酚(

在一些实施方案中，苯氧基聚乙氧基乙醇选自壬基苯氧基聚乙氧基乙醇和/或辛基苯氧基聚乙氧基乙醇。

在一些实施方案中，糖苷烷基醚是辛基吡喃葡萄糖苷。在一些实施方案中，麦芽糖苷烷基醚是十二烷基吡喃麦芽糖苷。在一些实施方案中，硫代葡萄糖苷烷基醚是庚基硫代吡喃葡萄糖苷。在一些实施方案中，丙三醇烷基酯是月桂酸甘油酯。在一些实施方案中，椰油酰胺乙醇胺选自椰油酰胺单乙醇胺和/或椰油酰胺二乙醇胺。

在一些实施方案中，表面活性剂的最终浓度为约0.1％(v/v)至约10.0％(v/v)或约0.5％(v/v)至约5.0％(v/v)。在一些情况下，表面活性剂是多种表面活性剂。

可用于病毒灭活的方法描述于例如美国专利第6,190,609号和第9,315,560号以及美国申请公布第2017/0327559号，所述文献的公开内容以引用的方式整体并入本文中。

可以如本领域的技术人员所公认的，进行病毒的灭活。举例来说，溶剂磷酸三(正丁基)酯(TNBP)和洗涤剂，例如但不限于聚山梨醇酯80和triton X-100有效灭活脂质包膜病毒。病毒灭活可以在例如14℃至约25℃的室温下进行约1小时或更长时间。在一些情况下，孵育时间不超过两个小时。

在一些实施方案中，通过将包含柠檬酸钠缓冲液的缓冲液加入至病毒灭活物质中来中止病毒灭活处理。在一些情况下，柠檬酸钠缓冲液包含约40mM至约100mM柠檬酸钠缓冲液，例如约40mM、约50mM、约60mM、约70mM、约80mM、约90mM或约100mM柠檬酸钠缓冲液。

H.

弗林蛋白酶是称为SPC(枯草杆菌蛋白酶样前蛋白转化酶)、PC(前蛋白转化酶)或在一些情况下PACE(成对碱性氨基酸裂解酶)的蛋白质家族的一部分。弗林蛋白酶蛋白质家族的成员包括但不限于弗林蛋白酶、Kex2、PC2、PC1/PC3、PACE4、PC4、PC5和/或PC7。作为本发明的一部分，方法提供了通过用弗林蛋白酶处理使前VWF(前rVWF)成熟成mat-VWF/VWF-PP(mat-rVWFr/VWF-PP)复合物的方法。在VWF成熟方法中可以采用这些弗林蛋白酶家族成员中的任一种。

在一些实施方案中，前VWF是在阴离子交换柱或树脂上、阳离子交换柱或树脂上或作为尺寸分离色谱法的一部分成熟的弗林蛋白酶。在一些实施方案中，前VWF是在阴离子交换柱或树脂上和/或作为阴离子交换色谱法的一部分成熟的弗林蛋白酶。在一些实施方案中，前VWF是在阳离子交换柱或树脂上和/或作为阳离子交换色谱程序的一部分成熟的弗林蛋白酶。在一些实施方案中，前VWF是作为尺寸排阻色谱法程序的一部分成熟的弗林蛋白酶。此类方法已经描述于例如美国专利第8,058,411号中，所述专利以引用的方式整体并入本文中以达成所有目的。

为了促进成熟过程和提供升高浓度的固定在树脂上的前VWF，在本发明的一些实施方案中，色谱树脂被填充在色谱柱中。因为在体外成熟的过程中前VWF的浓度影响成熟效率，所以宜将色谱树脂填充在柱中。此外，色谱柱的使用允许以更可重现的方式有效控制成熟参数并且使VWF在体外成熟更简单。在一些实施方案中，弗林蛋白酶浓度为每IU VWF:Ag(10μg前rVWF)约1、约2、约3或约4单位的重组活性弗林蛋白酶。在一些实施方案中，弗林蛋白酶浓度为每IU VWF:Ag(10μg前rVWF)约2-3单位的重组活性弗林蛋白酶。在一些实施方案中，弗林蛋白酶浓度为每IU VWF:Ag(10μg前rVWF)约1-2单位的重组活性弗林蛋白酶。在一些实施方案中，弗林蛋白酶浓度为每IU VWF:Ag(10μg前rVWF)约2单位的重组活性弗林蛋白酶。

在一些实施方案中，当前VWF固定在阴离子交换树脂上并且与展现前VWF转化酶活性的溶液一起孵育时，在25℃下测量的电导率低于25mS/cm。在一些实施方案中，当前VWF固定在阴离子交换树脂上并且与展现前VWF转化酶活性的溶液一起孵育时，在25℃下测量的电导率低于20mS/cm。在一些实施方案中，当前VWF固定在阴离子交换树脂上并且与展现前VWF转化酶活性的溶液一起孵育时，在25℃下测量的电导率低于16mS/cm。在一些实施方案中，当前VWF固定在阴离子交换树脂上并且与展现前VWF转化酶活性的溶液一起孵育时，在25℃下测量的电导率介于16mS/cm与25mS/cm之间。在一些实施方案中，当前VWF固定在阴离子交换树脂上并且与展现前VWF转化酶活性的溶液一起孵育时，在25℃下测量的电导率介于20mS/cm与25mS/cm之间。前rVWF以及mat-rVWF可以在这些电导率水平下有效地固定在阴离子交换树脂上。因此，在本发明的方法的过程中施加的缓冲液必须相应地进行调整以维持电导率水平。在一些实施方案中，电导率使得弗林蛋白酶和/或PACE酶呈活性形式并且全部或部分处于流动相中。

在一些实施方案中，mat-rVWF以在25℃下测量时至少40mS/cm的电导率从阴离子交换树脂洗脱。在一些实施方案中，mat-rVWF以在25℃下测量时至少60mS/cm的电导率从阴离子交换树脂洗脱。在一些实施方案中，mat-rVWF以在25℃下测量时至少80mS/cm的电导率从阴离子交换树脂洗脱。在一些实施方案中，mat-rVWF以在25℃下测量时介于40mS/cm与80mS/cm之间的电导率从阴离子交换树脂洗脱。在一些实施方案中，mat-rVWF以在25℃下测量时介于60mS/cm与80mS/cm之间的电导率从阴离子交换树脂洗脱。在一些实施方案中，所需rVWF物质在介于约12至16mS/cm/25℃之间的电导率下从阴离子交换树脂(例如从TMAE)开始洗脱。在一些实施方案中，主要量(大量)的rVWF所需物质介于约55至60mS/cm/25℃之间从阴离子交换树脂洗脱。在一些实施方案中，所需rVWF物质在介于约18至24mS/cm/25℃之间的电导率下用阴离子交换树脂开始洗脱。在一些实施方案中，主要量(大量)的rVWF所需物质介于约36至42mS/cm/25℃之间用阳离子交换树脂洗脱。在一些实施方案中，所需rVWF是成熟rVWF(例如mat-rVWF)。在一些实施方案中，主要量(大量)包括洗脱的所需物质的总量的至少约30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多。

在一些实施方案中，采用在mat-rVWF从阴离子交换树脂洗脱之前的进一步洗涤步骤。在一些实施方案中，采用在mat-rVWF从阳离子交换树脂洗脱之前的进一步洗涤步骤。

许多蛋白酶出于其蛋白质分解活性而需要如二价金属离子的辅因子。弗林蛋白酶和弗林蛋白酶蛋白质家族成员出于活性而需要钙离子。因此，如果使用弗林蛋白酶使前rVWF在体外成熟，那么采用钙盐。在一些实施方案中，钙盐是可溶性钙盐。在一些实施方案中，钙盐是氯化钙(CaCl

弗林蛋白酶与固定的前rVWF的孵育时间可取决于使用的系统而变化。如温度、缓冲液等因素也影响成熟过程的效率。一般地，成熟过程在少于48小时内结束。在一些实施方案中，成熟过程可以在少于1分钟内发生。在一些实施方案中，成熟过程可以在少于40小时、36小时、30小时、24小时、20小时、16小时、10小时、5小时、2小时、1小时或更少时间内发生。在一些实施方案中，用于前rVWF成熟的孵育进行少于1分钟至48小时。在一些实施方案中，用于前rVWF成熟的孵育进行10分钟至42小时。在一些实施方案中，用于前rVWF成熟的孵育进行20分钟至36小时。在一些实施方案中，用于前rVWF成熟的孵育进行30分钟至24小时。在一些实施方案中，由于弗林蛋白酶具有高特异性，所以即使在长孵育时间之后也不会发生VWF的“过度活化”(进一步蛋白水解降解)。

在一些实施方案中，成熟过程也取决于在孵育的过程中挑选的温度。弗林蛋白酶的最佳酶活性随温度而变。

在一些实施方案中，用于前rVWF成熟的孵育在2℃至40℃的温度下进行。在一些实施方案中，用于前rVWF成熟的孵育在4℃至37℃的温度下进行。在一些实施方案中，用于前rVWF成熟的孵育在例如2℃的低温下进行。在一些实施方案中，所采用的最大温度低于50℃，以避免和/或防止蛋白质降解。在一些实施方案中，所采用的最大温度低于45℃，以避免和/或防止蛋白质降解。

在一些实施方案中，前VWF(或前rVWF)通过用弗林蛋白酶或如上所述的弗林蛋白酶家族成员处理而转化成mat-VWF(或mat-rVWF)。在一些实施方案中，弗林蛋白酶处理引起前rVWF的至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％转化成mat-rVWF和rVWF-PP。在一些实施方案中，在尺寸分离之后，在加入至少一种螯合剂和/或将pH值增加到至少7的pH值存在下，洗脱物中存在少于5％rVWF-PP、少于4％rVWF-PP、少于3％rVWF-PP、少于2％rVWF-PP、少于1％rVWF-PP、少于0.5％rVWF-PP、少于0.4％rVWF-PP、少于0.1％rVWF或少于0.05％rVWF-PP。

表2：例示性前VWF除去(基于弗林蛋白酶处理)

I.

rVWF多聚体的数目和百分比的评定可以使用本领域中已知的方法进行，包括但不限于使用电泳和尺寸排阻色谱法按尺寸分离VWF多聚体的方法，例如如Cumming等人(JClin Pathol.,1993年5月；46(5):470-473，出于所有目的并且尤其关于有关VWF多聚体评定的所有传授内容，以引用的方式整体并入本文中)所论述。此类技术还可以包括免疫印迹技术(例如蛋白质印迹法)，其中凝胶用针对VWF的放射性同位素标记抗体进行免疫印迹，接着进行化学发光检测(参见例如Wen等人,J.Clin.Lab.Anal.,1993,7:317-323，出于所有目的并且尤其关于有关VWF多聚体评定的所有传授内容，以引用的方式整体并入本文中)。进一步的对VWF的测定包括VWF:抗原(VWF:Ag)、VWF:瑞斯托霉素辅因子(VWF:RCof)和VWF:胶原蛋白结合活性测定(VWF:CBA)，这些常常用于冯·维勒布兰德病的诊断和分类(参见例如Favaloro等人,Pathology,1997,29(4):341-456；Sadler,JE,Annu Rev Biochem,1998,67:395-424；以及Turecek等人,Semin Thromb Hemost,2010,36:510-521，出于所有目的并且尤其关于有关VWF测定的所有传授内容，以引用的方式整体并入本文中)。在一些实施方案中，使用本发明的方法获得的mat-rVWF包括存在于rVWF的上样样品上的任何多聚体类型。在一些实施方案中，使用本发明的方法获得的mat-rVWF包括生理学上存在的多聚体类型以及超大的VWF多聚体类型。

J.

在初期止血中，VWF充当血小板与例如胶原蛋白的细胞外基质的特定组分之间的桥梁。这个过程中的VWF的生物活性可以通过不同的体外测定来测量(Turecek等人,SeminThromb Hemost,2010,36:510-521)。

VWF:瑞斯托霉素辅因子(VWF:RCof)测定是基于在VWF存在下抗生素瑞斯托霉素诱导的新鲜或福尔马林固定的血小板的凝集。血小板凝集程度取决于VWF浓度并且可以通过浊度测定法，例如通过使用血小板凝集计测量(Weiss等人,J.Clin.Invest.,1973,52:2708-2716；Macfarlane等人,Thromb.Diath.Haemorrh.,1975,34:306-308)。如本文所提供，本发明的VWF的比瑞斯托霉素辅因子活性(VWF:RCo)一般以mU/μg VWF描述，如使用体外测定所测量。

在一些实施方案中，根据本发明方法纯化的mat-rVWF的比活性为至少约20、22.5、25、27,5、30、32.5、35、37.5、40、42.5、45、47.5、50、52.5、55、57.5、60、62.5、65、67.5、70、72.5、75、77.5、80、82.5、85、87.5、90、92.5、95、97.5、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150或更多mU/μg。在一些实施方案中，本文所述的方法中所用的mat-rVWF具有20mU/μg至150mU/μg的比活性。在一些实施方案中，mat-rVWF具有30mU/μg至120mU/μg的比活性。在一些实施方案中，mat-rVWF具有40mU/μg至90mU/μg的比活性。在一些实施方案中，mat-rVWF具有选自见于下表3的变体1至133的比活性。

表3.见于本文提供的组合物且用于本文提供的方法中的rVWF的比活性的示例性实施方案。

Var.＝变体

本发明的mat-rVWF是高度多聚的，包含约10至约40个亚基。在其它实施方案中，使用本发明方法产生的多聚体rVWF包含约10-30个、12-28个、14-26个、16-24个、18-22个、20-21个亚基。在一些实施方案中，rVWF呈尺寸在二聚体至超过40个亚基的多聚体(>一千万道尔顿)的多聚体存在。最大多聚体提供多个结合位点，这些结合位点可以与血小板受体和损伤的内皮下基质位点相互作用，并且是VWF的最具止血活性形式。在一些实施方案中，本发明的mat-rVWF包含超大多聚体(ULM)。一般地，高的和超大多聚体被认为是在止血上最有效的(参见例如Turecek,P.,

在一些实施方案中，通过本文所述的纯化法制备的mat-rVWF组合物具有特征在于95％的低聚物具有6个亚基与20个亚基之间的rVWF低聚物分布。在一些实施方案中，mat-rVWF组合物具有特征在于95％的低聚物具有选自见于4中的变体458至641的亚基范围的rVWF低聚物分布。

表4.见于本文提供的组合物中且用于本文提供的方法中的rVWF低聚物的分布的示例性实施方案。

Var.＝变体

在一些实施方案中，通过本文提供的方法制备的mat-rVWF组合物可以根据在具体的高级mat-rVWF多聚体或更大多聚体中存在的mat-rVWF分子的百分比表征。举例来说，在一个实施方案中，本文所述的方法中使用的mat-rVWF组合物中至少20％的mat-rVWF分子呈具有至少10个亚基的低聚复合物存在。在另一个实施方案中，本文所述的方法中使用的mat-rVWF组合物中至少20％的mat-rVWF分子呈具有至少12个亚基的低聚复合物存在。在其它实施方案中，本文提供的方法中使用的mat-rVWF组合物具有最低百分比(例如具有至少X％)的根据见于表5至表7的变体134至457中的任一个的呈具体的高级mat-rVWF多聚体或更大多聚体(例如具有至少Y个亚基的多聚体)存在的mat-rVWF分子。

表5.见于本文提供的组合物中且用于本文提供的方法中的呈具体的高级mat-rVWF多聚体或更大多聚体存在的mat-rVWF分子的百分比的示例性实施方案。

Var.＝变体

表6.见于本文提供的组合物中且用于本文提供的方法中的呈具体的高级mat-rVWF多聚体或更大多聚体存在的mat-rVWF分子的百分比的示例性实施方案。

Var.＝变体

表7.见于本文提供的组合物中且用于本文提供的方法中的呈具体的高级mat-rVWF多聚体或更大多聚体存在的mat-rVWF分子的百分比的示例性实施方案。

Var.＝变体

根据上述，mat-rVWF包含相当多百分比的高分子量(HMW)mat-rVWF多聚体。在其它实施方案中，HMW rVWF多聚体组合物包含至少10％-80％mat-rVWF十聚体或高级多聚体。在其它实施方案中，组合物包含10-95％、20-90％、30-85％、40-80％、50-75％、60-70％十聚体或高级多聚体。在其它实施方案中，HMW mat-rVWF多聚体组合物包含至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％十聚体或高级多聚体。

mat-rVWF多聚体的数目和百分比的评定可以使用本领域中已知的方法进行，包括但不限于使用电泳和尺寸排阻色谱法按尺寸分离mat-rVWF多聚体的方法，例如如Cumming等人(J Clin Pathol.,1993年5月；46(5):470-473，出于所有目的并且尤其关于有关mat-rVWF多聚体评定的所有传授内容，以引用的方式整体并入本文中)所论述。此类技术还可以包括免疫印迹技术(例如蛋白质印迹法)，其中凝胶用针对VWF的放射性同位素标记抗体进行免疫印迹，接着进行化学发光检测(参见例如Wen等人,(1993),J.Clin.Lab.Anal.,7:317-323，出于所有目的并且尤其关于有关mat-rVWF多聚体评定的所有传授内容，以引用的方式整体并入本文中)。进一步的对VWF的测定包括VWF:抗原(VWF:Ag)、VWF:瑞斯托霉素辅因子(VWF:RCof)和VWF:胶原蛋白结合活性测定(VWF:CBA)，这些常常用于冯·维勒布兰德病的诊断和分类。(参见例如Favaloro等人,Pathology,1997,29(4):341-456，出于所有目的并且尤其关于有关VWF测定的所有传授内容，以引用的方式整体并入本文中)。

在一些实施方案中，根据本发明方法制备的mat-rVWF的rFVIII促凝血活性(IUrFVIII:C)与rVWF瑞斯托霉素辅因子活性(IU rVWF:RCo)的比率介于3:1与1:5之间。在其它实施方案中，比率介于2:1与1:4之间。在其它实施方案中，比率介于5:2与1:4之间。在其它实施方案中，比率介于3:2与1:3之间。在其它实施方案中，比率为约1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、2:1、2:3、2:4、2:5、3:1、3:2、3:4或3:5。在其它实施方案中，比率介于1:1与1:2之间。在其它实施方案中，比率为1.1:1、1.2:1、1.3:1、1.4:1、1.5:1、1.6:1、1.7:1、1.8:1、1.9:1或2:1。在某些实施方案中，可用于本文所述的方法的组合物中rFVIII促凝血活性(IU rFVIII:C)与rVWF瑞斯托霉素辅因子活性(IU rVWF:RCo)的比率选自见于表8的变体1988至2140。

表8.本文提供的组合物中和本文提供的方法中使用的rFVIII促凝血活性(IUrFVIII:C)与rVWF瑞斯托霉素辅因子活性(IU rVWF:RCo)的比率的示例性实施方案。

Var.＝变体

在其它实施方案中，本发明的高级mat-rVWF多聚体在施用后稳定长达约1小时至约90小时。在其它实施方案中，高级mat-rVWF多聚体在施用后稳定长达约5-80、10-70、15-60、20-50、25-40、30-35小时。在其它实施方案中，高级mat-rVWF多聚体在施用后稳定长达至少3、6、12、18、24、36、48、72小时。在某些实施方案中，在体外评定mat-rVWF多聚体的稳定性。

在一个实施方案中，本文提供的组合物和方法中使用的高级mat-rVWF多聚体在施用后具有至少12小时的半衰期。在另一个实施方案中，高级mat-rVWF多聚体在施用后具有至少24小时的半衰期。在其它实施方案中，高级mat-rVWF多聚体具有选自见于表9的变体642至1045的半衰期。

表9.见于通过本文提供的方法制备的组合物中的高级mat-rVWF多聚体的半衰期的示例性实施方案。

Var.＝变体

在一些实施方案中，根据本发明纯化的前VWF和/或纯化mat-rVWF不用任何缀合、翻译后或共价修饰来修饰。在具体的实施方案中，本发明的前VWF和/或纯化的mat-rVWF不用水溶性聚合物修饰，所述水溶性聚合物包括但不限于聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇、聚氧化烯、聚唾液酸、羟基乙基淀粉、聚碳水化合物部分等。

在一些实施方案中，根据本发明纯化的前VWF和/或纯化的mat-rVWF通过缀合、翻译后修饰或共价修饰来修饰，所述修饰包括N端或C端残基的修饰以及所选侧链、例如在游离巯基、伯胺和羟基处的修饰。在一个实施方案中，水溶性聚合物通过赖氨酸基团或其它伯胺连接于蛋白质(直接或通过接头)。在一些实施方案中，本发明的前VWF和/或纯化的mat-rVWF可以通过缀合水溶性聚合物修饰，所述水溶性聚合物包括但不限于聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇、聚氧化烯、聚唾液酸、羟基乙基淀粉、聚碳水化合物部分等。

可以用于修饰前VWF和/或纯化的mat-rVWF的水溶性聚合物包括线性和分支链结构。缀合聚合物可以直接连接至本发明的凝血蛋白，或可替代地，可以通过连接部分连接。蛋白质与水溶性聚合物缀合的非限制性实例可见于美国专利第4,640,835号；第4,496,689号；第4,301,144号；第4,670,417号；第4,791,192号和第4,179,337号；以及Abuchowski和Davis“Enzymes as Drugs,”Holcenberg和Roberts编辑,第367 383页,John Wiley andSons,New York(1981)；以及Hermanson G.,Bioconjugate Techniques第2版,AcademicPress公司,2008。

蛋白质缀合可以通过本领域中的许多众所周知的技术进行，例如参见HermansonG.,Bioconjugate Techniques第二版,Academic Press公司,2008。实例包括通过凝血蛋白或水溶性聚合物部分中的一者上的羧基与另一者上的胺基之间的肽键或者一者的羧基与另一者的羟基之间的酯连键的连键。本发明的凝血蛋白缀合于水溶性聚合物化合物可以通过的另一连键是通过席夫碱(Schiff base)，在聚合物部分上的自由氨基与在聚合物的非还原末端通过高碘酸盐氧化形成的醛基之间反应(Jennings和Lugowski,J.Immunol.1981；127:1011-8；Femandes和Gregonradis,Biochim Biophys Acta.1997；1341；26-34)。所产生的席夫碱可以通过用NaCNBH

另一种测量VWF的生物活性的方法是胶原蛋白结合测定，所述测定是基于ELISA技术(Brown和Bosak,Thromb.Res.,1986,43:303-311；Favaloro,Thromb.Haemost.,2000,83127-135)。微量滴定盘用I或III型胶原蛋白来包被。然后，VWF结合于胶原蛋白表面，随后用酶标记的多克隆抗体检测。最后一步是底物反应，所述反应可以用ELISA读数器在光度测定上监测。

冯·维勒布兰德因子(VWF:Ag)的免疫学测定是测量血浆中的VWF蛋白的浓度的免疫测定。它们不给出关于VWF功能的指示。存在许多用于测量VWF:Ag的方法，并且这些方法包括酶联免疫吸附测定(ELISA)或自动化乳胶免疫测定(LIA)。现在许多实验室使用完全自动化乳胶免疫测定。历史上实验室使用包括Laurell电泳免疫测定“Laurell Rockets”在内的多种技术，但现在的大部分实验室很少使用这些技术。

K.

本发明的方法还提供了从通过本文提供的纯化方法获得的VWF制备制剂。在一些实施方案中，高纯度的mat-rVWF组合物用于产生药物组合物。在一些实施方案中，mat-rVWF可以配制成冻干制剂。

在一些实施方案中，包含本发明的VWF多肽的制剂在纯化之后且在施用于受试者之前冻干。冻干是使用本领域中常用的技术进行并且应针对所研发的组合物优化(Tang等人,Pharm Res.21:191-200,(2004)和Chang等人,Pharm Res.13:243-9(1996))。

在一方面，冻干循环是由三个步骤构成：冷冻、初级干燥和二级干燥(A.P.Mackenzie,Phil Trans R Soc London,Ser B,Biol 278:167(1977))。在冷冻步骤中，使溶液冷却以引发结冰。此外，这个步骤诱导填充剂的结晶。冰在初级干燥阶段升华，这是通过将腔室压力降低至低于冰的蒸气压、使用真空和引入热以促进升华来进行。最终，在二级干燥阶段在降低的腔室压力下和在升高的搁板温度下除去。所述过程产生被称为冻干饼的物质。此后，饼可以用无菌水或者合适的注射用稀释剂复原。

冻干循环不仅决定赋形剂的最终物理状态，而且影响其它参数，例如复原时间、外观、稳定性和最终水分含量。冷冻状态的组合物结构经过在特定温度下进行的数个转变(例如玻璃化转变、润湿和结晶)继续，并且所述结构可以用于理解和优化冻干过程。玻璃化转变温度(Tg和/或Tg')可以提供有关溶质物理状态的信息并且可以由差示扫描量热法(differential scanning calorimetry，DSC)测定。Tg和Tg'是在设计冻干循环时必须考虑的重要参数。举例来说，Tg'对于初级干燥来说是重要的。此外，在干燥状态下，玻璃化转变温度提供有关最终产物的存储温度的消息。

i.

赋形剂是赋予或增强药品(例如蛋白质)的稳定性和递送的添加剂。不管赋形剂的纳入理由如何，赋形剂都是制剂不可缺少的组分，因此必须安全并且为患者良好耐受。对于蛋白质药物，赋形剂的选择尤其重要，因为它们会影响药物的功效和免疫原性。因此，需要在适当选择提供合适的稳定性、安全性和市场性的赋形剂下研发蛋白质制剂。

在一方面，冻干制剂至少由缓冲剂、填充剂和稳定剂中的一种或多种构成。在这方面，如果冻干步骤期间或在复原期间的聚集变成一个问题，那么评估表面活性剂的效用并且进行选择。包括适当的缓冲剂以在冻干期间维持制剂在pH值的稳定区内。预期用于液体和冻干蛋白质制剂的赋形剂组分的比较提供于表10中。

表10：冻干蛋白质制剂的赋形剂组分

在研发蛋白质制剂中的主要挑战是使产物面对制造、货运和存储的应力稳定。制剂赋形剂的作用是提供稳定以防这些应力破坏。赋形剂还用以降低高浓度蛋白质制剂的粘度以实现制剂的递送并且更方便患者。一般说来，赋形剂可以根据它们稳定蛋白质以防各种化学和物理应力破坏的机制而分类。一些赋形剂用于减轻特定应力的作用或调节特定蛋白质的具体敏感性。其它赋形剂对蛋白质的物理和共价稳定性具有更一般的作用。本文所述的赋形剂通过其化学类型或者其在制剂中的功能作用来组织。当论述各赋形剂类型时，提供稳定模式的简要描述。

考虑到本文提供的传授内容和指导，本领域的技术人员已知在任何具体的制剂中可以包括什么量或范围的赋形剂来实现促进保持生物药物(例如蛋白质)的稳定性的本发明的生物药物制剂。举例来说，基于最终溶液的所需渗透压度(例如等张、低渗或高张性)以及有待包括在制剂中的其它组分的量和渗透压度，选择有待包括在本发明的生物药物制剂中的盐的量和类型。

举例来说，包括约5％山梨糖醇可以实现等张性，而实现等张性需要约9％的蔗糖赋形剂。在上文，通过提及盐、多元醇和糖，已经例示了可以包括在本发明的生物药物制剂内的一种或多种赋形剂的量或浓度范围的选择。然而，本领域的技术人员将理解本文所述和通过提及特定赋形剂进一步例示的因素同等适用于赋形剂的所有类型和组合，包括例如盐、氨基酸、其它张度剂、表面活性剂、稳定剂、填充剂、低温保护剂、冻干保护剂、抗氧化剂、金属离子、螯合剂和/或防腐剂。

此外，在具体赋形剂以摩尔浓度报告的情况下，本领域的技术人员将认识到还涵盖溶液的当量百分比(％)w/v(例如(溶液样品中物质的克数/溶液的毫升数)X 100％)。

当然，本领域的一般技术人员将认识到本文所述的赋形剂的浓度在具体制剂内互相依赖。举例来说，倘若例如存在高蛋白质浓度或倘若例如存在高稳定剂浓度，则可以降低填充剂的浓度。另外，本领域的一般技术人员将认识到，为了维持不存在填充剂的具体制剂的等张性，将相应地调整稳定剂的浓度(例如将使用“张度调节”量的稳定剂)。本领域中已知常用的赋形剂并且可见于Powell等人,Compendium of Excipients fir ParenteralFormulations(1998),PDA J.Pharm.Sci.Technology,52:238-311。

ii.

通常观察到药理学活性蛋白质制剂的稳定性在狭窄的pH值范围内最大。最佳稳定性的这个pH值范围需要在配制前研究期间及早鉴定。在这项工作中数种方法是可用的，例如加速稳定性研究和量热筛选研究(Remmele R.L.Jr.等人,Biochemistry,38(16):5241-7(1999))。一旦制剂最终确定，蛋白质必须在整个保质期内进行制造和维持。因此，缓冲剂几乎一直用以控制制剂的pH值。

缓冲物质的缓冲能力在等于pKa的pH值下是最大的，并且随着pH值远离这个值增加或减少而降低。90％的缓冲能力存在于pKa的一个pH单位内。缓冲能力还随着缓冲剂浓度的增加而按比例增加。

当选择缓冲剂时，需要考虑数个因素。首先，缓冲物质和其浓度需要基于其pKa和所需制剂pH值而界定。同样重要的是确保缓冲剂与蛋白质和其它制剂赋形剂相容，并且不催化任何降解反应。要考虑的第三重要方面是感知在施用后缓冲剂可能诱发的刺痛和刺激。举例来说，已知柠檬酸盐在注射后引起刺痛(Laursen T等人,Basic Clin PharmacolToxicol.,98(2):218-21(2006))。通过皮下(SC)或肌肉内(IM)途径施用的药物的刺痛和刺激的可能性更大，其中与通过制剂在施用后迅速在血液中稀释的IV途径施用时相比，药物溶液留在所述部位处的时段相对较长。对于通过直接IV输注施用的制剂，需要监测缓冲剂(和任何其它制剂组分)的总量。必须尤其留意呈磷酸钾缓冲液形式施用的钾离子，其可能在患者中诱发心血管作用(Hollander-Rodriguez JC等人,Am.Fam.Physician.,73(2):283-90(2006))。

用于冻干制剂的缓冲剂需要额外考虑。如磷酸钠的一些缓冲剂可能在冷冻期间从蛋白质非晶相中结晶出来，引起pH值变化。例如乙酸盐和咪唑的其它常用缓冲剂可能在冻干过程期间升华或蒸发，由此改变冻干期间或复原之后的制剂pH值。

选择组合物中存在的缓冲液体系，使其在生理学上是相容的并且维持药物制剂的所需pH值。在一个实施方案中，溶液的pH值介于pH 2.0与pH 12.0之间。举例来说，溶液的pH值可以是2.0、2.3、2.5、2.7、3.0、3.3、3.5、3.7、4.0、4.3、4.5、4.7、5.0、5.3、5.5、5.7、6.0、6.3、6.5、6.7、7.0、7.3、7.5、7.7、8.0、8.3、8.5、8.7、9.0、9.3、9.5、9.7、10.0、10.3、10.5、10.7、11.0、11.3、11.5、11.7或12.0。

pH缓冲化合物可以呈适于维持制剂pH值在预定水平下的任何量存在。在一个实施方案中，pH缓冲浓度介于0.1mM与500mM(1M)之间。举例来说，预期pH缓冲剂为至少0.1、0.5、0.7、0.8 0.9、1.0、1.2、1.5、1.7、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、200或500mM。

用于缓冲如本文所述的制剂的示例性pH缓冲剂包括(但不限于)有机酸、甘氨酸、组氨酸、谷氨酸盐、琥珀酸盐、磷酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、Tris、HEPES和氨基酸或氨基酸的混合物，包括(但不限于)天冬氨酸、组氨酸和甘氨酸。在本发明的一个实施方案中，缓冲剂是柠檬酸盐。

在一些实施方案中，制剂包含50mM甘氨酸、10mM牛磺酸、5％(w/w)蔗糖、5％(w/w)D-甘露糖醇、0.1％聚山梨醇酯80、2mM CaCl

iii.

在本发明药物制剂的一方面，加入稳定剂(或稳定剂组合)以防止或减少存储诱发的聚集和化学降解。复原之后的混浊或浑浊溶液表明蛋白质已经沉淀或至少聚集。术语“稳定剂”意指能够预防聚集或物理降解，包括在水性状态下化学降解(例如、自溶、脱酰胺基、氧化等等)的赋形剂。涵盖的稳定剂包括(但不限于)蔗糖、海藻糖、甘露糖、麦芽糖、乳糖、葡萄糖、棉子糖、纤维二糖、龙胆二糖、异麦芽糖、阿拉伯糖、葡糖胺、果糖、甘露糖醇、山梨糖醇、甘氨酸、精氨酸HCL、多羟基化合物，包括多糖，例如葡聚糖、淀粉、羟乙基淀粉、环糊精、N-甲基吡咯烷、纤维素和透明质酸、氯化钠(Carpenter等人,Develop.Biol.Standard 74:225,(1991))。在本发明的制剂中，掺入的稳定剂浓度为约0.1、0.5、0.7、0.8 0.9、1.0、1.2、1.5、1.7、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、500、700、900或1000mM。在本发明的一个实施方案中，甘露糖醇和海藻糖用作稳定剂。

如需要，制剂还包括适当量的填充和渗透压度调节剂。填充剂包括例如但不限于甘露糖醇、甘氨酸、蔗糖、聚合物如葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮、羧甲基纤维素、乳糖、山梨糖醇、海藻糖或木糖醇。在一个实施方案中，填充剂是甘露糖醇。掺入的填充剂浓度为约0.1、0.5、0.7、0.8 0.9、1.0、1.2、1.5、1.7、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、500、700、900或1000mM。

iv.

蛋白质高度倾向于与表面相互作用，使得它们在空气-液体、小瓶-液体以及液体-液体(硅油)界面处易于吸附和变性。已经观察到这种降解途径反向依赖于蛋白质浓度，并且导致形成可溶性的和不溶性的蛋白质聚集体或者蛋白质通过吸附至表面而从溶液中损失。除容器表面吸附外，在物理搅动下表面诱发的降解加重，如产品将在货运和处理期间所经历的那样。

在蛋白质制剂中通常使用表面活性剂来抑制表面诱发的降解。表面活性剂是两亲性分子，能够战胜蛋白质得到界面位置。表面活性剂分子的疏水性部分占据界面位置(例如空气/液体)，而分子的亲水性部分保持面向本体溶剂(bulk solvent)。在足够的浓度(典型地大约洗涤剂的临界胶束浓度)下，表面活性剂分子的表面层用来防止蛋白质分子吸附在界面处。因此，使表面诱发的降解减到最少。本文中涵盖的表面活性剂包括但不限于脱水山梨糖醇聚乙氧基化脂肪酸酯，即聚山梨酸酯20和聚山梨酸酯80。两者不同之处仅在于赋予分子疏水特性的脂肪链的长度，分别是C-12和C-18。因此，聚山梨酸酯-80更具表面活性，并且具有比聚山梨酸酯-20更低的临界胶束浓度。

洗涤剂也会影响蛋白质的热力学构象稳定性。再次，给定洗涤剂赋形剂的影响将是蛋白质特异性的。例如，聚山梨酸酯已经显示出可降低一些蛋白质的稳定性并且提高其它蛋白质的稳定性。蛋白质的洗涤剂去稳定作用能够根据洗涤剂分子的疏水性尾部来合理地说明，所述洗涤剂分子的疏水性尾部能够参与与部分或全部展开的蛋白质状态的特异性结合。这些类型的相互作用能够引起构象平衡朝向更膨胀的蛋白质状态变化(例如增加互补的蛋白质分子中的疏水性部分暴露于结合的聚山梨酸酯)。可替代地，如果蛋白质天然状态展现一些疏水性表面，那么洗涤剂与天然状态的结合可以稳定所述构象。

聚山梨酸酯的另一个方面是它们天性容易氧化降解。通常，作为原材料，它们含有足量的过氧化物以引起蛋白质残基侧链、尤其是甲硫氨酸的氧化。由加入稳定剂引起的氧化损害的可能性强调了这样一点：应该在制剂中使用最低有效浓度的赋形剂。对于表面活性剂，用于给定蛋白质的有效浓度将取决于稳定机制。

还可以加入适量的表面活性剂来抑制在冷冻和干燥期间与表面相关的聚集现象(Chang,B,J.Pharm.Sci.85:1325,(1996))。因此，示例性的表面活性剂包括但不限于阴离子型、阳离子型、非离子型、两性离子型和两性表面活性剂，包括由天然存在的氨基酸衍生的表面活性剂。阴离子型表面活性剂包括但不限于十二烷基硫酸钠、磺基琥珀酸二辛钠和磺酸二辛钠、鹅脱氧胆酸、N-月桂酰基肌氨酸钠盐、十二烷基硫酸锂、1-辛烷磺酸钠盐、胆酸钠水合物、脱氧胆酸钠以及甘氨脱氧甘胆酸钠盐。阳离子型表面活性剂包括但不限于苯扎氯铵或氯化苄乙氧铵、氯化十六烷吡啶鎓一水合物以及溴化十六烷基三甲基铵。两性离子型表面活性剂包括但不限于CHAPS、CHAPSO、SB3-10和SB3-12。非离子型表面活性剂包括但不限于毛地黄皂苷、Triton X-100、Triton X-114、TWEEN-20和TWEEN-80。表面活性剂还包括但不限于聚桂醇400、聚氧40硬脂酸酯、聚氧化乙烯氢化蓖麻油10、40、50和60、单硬脂酸甘油酯、聚山梨酸酯40、60、65和80、大豆卵磷脂和其它磷脂，比如二油基磷脂酰胆碱(DOPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(DMPG)、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)以及二油基磷脂酰甘油(DOPG)；脂肪酸糖酯、甲基纤维素和羧甲基纤维素。因此进一步提供个别地或者作为混合物以不同的比率包含这些表面活性剂的组合物。在本发明的一个实施方案中，表面活性剂是TWEEN-80。在本发明的制剂中，表面活性剂掺入的浓度为约0.01至约0.5g/L。在提供的制剂中，表面活性剂浓度是0.005、0.01、0.02、0.03、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1.0g/L。

v.

常常加入盐以提高制剂的离子强度，离子强度这对于蛋白质溶解性、物理稳定性和等张性来说可能是重要的。盐可以用多种方式影响蛋白质物理稳定性。离子可以通过结合于蛋白质表面上的带电残基来稳定蛋白质的天然状态。可替代地，盐可以通过结合于沿着蛋白质主链的肽基(-CONH-)而稳定变性状态。盐还可以通过屏蔽蛋白质分子内残基之间的排斥静电相互作用而稳定蛋白质天然构象。蛋白质制剂中的盐还可以屏蔽蛋白质分子之间的会引起蛋白质聚集和不溶性的吸引静电相互作用。在提供的制剂中，盐浓度介于0.1、1、10、20、30、40、50、80、100、120、150、200、300和500mM之间。

vi.

已经发现氨基酸在蛋白质制剂中具有多种用途，作为缓冲剂、填充剂、稳定剂和抗氧化剂。因此在一方面，组氨酸和谷氨酸用以缓冲蛋白质制剂，分别在5.5-6.5和4.0-5.5的pH值范围内。组氨酸中的咪唑基的pKa＝6.0，并且谷氨酸侧链的羧基的pKa为4.3，这使得这些氨基酸适用于在它们各自的pH值范围内的缓冲。在此情况下谷氨酸是特别有用的。在市售蛋白质制剂中常发现有组氨酸，并且这种氨基酸可以代替柠檬酸盐，已知柠檬酸盐是一种一旦注射就刺痛的缓冲剂。有趣的是，还报告了当在液体和冻干品中在高浓度下使用时，就聚集而言，组氨酸具有稳定化作用(Chen B等人,Pharm Res.,20(12):1952-60(2003))。还观察到组氨酸可降低高浓度制剂的粘度。然而，在相同的研究中，作者观察到，在不锈钢容器中抗体的冻融研究期间含有组氨酸的制剂中聚集和变色增加。另一个使用组氨酸的注意事项是，在存在金属离子下其遭受光氧化(Tomita M等人,Biochemistry,8(12):5149-60(1969))。甲硫氨酸在制剂中作为抗氧化剂的使用似乎有希望；已经观察到可有效地对抗许多氧化应力(Lam XM等人,J Pharm ScL,86(11):1250-5(1997))。

在各个方面，提供包括氨基酸甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸、精氨酸和丙氨酸中的一种或多种的制剂，已经显示这些氨基酸通过优先排除机制可以稳定化蛋白质。甘氨酸也是在冻干制剂中常用的填充剂。精氨酸已经显示是抑制聚集的有效剂，并且已经在液体和冻干制剂中使用。

在提供的制剂中，氨基酸浓度介于0.1、1、10、20、30、40、50、80、100、120、150、200、300和500mM之间。在本发明的一个实施方案中，氨基酸是甘氨酸。

vii.

蛋白质残基的氧化由许多不同的来源引起。通过添加特定的抗氧化剂，氧化性蛋白质损害的预防包括在产物的整个制造工艺和存储期间对许多因素比如大气氧、温度、曝光量以及化学污染的小心控制。因此，本发明预期包括但不限于还原剂、氧/自由基清除剂或螯合剂的药用抗氧化剂的。在一方面，治疗性蛋白质制剂中的抗氧化剂是水溶性的，并且在整个产品保质期内保持活性。还原剂和氧/自由基清除剂通过除去溶液中的活性氧而发挥作用。螯合剂比如EDTA通过结合可促进自由基形成的痕量金属杂质而有效果。例如，在酸性成纤维细胞生长因子的液体制剂中使用EDTA来抑制金属离子催化的半胱氨酸残基氧化。

除各种赋形剂有效预防蛋白质氧化之外，抗氧化剂本身诱发蛋白质其它的共价或物理变化的可能性是有意义的。例如，还原剂能够引起分子内二硫连键的解离，这可能导致二硫化物重排。在存在过渡金属离子下，抗坏血酸和EDTA已经显示出在许多蛋白质和肽中可促进甲硫氨酸氧化(Akers MJ和Defelippis MR.Peptides and Proteins asParenteral Solutions.Pharmaceutical Formulation Development of Peptides andProteins.Sven Frokjaer,Lars Hovgaard编辑.Pharmaceutical Science.Taylor和Francis,UK(1999))；Fransson J.R.,/.Pharm.Sci.86(9):4046-1050(1997)；Yin J等人,Pharm Res.,21(12):2377-83(2004))。已经报告硫代硫酸钠降低rhuMab HER2中光和温度诱发的甲硫氨酸氧化水平；然而，所述研究中也报告了硫代硫酸盐-蛋白质加合物的形成(Lam XM,Yang JY等人,J Pharm Sci.86(11):1250-5(1997))。根据蛋白质的特定应力和灵敏度选择适当的抗氧化剂。在某些方面，涵盖的抗氧化剂包括但不限于还原剂和氧/自由基清除剂、EDTA和硫代硫酸钠。

viii.

一般来讲，在蛋白质制剂中，过渡金属离子是不希望有的，因为它们可能催化蛋白质中的物理和化学降解反应。然而，当作为蛋白质和形成配位络合物(例如胰岛素的锌悬浮液)的蛋白质悬浮液制剂中的辅因子时，制剂中包括特定的金属离子。最近，已经建议使用镁离子(10-120mM)来抑制天冬氨酸异构化成异天冬氨酸(WO 2004039337)。

金属离子赋予蛋白质稳定性或者提高的活性的两个实例是人脱氧核糖核酸酶(rhDNA酶、

ix.

在研发涉及从相同容器中抽取超过一次的多次使用肠胃外制剂时，防腐剂是必要的。它们的主要功能是抑制微生物生长，并且确保产品在药品的整个保质期或使用期期间无菌。通常使用的防腐剂包括但不限于苯甲醇、苯酚和间甲酚。尽管防腐剂具有悠久的使用历史，但包括防腐剂的蛋白质制剂的研发可能是挑战性的。防腐剂通常对蛋白质具有不稳定效应(聚集)，这已经变成限制它们在多剂量蛋白质制剂中使用的主要因素(Roy S等人,JPharm ScL,94(2):382-96(2005))。

迄今为止，大多数蛋白质药物一直被配制成仅供单次使用。然而，当多剂量制剂成为可能时，它们的附加优点是能够方便病人，并且提高了市场性。一个好的实例是人生长激素(hGH)，其中防腐制剂的研发已经将更方便的多次使用的注射笔型产品商业化。目前在市场上可购得至少四种这样的含有防腐hGH制剂的笔型装置。

在防腐剂型的制剂研发期间需要考虑几个方面。必须优化药品中的有效防腐剂浓度。这要求在浓度范围可在不损害蛋白质稳定性的情况下赋予抗微生物效果下测试剂型中给定的防腐剂。例如，在研发用于白细胞介素-1受体(I型)液体制剂的过程中，使用差示扫描量热法(DSC)，成功地筛选出三种防腐剂。基于在市售产品中常用浓度下对稳定性的影响，这些防腐剂分等级排序(Remmele RL Jr.等人,Pharm Res.,15(2):200-8(1998))。

含有防腐剂的液体制剂的研发比冻干制剂更具挑战性。冷冻干燥产物可以在无防腐剂下冻干，并且在使用时用含有防腐剂的稀释剂复原。这缩短了防腐剂与蛋白质接触的时间，显著地将相关的稳定性风险减到最小。在液体制剂下，防腐剂效力和稳定性必须在整个产品保质期期间维持(18-24个月)。一个重要的注意点是防腐剂效力必须在含有活性药物和所有赋形剂组分的最终制剂中证明。

一些防腐剂可能引起注射部位反应，这是当选择防腐剂时需要考虑的另一个因素。在集中于评估Norditropin中的防腐剂和缓冲剂的临床试验中，观察到，与含有间甲酚的制剂相比，在含有苯酚和苯甲醇的制剂中疼痛知觉较低(Kappelgaard A.M.,HormRes.62增刊3:98-103(2004))。有趣的是，在常用的防腐剂当中，苯甲醇具有麻醉性(Minogue SC和Sun DA.,AnesthAnalg.,100(3):683-6(2005))。在各个方面，防腐剂的使用提供超过任何副作用的益处。

x.

本发明还涵盖药物制剂的制备方法。

本发明的方法还包括以下步骤中的一个或多个：在冻干之前将如本文所述的稳定剂加入至所述混合物中，在冻干之前将选自填充剂、渗透压度调节剂和表面活性剂的至少一种剂加入至所述混合物中，每种剂如本文所述。

用于冻干物质的标准复原作法是加回一定体积的纯水或无菌注射用水(WFI)(典型地等于在冻干期间除去的体积)，不过抗菌剂的稀溶液有时用于肠胃外施用的药物生产(Chen,Drug Development and Industrial Pharmacy,18:1311-1354(1992))。因此，提供了制备复原的rVWF组合物的方法，所述方法包括将稀释剂加入至本发明的冻干rVWF组合物的步骤。

冻干物质可以复原成水溶液。多种水性载体，例如无菌注射用水、用于多剂使用的具有防腐剂的水或具有适当量的表面活性剂的水(例如含有活性化合物与适合于制造水性悬浮液的赋形剂的混合物的水性悬浮液)。在各个方面，这样的赋形剂是悬浮剂，例如但不限于羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄蓍树胶和阿拉伯树胶；分散剂或润湿剂是天然存在的磷脂，例如但不限于卵磷脂，或环氧烷与脂肪酸的缩合产物，例如但不限于聚氧化乙烯硬脂酸酯，或环氧乙烷与长链脂族醇的缩合产物，例如但不限于十七乙烯氧基十六烷醇，或环氧乙烷与由脂肪酸和己糖醇衍生的偏酯的缩合产物，比如聚氧化乙烯山梨糖醇一油酸酯，或环氧乙烷与由脂肪酸和己糖醇酸酐衍生的偏酯的缩合产物，例如但不限于聚乙烯山梨醇酐一油酸酯。在各个方面，水性悬浮液还含有一种或多种防腐剂，例如但不限于对羟基苯甲酸乙酯或对羟基苯甲酸正丙酯。

xi.

在一些实施方案中，本发明的方法提供了增强的制剂，所述制剂提供具有高效力的最终产品(高mat-rVWF浓度和增强的长期稳定性)，以减少治疗体积(100IU/ml至10000IU/ml)。在一些实施方案中，用于施用的制剂中的mat-rVWF浓度为约100IU/ml至10000IU/ml。在一些实施方案中，用于施用的制剂中的mat-rVWF浓度为约500IU/ml至10000IU/ml。在一些实施方案中，用于施用的制剂中的mat-rVWF浓度为约1000IU/ml至10000IU/ml。在一些实施方案中，用于施用的制剂中的mat-rVWF浓度为约2000IU/ml至10000IU/ml。在一些实施方案中，用于施用的制剂中的mat-rVWF浓度为约3000IU/ml至10000IU/ml。在一些实施方案中，用于施用的制剂中的mat-rVWF浓度为约4000IU/ml至10000IU/ml。在一些实施方案中，用于施用的制剂中的mat-rVWF浓度为约5000IU/ml至10000IU/ml。在一些实施方案中，用于施用的制剂中的mat-rVWF浓度为约6000IU/ml至10000IU/ml。在一些实施方案中，用于施用的制剂中的mat-rVWF浓度为约7000IU/ml至10000IU/ml。在一些实施方案中，用于施用的制剂中的mat-rVWF浓度为约8000IU/ml至10000IU/ml。在一些实施方案中，用于施用的制剂中的mat-rVWF浓度为约9000IU/ml至10000IU/ml。在一些实施方案中，mat-rVWF与重组凝血因子VIII(rFVIII)共配制。在一些实施方案中，rFVIII为全长FVIII。在一些实施方案中，rFVIII为全长并且进行化学修饰。在一些实施方案中，rFVIII包含含有FIX活化肽代替B-结构域的FVIII融合蛋白。在一些实施方案中，rFVIII是含有截短的富含糖基化的B-结构域的FVIII杂合物。在一些实施方案中，FVIII是去除B-结构域的FVIII变体。在一些实施方案中，FVIII是B-结构域去除的FVIII变体的化学修饰变体。在一些实施方案中，mat-rVWF与rFVIII共配制在冷冻干燥或灌装加工(fill finish)步骤之前进行，并且通过在体外或在“柱上”程序中混合组分(例如在纯化法期间加入FVIII)来存储。

在一些实施方案中，用于施用的制剂包含一种或多种两性离子化合物，包括例如氨基酸，如组氨酸、甘氨酸、精氨酸。在一些实施方案中，用于施用的制剂包含具有最少具有一个疏水性基团和一个亲水性基团的两性分子特征的组分，包括例如聚山梨醇酯80、辛基吡喃糖苷(octylpyranosid)、二肽和/或两性分子肽。在一些实施方案中，用于施用的制剂包含非还原糖或糖醇或二糖，包括例如山梨糖醇、甘露糖醇、蔗糖或海藻糖。在一些实施方案中，用于施用的制剂包含引起生理渗透压度的无毒的水溶性盐，包括例如氯化钠。在一些实施方案中，用于施用的制剂包含在6.0至8.0范围内的pH值。在一些实施方案中，用于施用的制剂包含约6.0、约6.5、约7、约7.5或约8.0的pH值。在一些实施方案中，用于施用的制剂包含一种或多种使rVWF稳定的二价阳离子，包括例如Ca2+、Mg2+、Zn2+、Mn2+和/或其组合。在一些实施方案中，用于施用的制剂包含约1mM至约50mM甘氨酸、约1mM至约50mM组氨酸、约零至约300mM氯化钠(例如小于300mM钠)、约0.01％至约0.05％聚山梨酸酯20(或聚山梨醇酯80)和约0.5％至约20％(w/w)蔗糖，并且pH值为约7.0并且在施用时间点时具有生理渗透性。

在一些实施方案中，用于施用的制剂可以冷冻干燥。在一些实施方案中，用于施用的制剂是稳定的，并且可以呈液态存储在约2℃至约8℃以及在约18℃至约25℃下。在一些实施方案中，用于施用的制剂是稳定的，并且可以呈液态存储在约2℃至约8℃下。在一些实施方案中，用于施用的制剂是稳定的，并且可以呈液态存储在约18℃至约25℃下。

xii.

为了将组合物施用于人或测试用动物，在一个方面，组合物包含一种或多种药学上可接受的载体。词语“药学上”或“药理学上”可接受的是指稳定的分子实体和组合物，其可以抑制蛋白质降解，比如聚集和裂解产物，并且另外当通过使用本领域众所周知的途径施用时不会产生过敏反应或者其它的不良反应，如下所述。“药学上可接受的载体”包括任何和所有临床有用的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等张剂和吸收延迟剂等，包括上述公开的那些剂。

药物制剂经口、经局部、经皮、肠胃外、通过吸入喷雾、经阴道、经直肠或者通过颅内注射施用。如本文所用的术语肠胃外包括皮下注射、静脉内注射、肌肉内注射、脑池内注射或者输液技术。同样考虑通过静脉内注射、皮内注射、肌肉内注射、乳房内注射、腹膜内注射、鞘内注射、眼球后注射、肺内注射和/或具体部位处手术植入的施用。一般来讲，组合物基本上不含热原、以及可能对接受者有害的其它杂质。

进行组合物的单次施用或者多次施用，剂量水平和模式由主治医生选择。为了预防或治疗疾病，适当的剂量取决于如上所定义的有待治疗的疾病类型、疾病的严重度和病程、药物是出于预防目的还是治疗目的而施用、先前的疗法、患者的病历和对药物的反应以及主治医师的判断。

xiii.

作为额外的方面，本发明包括药盒，所述药盒包含以便于用于施用于受试者的方式包装的一种或多种冻干组合物。在一个实施方案中，这样的药盒包括被包装在容器比如密封瓶或密封容器中的本文所述的药物制剂(例如，包含治疗性蛋白质或肽的组合物)，带有附着于容器或者包括在包装中的标签，用于描述在实施所述方法时化合物或组合物的使用。在一个实施方案中，药物制剂被包装在容器中，以使得容器中液面上空间(例如在液体制剂与容器顶部之间的空气量)非常小。优选地，液面上空间的量可以忽略不计(即，几乎没有)。在一个实施方案中，药盒含有具有治疗性蛋白质或肽组合物的第一容器，和具有用于组合物的生理学上可接受的复原溶液的第二容器。在一方面，药物制剂以单位剂型包装。药盒还可以包括适合于根据特定的施用途径施用药物制剂的装置。优选地，药盒含有描述药物制剂的使用的标签。

xiv.

与本文所述的治疗疾患的方法有关的给药方案将由主治医师，考虑改变药物作用的各种因素，例如年龄、状况、体重、性别和患者的饮食、任何感染的严重度、施用时间和其它临床因素来确定。举例来说，本发明的重组VWF的典型剂量是大约50U/kg，等于500μg/kg。

在一方面，本发明的制剂通过初始丸剂、接着连续输液以便维持药品的治疗循环水平来施用。作为另一实例，本发明化合物作为一次性剂量施用。本领域的一般技术人员将容易地优化有效的给药和施用方案，通过优良医疗实践和患者个体的临床状况来确定。给药频率取决于剂的药物动力学参数和施用途径。最佳的药物制剂将由本领域的技术人员根据施用途径和期望的剂量来确定。参见例如Remington's Pharmaceutical Sciences,第18版(1990,Mack Publishing公司,Easton,PA 18042)第1435-1712页，公开内容以引用的方式并入本文中。这类制剂影响所施用的剂的物理状态、稳定性、体内释放速率和体内清除速率。取决于施用途径，根据体重、体表面积或者器官大小计算出合适的剂量。通过使用已经建立的用于确定血液水平剂量的测定，连同适当的剂量-反应数据，可以确定适当的剂量。最终的给药方案将由主治医师，考虑改变药物作用的各种因素，例如药物比活力、损伤严重度和患者的反应、患者的年龄、状况、体重、性别和饮食、任何感染的严重度、施用时间和其它临床因素来确定。随着研究进行，关于适当剂量水平以及各种疾病和疾患的治疗持续时间的进一步信息将会浮现。

实施例

以下非限制性实施例只是出于说明的目的提供的，以便于更完整地理解代表性实施方案。

这些实施例不应解释为限制在本说明书中描述的任何实施方案，包括关于治疗获得性和遗传性冯·维勒布兰德病的方法的实施方案。

实施例1表示成熟rVWF在阳离子交换器(阳离子交换(CEX)树脂)上的纯化。rVWF前肽(rVWF-PP)在弗林蛋白酶成熟之后保持结合于rVWF，并且在上样至CEX树脂上之前在中性pH值下与作为螯合剂的柠檬酸钠解离。大部分rVWF前肽通过阳离子交换树脂。并且在洗涤步骤之后去除残留的rVWF前肽。柠檬酸钠用作缓冲物质的组分和螯合剂。

工业上，VWF、尤其重组VWF(rVWF)与rFVIII一起在基因工程化的CHO细胞系中一起合成和表达。共同表达的rVWF的功能是在细胞培养过程中使rFVIII稳定。在细胞中rVWF呈含有连接至N端的大的前肽的前rVWF形式合成。在内质网和高尔基体中成熟之后，rVWF-PP在细胞蛋白酶弗林蛋白酶的作用下裂解，并呈由表达的蛋白质的二聚体组成的具有相同亚基的均聚物形式分泌。然而，成熟是不完全的，产生包含rVWF-PP与成熟VWF的混合物的产物。

在捕获重组因子VIII的单克隆抗体步骤之后，将含有rVWF的流过物(又称为单克隆抗体流出物)上样至阴离子交换器(阴离子交换(AEX)树脂)上。rVWF结合在阴离子交换器上并在钙存在下用弗林蛋白酶成熟。从具有提高电导率的阴离子交换器洗脱rVWF。含有产物的洗脱物通过用60mM柠檬酸钠pH 7.6进行1:2稀释而调节至13.39mS/cm的电导率和7.39的pH值。将经过调节的水性稀释液上样至UNOsphere

图1示出了如实施例1中所表示的成熟rVWF在阳离子交换器上的纯化。

图2提供了纯化结果的表。

图3示出了银染色的蛋白质凝胶和蛋白质印迹，说明rVWF和rVWF-PP通过实施例1中所述的方法分离。

实施例2和3表示一种用于rVWF商业制造的如实施例1中所述的优化方法。

对于实施例2和3，建立用于发酵rVWF和rFVIII的实验设置。所述方法用于简化纯化法以获得高纯的rVWF进行生物化学表征。

通过串联色谱法进行捕获步骤，所述色谱法将亲和色谱法和阴离子交换色谱法组合成单个工艺步骤。基于免疫亲和色谱法技术，在2-8℃温度下rFVIII结合在抗FVIII-mAb柱上。这个步骤可以将rFVIII与rVWF分离。含有rVWF的流过物在同一色谱系统中用纯净水线上稀释并直接上样在AEX柱上。在温度增加至+15℃至28℃之后，在AEX柱上进行重组弗林蛋白酶成熟。通过提高电导率，将经过弗林蛋白酶成熟的rVWF用步进洗脱法来洗脱。还进行精制步骤。将含有rVWF的AEX洗脱物用10mM柠檬酸钠缓冲液pH 7.6稀释，并施加至UNOsphere

在最终实验设计中，收集峰最后的30％至40％以获得具有最高比活性的rVWF。

图4示出了实施例2和3的实验设置的流程图。

图5示出了实施例2的色谱图和用于实施例2和3的色谱法方案。

图6提供了实施例2的所用试剂的表和结果的表。

图7示出了实施例2的另一个色谱图和实施例3的结果的表。

图8示出了银染色的蛋白质凝胶，说明rVWF和rVWF前肽通过实施例2和实施例3的方法的分离。

图9示出了蛋白质印迹，说明rVWF和rVWF前肽通过实施例2和实施例3的方法的分离。

实施例4表示通过尺寸排阻色谱法分离rVWF和rVWF前肽(rVWF-PP)的用于rVWF商业制造的优化方法。将柠檬酸钠加入SEC运行缓冲液中以提供rVWF和rVWF-PP的有效分开。

将含有rVWF的超滤UNOsphere

图10示出了实施例4的色谱图、色谱法方案和缓冲液组成。

图11提供了实施例4的结果的表。

图12示出了银染色的蛋白质凝胶和蛋白质印迹，说明rVWF和rVWF前肽通过实施例4的方法分离。

实施例5表示通过尺寸排阻色谱法分离rVWF和rVWF-PP的方法，所述方法通过施加pH值经过调节的含有rVWF的起始物质至尺寸排阻色谱法上进行。

用1M甘氨酸pH 9.0事先上样至柱上，将含有rVWF的超滤UNOsphere

图13示出了实施例5的色谱图、色谱法方案和缓冲液组成。

图14提供了实施例5的结果的表。

实施例6表示在超滤UNOsphere

在捕获重组因子VIII的单克隆抗体步骤之后，将含有rVWF的流过物上样至阴离子交换器上。rVWF结合在阴离子交换器上并在钙存在下用弗林蛋白酶成熟。从具有提高电导率的阴离子交换器洗脱rVWF。然后将含有产物的洗脱物上样至UNOsphere

图15示出了实施例6的色谱图、色谱法方案和缓冲液组成和条件。

图16提供了实施例6的结果的表。

实施例7表示没有事先补充螯合剂或升高pH值下的SEC方法。这种方法代表了用于从rVWF前肽纯化成熟rVWF的现有技术方法。所述SEC方法不包括包含螯合剂的缓冲液和/或具有7.0或更高的pH值的缓冲液，所述具有7.0或更高的pH值的缓冲液用于调节含有rVWF和残留rVWF前肽的起始洗脱份(物质)。

将含有重组VWF的超滤UNOsphere

图17示出了实施例7的色谱图、色谱法方案和缓冲液组成。

图18提供了实施例7的结果的表。

实施例8表示成熟rVWF在阳离子交换器上的纯化。在AEX Mustang Q步骤之后从当前的rVWF制造工艺获得起始物质。将来自AEX Mustang Q步骤的含有rVWF的流过物进行SD/VI处理，并用含有螯合剂的缓冲液稀释，以解离rVWF/rVWF-前肽复合物。将稀释物质施加至CEX树脂(Unosphere S)上。大部分rVWF-PP、宿主细胞蛋白质(HCP)和低分子量rVWF多聚体通过阳离子交换树脂。在洗涤步骤之后去除残留的rVWF-PP。随后通过钠离子触发提高电导率来洗脱结合的高分子量rVWF多聚体。

工业上，VWF、尤其重组VWF(rVWF)与rFVIII一起在基因工程化的CHO细胞系中一起合成和表达。共同表达的rVWF的功能是在细胞培养过程中使rFVIII稳定。在细胞中rVWF呈含有连接至N端的大的前肽的前rVWF形式合成。在内质网和高尔基体中成熟之后，前肽在细胞蛋白酶弗林蛋白酶的作用下裂解，并呈由表达的蛋白质的二聚体组成的具有相同亚基的均聚物形式分泌。然而，成熟是不完全的，产生包含前肽与成熟VWF的混合物的产物。

在捕获重组因子VIII的单克隆抗体步骤之后，将含有rVWF的流过物上样至Fractogel TMAE阴离子交换器上。rVWF结合在阴离子交换器上并在钙存在下用弗林蛋白酶成熟。从具有提高电导率的阴离子交换器洗脱rVWF。通过Mustang Q(MUQ)过滤单元过滤TMAE-洗脱物，以除去结合于滤膜的CHO-DNA和杂质。CEX步骤的上样物质是Mustang Q过滤步骤(MUQ)的流出物，将流出物用溶剂和洗涤剂处理以使脂质包膜病毒灭活。为了病毒灭活，将MUQ流出物与例如Triton-X-100(1％)和聚山梨醇酯80(0.3％)的两种洗涤剂与有机溶剂磷酸三正丁酯(0.3％)的混合物一起在室温下孵育一小时。含有产物的MUQ_流过物通过用60mM柠檬酸钠pH 7.6进行1:2稀释而调节至21.9mS/cm的电导率和7.16的pH值。选择高电导率以确保除去rVWF前肽(rVWF-PP)和低分子量rVWF多聚体，从而将树脂的容量用于所需高分子量rVWF多聚体。将经过调节的稀释液上样至UNOsphere

用10mM NaCl、30mM柠檬酸钠pH 7.6±0.2中的40％500mM NaCl、30mM柠檬酸钠pH7.6±0.2的步进进行第二次洗涤，以去除强烈结合的HCP和rVWF前肽(洗涤2)。

洗脱分两个阶段进行：(1)第一阶段包括10mM NaCl、30mM柠檬酸钠pH 7.6±0.2中的45％500mM NaCl、30mM柠檬酸钠pH 7.6±0.2的步进(洗脱物1或E1)；和(2)第二阶段包括10mM NaCl、30mM柠檬酸钠pH 7.6±0.2中的45％至100％的500mM NaCl、30mM柠檬酸钠pH7.6±0.2的线性梯度(洗脱物2或E2)，6柱体积。洗涤2至梯度末尾以65cm/h的流速进行。

图19示出了实施例8的色谱图、色谱法方案和缓冲液组成。

图20提供了实施例8的结果的表。

图21示出了银染色的蛋白质凝胶，说明rVWF和rVWF-前肽通过实施例8的方法的分离。

图22示出了蛋白质印迹，说明rVWF和rVWF-前肽通过实施例8的方法的分离。1％琼脂糖凝胶示出产物的多聚体图案。

图23示出了蛋白质印迹，说明rVWF和rVWF-前肽通过实施例8的方法的分离。

实施例9表示优化的成熟rVWF在阳离子交换器上的纯化。在AEX Mustang Q步骤之后从当前的r-VWF制造工艺获得起始物质。将来自AEX Mustang Q步骤的含有rVWF的流过物进行SD/VI处理，并用含有螯合剂的缓冲液稀释，以解离rVWF/rVWF-前肽复合物。将稀释物质施加至CEX树脂(Unosphere S)上。大部分rVWF-PP、宿主细胞蛋白质和低分子量rVWF多聚体通过阳离子交换树脂。在洗涤步骤之后去除残留的rVWF-PP。通过钠离子触发提高电导率的梯度来洗脱结合的高分子量rVWF多聚体。

工业上，VWF、尤其重组VWF(rVWF)与rFVIII一起在基因工程化的CHO细胞系中一起合成和表达。共同表达的rVWF的功能是在细胞培养过程中使rFVIII稳定。在细胞中rVWF呈含有连接至N端的大的前肽的前rVWF形式合成。在内质网和高尔基体中成熟之后，前肽在细胞蛋白酶弗林蛋白酶的作用下裂解，并呈由表达的蛋白质的二聚体组成的具有相同亚基的均聚物形式分泌。然而，成熟是不完全的，产生包含前肽与成熟VWF的混合物的产物。

在捕获重组因子VIII的单克隆抗体步骤之后，将含有r-VWF的流过物上样至Fractogel TMAE阴离子交换器上。rVWF结合在阴离子交换器上并在钙存在下用弗林蛋白酶成熟。从具有提高电导率的阴离子交换器洗脱rVWF。通过Mustang Q(MUQ)过滤单元过滤TMAE-洗脱物，以除去结合于滤膜的CHO-DNA和杂质。CEX步骤的上样物质是Mustang Q过滤步骤(MUQ)的流出物，将流出物用溶剂和洗涤剂处理以使脂质包膜病毒灭活。

为了病毒灭活，将MUQ流出物与例如Triton-X-100(1％)和聚山梨醇酯80(0.3％)的两种洗涤剂与有机溶剂磷酸三正丁酯(0.3％)的混合物一起在室温下孵育一小时。含有产物的MUQ_流过物通过用60mM柠檬酸钠pH 7.6进行1:2稀释而调节至21.9mS/cm的电导率和7.16的pH值。选择高电导率以确保除去rVWF-前肽和低分子量rVWF，从而将树脂的容量用于所需高分子量r-VWF。将经过调节的稀释液上样至UNOsphere

用10mM NaCl、30mM柠檬酸钠pH 7.6±0.2中的36％500mM NaCl、30mM柠檬酸钠pH7.6±0.2的步进以5柱体积进行第二次洗涤(洗涤2)，以去除强烈结合的HCP和rVWF-前肽。

用从10mM NaCl、30mM柠檬酸钠pH 7.6±0.2中的36％500mM NaCl、30mM柠檬酸钠pH 7.6±0.2至10mM NaCl、30mM柠檬酸钠pH 7.6±0.2中的100％500mM NaCl、30mM柠檬酸钠pH 7.6±0.2的梯度以8柱体积进行洗脱。代表所需产物的洗脱物含有在10mM NaCl、30mM柠檬酸钠pH 7.6±0.2中的>50％500mM NaCl、30mM柠檬酸钠pH 7.6±0.2开始至10mMNaCl、30mM柠檬酸钠pH 7.6±0.2中的76％500mM NaCl、30mM柠檬酸钠pH 7.6±0.2的洗脱份池。洗涤和洗脱用50cm/h的流速进行。

图24示出了实施例9的色谱图、色谱法方案和缓冲液组成。

图25提供了实施例9的结果的表。

图26提供了实施例9的产物的表。

图27示出了银染色的蛋白质凝胶，说明rVWF和rVWF-前肽通过实施例9的方法的分离。

图28示出了蛋白质印迹，说明rVWF和rVWF前肽通过实施例9的方法的分离。1％琼脂糖凝胶示出产物的多聚体图案。

图29示出了蛋白质印迹，说明rVWF和rVWF前肽通过实施例9的方法的分离。

在螯合剂和/或升高pH值存在下的rVWF纯化步骤显示r-VWF前肽和宿主细胞蛋白质的高去除速率。阳离子交换器上r-VWF前肽的去除是基于以下事实：在存在螯合剂和/或升高pH值的条件下rVWF-PP不结合至阳离子交换器上。尺寸排阻色谱法上rVWF前肽的去除是基于在螯合剂和/或升高pH值存在下有效尺寸分离的事实。

图30示出了如用于实施例1、2、3、6、8和9的增强阳离子交换色谱法(CEX)所获得的含有产物的洗脱份的纯度。

图31示出了实施例1、2、3、6、8和9的产物相关杂质的去除因数。

图32示出了如用于实施例4和5的增强尺寸排阻色谱法(SEC)所获得的含有产物的洗脱份的纯度。

图33示出了实施例4和5的产物相关杂质的去除因数。

参考文献

美国专利第8,058,411号；Method for producing mature VWF from VWF pro-peptide。发明人：Wolfgang Mundt,Artur Mitterer,Meinhard Hasslacher,ChristaMayer。

美国专利No 6,465,624；Purification of von Willebrand factor by cationexchange chromatography。发明人：Bernhard Fischer,

本研究说明使用阴离子交换色谱法和具有升高pH值(例如pH 8.5)并含有螯合剂(EDTA)的洗脱缓冲液将经过弗林蛋白酶加工的成熟VWF/VWF-PP复合物解离(分离)成成熟VWF和VWF-PP。在阴离子交换器(AEX)、尤其Fractogel TMAE 650(M)上进行分离。还在柱上进行溶剂-洗涤剂处理约1小时以用于病毒灭活。色谱法实验的细节提供于图34-36中。

图34示出了TMAE分离方法中使用的缓冲液配方和材料。

图35示出了经过弗林蛋白酶加工的成熟VWF/VWF-前肽复合物的上样条件。

图36示出了色谱法的缓冲液、条件、参数和流速的细节。

图37示出了经过弗林蛋白酶加工的成熟VWF/VWF-前肽复合物解离成成熟VWF和VWF-前肽(VWF-PP)的色谱图。其示出了VWF-PP从含有成熟VWF的洗脱份的去除。

图38示出了成熟VWF和VWF-前肽(VWF-PP)的分离的另一色谱图。其示出了VWF-PP从含有成熟VWF的洗脱份的去除。

在第一个研究中，比较用于纯化重组成熟VWF的两种方法。

图39提供了用于分离成熟VWF的这两种方法的示意图。在一种方法中，下游加工步骤，例如在获得mAb流出物(MABEffl)、TMAE阴离子交换色谱法的捕获步骤和柱上成熟(TMC)以及Mustang Q阴离子交换色谱法步骤(MUQ)之后的步骤，包括用于病毒灭活的溶剂-洗涤剂处理(SDT)、阳离子交换色谱法(CAT)、超滤浓缩(UFA)、尺寸排阻色谱法(SEC)和渗析-超滤浓缩(DUF)，以产生原料药(成熟VWF)。在另一方法中，下游加工步骤包括改良的阳离子交换色谱法(CAT)步骤，接着渗析-超滤(DUF)浓缩步骤，以产生原料药，并且不包括SEC。

图40提供了突出本文所述并且图39中所示的改良的阳离子交换色谱法(CAT 2.0)的一些优点的表。改良的CAT法可以除去：宿主细胞杂质，减少因数大于1000；VWF-PP，减少因数大于2000；以及残留FVIII，减少因数小于10。CAT法可以用于分离和汇集VWF多聚体。另外，所述方法可以置换作为精制步骤的尺寸排阻色谱法以分离VWF的活性洗脱份和除去残留的源自宿主细胞的杂质和VWF-PP。

在第二个研究中，SEC工艺的条件有所变化以改良成熟VWF与VWF-PP的分离。换句话说，确定改变SEC缓冲液可以通过减少VWF-PP的量提高成熟VWF的纯度。

图41示出了两个色谱图的示意图，显示使用尺寸排阻色谱法，利用标准SEC缓冲液(SQA缓冲液)或改变的SEC缓冲液(SQC缓冲液)对r-VWF前肽的分离。图42提供了突出使用SQC缓冲液的一些优点的表。举例来说，使用SQC缓冲液的方法可以除去宿主细胞杂质达超过约100的减少因数，并且除去残留FVIII达小于10的减少因数。意外地，其可以除去VWF-PP，使得杂质含量小于2μg/1000单位。

因而，本实施例描述了改良成熟VWF与VWF-PP分离的方法。

从单克隆抗体(MAB)流过物开始的重组冯·维勒布兰德因子(rVWF)第一代的下游工艺包括通过阳离子交换色谱法(CAT)在UNO_Sphere S(UNO_S)树脂上的精制步骤。此后，通过超滤作用使UNO_S洗脱物浓缩，并且通过尺寸排阻色谱法(SEC)进一步加工以分离高分子量和低分子量rVWF多聚体并除去游离rVWF前肽—在下游工艺过程中产生的产物相关杂质。高分子量rVWF亚洗脱份代表原料药(BDS)，其最终被配制用于获得最终药品(FDP)。

对于第二代rVWF的下游工艺，建议用改良的阳离子交换色谱法置换SEC步骤，并且通过替代阳离子交换(CAT)洗脱程序(梯度洗脱代替步进洗脱)分离高分子量和低分子量rVWF多聚体以及rVWF前肽。在本实施例中，概述第二代rVWF精制纯化步骤CAT的实验。新工艺参数如CAT上样pH值和电导率、柱洗涤步骤的电导率和长度以及洗脱物汇集标准小规模地探索，以获得可缩放且稳固的工艺下游单元操作步骤。

1.目标

第一代rVWF

对于第二代rVWF的下游工艺，建议取消SEC步骤并用改良的阳离子交换色谱法置换其。

在一系列五个实验中，通过梯度CAT洗脱程序实现了高分子量rVWF多聚体与低分子量rVWF多聚体的分离以及rVWF前肽的除去。新的梯度洗脱模式能够置换在第一代下游工艺中应用的步进洗脱程序。在本实施例中，详细概述第二代rVWF精制纯化步骤CAT的五个实验。所有实验均根据本文所述的研究计划进行。

2.简介和背景

当前的报告描述了通过将当前在第一代(Gen 1)程序中应用的两个VWF下游单元操作步骤CAT和SEC组合来研发第二代(Gen 2)T工艺。在一系列实验中，探索已经在风险评估中鉴定并且被认为对色谱步骤CAT的性能来说重要的工艺参数。当前的研究是基于来自当前的rVWF制造工艺的按比例缩小模型。这一工艺在Orth中建立以生产临床III期物质，并且转移至制造(MFG)规模以进行商业生产(图43A)。为了便于理解本报告中所述的引入的CAT单元操作步骤的变化，以下给出当前使用的第一代rVWF下游单元操作步骤S/D、CAT和SEC的简要工艺描述。

如Gen 1工艺中所用，rVWF精制步骤CAT是在UNO_Sphere S(具有“强”磺酸阳离子交换配体的大孔丙烯酰胺基类培养基)上的色谱阳离子交换工艺。精制步骤的上样物质是阴离子交换过滤步骤MUQ的流出物，将流出物用溶剂和洗涤剂处理以使脂质包膜病毒灭活。为了病毒灭活，将MUQ流出物与例如Triton-X-100(1％)和聚山梨醇酯80(0.3％)的两种洗涤剂与有机溶剂磷酸三正丁酯(0.3％)的混合物一起在室温下孵育一小时。在处理之前，产物溶液经0.2μm膜滤器过滤以除去可能存在的微粒。在病毒灭活之后，将产物溶液用大约一体积水稀释以降低S/D试剂的浓度，调整上样至CAT柱上的步骤的电导率。不调整pH值。CAT色谱步骤的主要目标是除去S/D试剂并进一步减少工艺相关杂质，包括培养基组分如大豆蛋白胨，和其它杂质如r弗林蛋白酶、rFVIII多肽和CHO来源蛋白和DNA。在单元操作步骤CAT之后，所得产物洗脱份(CAT-E)通过尺寸排阻色谱法(SEC)在Superose 6树脂上进一步加工。精制步骤SEC的上样物质是UNO_Sphere S上阳离子交换精制步骤CAT的洗脱物池。因为为了实现合理的分辨率限制SEC柱的上样体积，所以通过使用截止值为30kDa的纤维素类膜盒进行超滤(步骤UFA)，使CAT洗脱物池浓缩大约15倍。在临床III期生产规模，超滤浓度(UFA)浓缩物被分成两种洗脱份，所述两种洗脱份在SEC柱上分开加工。实施这项措施以保持SEC柱体积和柱直径是低的。缓冲液基质以及上样物质的电导率和pH值与CAT洗脱物池对应，并且在上样至SEC柱上之前在浓缩步骤UFA之后不调整。步骤SEC的目标是CHO宿主细胞蛋白质的最终杂质除去，并充当在TMAE琼脂糖凝胶上初始捕获步骤(TMC步骤)期间产生的产物相关杂质rVWF前肽的主要除去步骤。另外，步骤SEC基于尺寸分辨rVWF多聚体，提供了富集促进产物的瑞斯托霉素辅因子活性的高分子量rVWF多聚体的汇集方案。

本报告描述了在MFG(图43A)规模下进行的当前单元操作步骤用改良的CAT(UNO_S)步骤来置换(图43B)。小规模地研究CAT步骤改良。在CAT步骤之后的UDF(浓缩/渗析)步骤可能也应该优化。

3.材料与方法

本文描述了材料和方法以及取样计划。

对于所有实验，都使用冷冻MUQ-E产物。所述物质以130mL等分试样冷冻存储在≤-60℃下，并且一旦需要，就以+2至+8℃的范围解冻一夜。一旦MUQ-洗脱物解冻，便加入S/D试剂并且将混合物经来自Pall的0.2μm过滤器

对于当前报告中所述的实验，使用小规模色谱系统

用于所有五个实验的实验室规模柱装备有10μm PP玻璃料；UNO_Sphere S树脂的粒度直径为约80μm。大规模下，使用筛孔尺寸为20μm的不锈钢玻璃料。所有柱都是设计用于R&D目的的合格物品。

图44中示出了NE中当前GEN 1 MGF设备与当前研究中使用的小规模GEN 2设备之间的硬件比较。

用于小规模纯化运行的缓冲液是在实验室区中制造的，或者来源于制造区域。为了制备缓冲液，使用还用于产生中试规模临床生产的缓冲液的合格化学物质。缓冲液经过0.2μm过滤并且在使用前存储在袋或玻璃瓶中室温下。图48中给出了缓冲液组成的描述。

进行的rVWF生物化学表征、效力和杂质测定包括分析VWF:RistoCo活性、VWF抗原、VWF-前肽抗原含量、FVIII活性发色法、UV吸收谱(280nm、254nm)、多肽类型(例如降解)、多聚体类型和CHO HCP含量的测定。在一些情况下，可以进行其它分析测试以测定例如(但不限于)前VWF抗原含量、FVIII抗原含量、弗林蛋白酶活性、弗林蛋白酶抗原、总蛋白(BCA)、游离巯基、CHO BIP WB、CHO DNA、鼠类单克隆抗体、大豆蛋白胨、Triton X-100、聚山梨醇酯80、磷酸三正丁酯、动力学光散射(DLS)(流体动力学半径)、唾液酸、n-聚糖含量、VWF胶原蛋白结合和VWF氧化。

为了置换第二代rVWF下游工艺中的SEC步骤，探索下文列出的参数。引入的大部分变化是基于R&D可行性研究。色谱法树脂类型(UNO_Sphere S树脂，BioRad)和施加的缓冲液的组成(非pH值)不改变。第二代CAT工艺包括以下变化：S/D处理、上样浓度和流速以及洗涤和洗脱步骤。

4.1 S/D处理

除通过用60mM柠檬酸钠缓冲液1:2稀释病毒灭活物质来终止S/D灭活以外，S/D处理以与GEN 1工艺中相同的方式进行，所述柠檬酸钠缓冲液将CAT馈料设定成7.5-8.0的优选pH值(pH测试范围6.0-9.0)和+25℃下10-30mS/cm

在研究过程中增加上样浓度(RU rVWF/mL树脂)以在不增加柱体积下实现较高的产物负荷。在制造规模(MFG)下，一般施加60-140RU/ml树脂的上样浓度，相比之下，在当前小规模研究中,上样90-270IU/ml树脂。第二代CAT程序的平衡、上样和再平衡流速与第一代工艺相同(100cm/h)。如图45中所示，改变洗涤和洗脱流速。

改变在洗脱阶段之前的洗涤步骤以优化工艺和产物相关杂质的除去。如第一代工艺中所施加的步进洗脱变成梯度洗脱。在研究过程中探索梯度长度。洗脱程序的变化是基于如下观测结果：低分子量rVWF分子在早期梯度洗脱份中洗脱，而高分子量rVWF分子在晚期梯度洗脱份中洗脱(参见例如US6,465,624)。

在两个程序中，CAT工艺包括以下步骤：柱活化(用阳离子反离子钠上样阴离子配体)和平衡(根据在柱出口处监测的稳定pH值和电导率，将柱准备好上样)，接着经过S/D处理和稀释的MUQ洗脱物进行产物上样。

在MFG规模的上样期间，洗脱物通过0.2μm过滤器线上过滤，以保护柱以防在S/D处理期间可能已经形成的颗粒物质。在小规模工艺中，省略这个步骤。在将含有产物的溶液抽吸至柱上之后，完成上样并且通过施加洗涤步骤来除去松弛结合的杂质，所述洗涤步骤除去被抽吸至柱上的低分子量S/D试剂。洗涤步骤的pH值和电导率与平衡和上样步骤的参数对应。在洗涤后，通过施加步进洗脱，使用具有提高的电导率和反离子浓度的洗脱缓冲液，从柱洗脱结合的蛋白质。收集≤3.6CV的产物池。

在小规模Gen 2工艺中，使用替代梯度洗脱程序从柱除去rVWF前肽、小分子量rVWF分子和高分子量分子(图45)。在洗脱之前进行洗涤步骤，它是pH值和电导率与梯度洗脱的起始点相同的步进洗涤。测试四种洗涤情况：0％B(10CV)、55％B(10CV)、40％B(5CV)和45％B(5CV)和36％B(5CV)。对应梯度洗脱步进是0-100％B(12CV)、55-100％B(6CV)、45-100％B(6C V)和36-100％B(6CV)。通过用100％B的2-3CV洗涤完成洗脱。

洗脱物根据洗脱产物相关杂质和产物亚物质来汇集。在产物洗脱之后，清洁柱并用碱性和酸性溶液消毒。这个精制步骤的主要目标是进一步除去工艺相关杂质，包括CHO宿主细胞蛋白质、人r弗林蛋白酶、培养基化合物如大豆蛋白胨)；产物相关杂质(rVWF前肽)和低分子量S/D试剂。只是预期对除去rFVIII的贡献微小。在改良的CAT(UNO_S)步骤后，可能需要蛋白质浓度和缓冲液交换步骤(超滤/渗滤)。然而，这个超滤/渗滤步骤不是本文所述的研究的一部分。图46-48中概述了在第一代MFG规模工艺与第二代小规模工艺之间色谱分析程序的差异。

在以下部分中，呈现当前研究的结果。小规模进行的五个实验清楚显示，通过引入改变的UNOs(CAT)程序，可能置换SEC单元操作步骤和事先超滤(缓冲液交换)步骤。

如上所概述，进行利用不同的洗涤和梯度洗脱程序的五个实验。UNO S步骤的意图是一方面发现除去产物和工艺相关杂质的最佳方法并且实现就VWF Ag和活性而言最佳的产率。图49显示呈现最后(第五个)运行VW_USS_05的两个色谱图。图49的上图描绘了总运行，包括柱活化、上样阶段(高UV

在变化和优化所施加的色谱法条件(例如洗涤液的电导率、开始梯度洗脱)下，改进前肽和成熟rVWF的分离。另外，工艺相关杂质的除去和成熟rVWF Ag和活性的产率有所改良。图50中呈现了一系列实验中最后一次(第5次)运行的SDS-PAGE结果(银染色和抗rVWF蛋白质印迹)。

在还原条件下在3-8％Tris-乙酸盐凝胶上进行SDS-PAGE。通过银染色(顶部)和蛋白质印迹(底部)目测分离的多肽。在上样之前，将样品用DTT还原，此后用碘代乙酰胺阻断游离巯基。对于蛋白质印迹，第一抗体是多克隆兔抗人VWF抗体(来自Dako；序号A0082；1:1000稀释)，第二抗体是多克隆AP缀合的山羊抗兔IgG抗体(来自Sigma；序号A-8025；1:2000稀释)。rVWF亮带在超过250kDa下跑动；VWF前肽在约90kDa下跑动。通过用于蛋白质印迹法的抗体未检测到前肽。

运行VWF_USS_05的结果显示前肽和成熟rVWF明显分离。洗脱物样品(泳道16)和根据第1代程序纯化的参考样品(泳道18)是高度相当的。

为了评定高分子量和低分子量rVWF的分布，通过琼脂糖凝胶和蛋白质印迹法进行亚物质多聚体分析。测试来自上样、流过物(FT)、洗涤、洗脱和高盐洗涤的样品(图51)。流过物(FT；流出的洗脱份)(泳道8)和洗涤/洗脱前(泳道9和10)中含有LMW rVWF亚物质。洗脱和洗脱后池(泳道11和12)显示与参考样品SEC-F(泳道15)相当的亮带图案。根据第1代(Gen1)工艺纯化参考样品并且大致与SEC洗脱物池的上升峰对应。高盐洗涤(泳道13)含有超大rVWF分子，体现在泳道上部区域中的污点。

根据标准方案在1％琼脂糖凝胶上进行多聚体分析。每个泳道施加大约50ngrVWF，并且在非还原条件下在尿素存在下分离。通过蛋白质印迹法，使用兔抗人VWF抗体(Dako)作为第一抗体(1:1000稀释)和AP缀合的山羊抗兔IgG抗体(Sigma)作为第二抗体(1:2000稀释)来使分离的多肽可视化。

比较UNO_S(Gen 2)与SEC(Gen 1)运行之间的rVWF多聚体分布，可以清楚地看见相反的分离效应。在SEC程序中，首先是超大和大分子洗脱物(空体积)，接着是目标分子和前肽。在Gen 2中，分离次序正好相反(小至大)。然而，两种方法均产生相同的rVWF多聚体在洗脱物池中的分布。在UNO_S步骤后，需要UDF(浓度/渗析)单元操作来浓缩目标分子并将其转移至配制缓冲液。

图52-图55中给出了分析结果的概要。每个表示出了一个特定分析测定的结果并且含有在研究过程中进行的所有5次运行的数据。图56中还呈现了洗脱物结果的比较概述。除rVWF:Ag和Risto Co活性洗脱物产率百分比之外，表还含有允许在不同运行设置之间直接比较的计算的配给量。

由改变的CAT(UNO_S)单元操作步骤产生的洗脱物(产物洗脱份)的目标参数部分地符合精选的BDS产品规格。因为CAT-E产物池需要浓缩和渗析以获得BDS物质，所以研发目标(图57)主要是(计算)与绝对参数浓度无关的比率。

大部分研发目标得到满足或几乎达到的事实证明了本文所述的所建议的程序的可行性。不进行所有的分析测定，但例如rVWF:Ag和Risto产率、CHO HCP和前肽杂质除去以及rVWF多聚体的分布的关键性结果展示出所建议的新CAT程序和先前应用的UNO_S/SEC组合的相当性能。

在目前研究的过程中进行五次UNO_S运行以研究第二代CAT程序。优化(最后)运行的结果展示分离高分子量与低分子量rVWF多聚体以及从目标蛋白质除去rVWF前肽和CHO-HCP杂质，这与用Gen 1程序(例如步进洗脱方式的UNO_S+SEC步骤)实现的结果相当。在约24mS/cm的电导率(36％洗脱缓冲液B)下引入的洗涤步骤接着梯度洗脱步骤至约50mS/cm(100％洗脱缓冲液B)产生品质与先前产生的Gen 1SEC F池相当的CAT洗脱物池。虽然可能使用浓缩和渗析CAT洗脱物的额外UDF步骤，但本文所述的Gen 2CAT程序展示置换Gen 1下游工艺中应用的获得BDS物质的UDF和SEC单元操作步骤的很大可能性。

分析从本方法获得的mat-rVWF的多聚体含量。所述阳离子交换(CEX)法的优点包括：

·减少单元操作-1个CEX置换当前工艺的3个单元的操作。

·r-vWF-前肽的去除和宿主细胞蛋白质的去除类似于亲和步骤。

·通过在阳离子交换器上包括“柱上”SD处理-一个步骤中包括4个单元的操作。

·通过在阳离子交换器上包括“柱上”SD处理和弗林蛋白酶成熟-一个步骤中包括5个单元的操作。

·剪应力减少，降低产生血栓形成性rVWF的风险(由于较少的单元操作、过滤和显著减少的保持时间)。

对于这个分析，运行蛋白质印迹法。蛋白质印迹图像输入Corel Photo Paint软件并转变成16位灰度图像。16位灰度格式是评估的要求。评估是用Image Quant 1D软件进行的。

图像垂直翻转以简化评估(泳道数目保持相同)：

·亮带1-6＝低分子量

·亮带7-12＝中间分子量

·亮带>12＝高分子量

与从3单元操作工艺获得的产物相比，从如本文所述的增强CEX获得的产物的vWF多聚体的密度测量评估。

表11：密度测量评估概要

图61-63中提供了展示多聚体百分比的原始数据。

I.背景

r-vWF前肽是源自CHO细胞的r-VWF产物的产物相关杂质。生产细胞系产生r-VWF，其含有约60％的前r-vWF。r-VWF前肽通过肽酰胺键共价附接于r-vWF多肽并且另外通过二价阳离子非共价附接于r-vWF多肽。通过在体外与r弗林蛋白酶一起孵育使共价肽酰胺键裂解。然而，裂解的r-VWF前肽保持附接于VWF分子并且本实施例中描述了用于分离这两种多肽的方法。发现rvWF/rvWF_PP复合物通过二价阳离子和低pH值来稳定。通过施加二价阳离子的螯合剂或高pH值与适当的分离方法组合，可以高效并以稳固的方式分离两种分子。作为螯合剂，发现低浓度的EDTA或柠檬酸盐是有效的，并且当作为洗涤程序施加在阳离子交换树脂上时或当施加在分离缓冲液中时在尺寸排阻色谱法上看到大于或等于pH 7的pH值也是有效的。相同原理可应用于所有分离技术，包括通过树脂或膜技术的离子交换或尺寸分离。在rVWF的当前生产工艺中，用含有柠檬酸盐的运行缓冲液进行步骤SEC以证明rVWF和rVWF-PP的分离。

1.实施例范围的描述-VW_USS_07

1.去除r-vWF-前肽

2.替代“柱上SD_VI”处理的实例

3.“柱上”产生rFVIII/r-vWF复合物

4.在替代配制缓冲液体系中洗脱rFVIII/r-vWF复合物期间柱上预配制

工艺细节：

在捕获重组因子VIII的单克隆抗体步骤之后，将含有r-VWF的流过物上样至Franctogel TMAE阴离子交换器上。r-vWF结合在阴离子交换器上并在钙存在下用弗林蛋白酶成熟。从具有提高电导率的阴离子交换器洗脱r-vWF。通过Mustang Q(Mustang Q，Pall零件号XT5000MSTGQP1)过滤单元过滤TMAE-洗脱物，以除去结合于滤膜的CHO-DNA和杂质。含有产物的MUQ_流过物通过用[60mM柠檬酸钠pH 7.6]进行1:2稀释而调节至21.9mS/cm的电导率和7.16的pH值。选择高电导率以确保除去r-vWF前肽和低分子量r-vWF，从而将树脂的容量用于所需高分子量r-vWF。将经过调节的负荷上样至UNOsphere TM S阳离子交换介质(Bio Rad，产品编号：156-0115)上，柱的内径＝10mm，床高8.8cm，体积为6.91ml以及流速为100cm/h，接着用2CV[30mM柠檬酸钠、180mM NaCl pH 7.5]进行第一次洗涤(再平衡)，以除去强烈结合的HCP和r-vWF-前肽。

用[30mM柠檬酸钠、180mM NaCl pH 7.5，含有25g/Kg以下各物的混合物：18.0g聚山梨醇酯80、3.5g二甲亚砜DMSO、3.5g TnBP]进行可能“柱上处理”(WSD)，12柱体积并且接触时间为大约1小时，以使脂质包膜病毒灭活。以10柱体积[30mM柠檬酸钠、180mM NaCl pH7.5]进行洗涤2，洗去“柱上处理”的组分。通过应用洗涤3，通过施加4柱体积[50mM甘氨酸、10mM牛磺酸、10％蔗糖、0.1％聚山梨醇酯80pH 5.5]，缓冲液从柠檬酸钠缓冲液体系变成甘氨酸/牛磺酸体系。在步骤“FVIII-Con”，将源自于ADVATE工艺的重组人凝血因子VIII以10柱体积上样至结合的r-vWF上。

FVIII-Con-缓冲液由[在以下中稀释的1.57g rFVIII S2 ADV S17B010901B2：218.67g 50mM甘氨酸、10mM牛磺酸、5％(w/w)蔗糖、5％(w/w)D-甘露糖醇、0.1％聚山梨醇酯80、2mM CaCl

工艺顺序：

本实施例的关键步骤的顺序由以下步骤组成(色谱法方案又见图67的底部)

1.Mab FVIII捕获(FT是含有r-vWF的洗脱份)

2.Fractogel TMAE捕获+成熟

3.以FT模式的Mustang Q

4.如所述的CEX(VW_USS_07)

结果：

实验在总计4点上成功进行：

1.r-vWF-前肽的去除发生在洗涤步骤洗涤1、WSD(用(S)溶剂(D)洗涤剂(W)洗涤)和洗涤2期间(参见图67、68和69)。

2.在步骤WSD替代“SD_VI柱上处理”的实例。

3.“柱上”产生rFVIII/r-vWF复合物-步骤FVIII-Con。

4.在替代配制缓冲液体系中洗脱rFVIII/r-vWF复合物期间柱上预配制(参见图66，最后一行)。

I.背景

r-vWF前肽是源自CHO细胞的r-VWF产物的产物相关杂质。生产细胞系产生r-VWF，其含有约60％的前r-vWF。r-VWF前肽通过肽酰胺键共价附接于r-vWF多肽并且另外通过二价阳离子非共价附接于r-vWF多肽。通过在体外与r弗林蛋白酶一起孵育使共价肽酰胺键裂解。然而，裂解的r-VWF前肽保持附接于VWF分子并且本实施例中描述了用于分离这两种多肽的方法。本实施例提供了在弗林蛋白酶裂解之后将r-vWF前肽与r-VWF多肽分离以测试额外唾液酸化的替代的变化实施方案。图70-73和图78中描绘了纯化工艺的另外的细节和结果。

1.实验编号：VW_USS_06

1.去除r-vWF-前肽

2.在柱上在r-vWF上产生额外的2,6唾液酸化

2.实验编号：VW_USS_06

在捕获重组因子VIII的单克隆抗体步骤之后，将含有r-VWF的流过物上样至Franctogel TMAE阴离子交换器上。r-vWF结合在阴离子交换器上并在钙存在下用弗林蛋白酶成熟。从具有提高电导率的阴离子交换器洗脱r-vWF。通过Mustang Q(Mustang Q，Pall零件号XT5000MSTGQP1)过滤单元过滤TMAE-洗脱物，以除去结合于滤膜的CHO-DNA和杂质。含有产物的MUQ_流过物通过用[60mM柠檬酸钠pH 7.6]进行1:2稀释而调节至18.39mS/cm的电导率和pH 7.33。选择高电导率以确保除去r-vWF前肽和低分子量r-vWF，从而将树脂的容量用于所需高分子量r-vWF。将经过调节的负荷上样至UNOsphereTM S阳离子交换介质(BioRad，产品编号：156-0115)上，柱的内径＝10mm，床高8.8cm，体积为6.91ml以及流速为100cm/h，接着用2CV[30mM柠檬酸钠、180mM NaCl pH 7.5]进行第一次洗涤(再平衡)，以除去强烈结合的HCP和r-vWF-前肽。为了引入额外的2,6唾液酸化，通过在线混合，将基于[30mM柠檬酸钠、180mM NaCl pH 7.5]的50％(v/v)CMP-NANA溶液和基于[30mM柠檬酸钠、180mM NaCl pH 7.5]的50％(v/v)α2,6唾液酸转移酶的混合物施加至柱上，10柱体积和25cm/h的流速。CMP-NANA溶液的组成是11mg CMP_NANA C8271-25mg货号：SLBV 7777，溶于154.29g[30mM柠檬酸钠、180mM NaCl pH 7.5]中。α2,6唾液酸转移酶缓冲液的组成是来自美人鱼发光杆菌(Photobacterium Damsela)的α2,6唾液酸转移酶S2076-1UN SIGMA，货号SLBV0552，溶于1ml纯净水中-用152.10g[30mM柠檬酸钠、180mM NaCl pH 7.5]稀释0.5g溶解的α2,6唾液酸转移酶。用2柱体积[30mM柠檬酸钠、180mM NaCl pH 7.5]进一步洗涤，除去过量的CMP_NANA和α2,6唾液酸转移酶。通过施加4柱体积[50mM HEPES、150mM NaCl pH6.0]提供缓冲液交换。用4柱体积[50mM HEPES、500mM NaCl pH 7.5]进行洗脱。

3.完整纯化顺序VW_USS_06

本实施例的关键步骤的顺序由以下步骤组成：

1.Mab FVIII捕获(FT是含有r-vWF的洗脱份)

2.Fractogel TMAE捕获+成熟

3.以FT模式的Mustang Q

4.如所述的CEX(VW_USS_06)

结果：

使用本实施例中的方法未检测到额外2,6唾液酸化。然而，发现2,3唾液酸化，其是r-vWF的常见唾液酸化模式。

I.背景

r-vWF前肽是源自CHO细胞的r-VWF产物的产物相关杂质。生产细胞系产生r-VWF，其含有约60％的前r-vWF。r-VWF前肽通过肽酰胺键共价附接于r-vWF多肽并且另外通过二价阳离子非共价附接于r-vWF多肽。通过在体外与r弗林蛋白酶一起孵育使共价肽酰胺键裂解。然而，裂解的r-VWF前肽保持附接于VWF分子并且本实施例中描述了用于分离这两种多肽的方法。本实施例提供了在弗林蛋白酶裂解之后将r-vWF前肽与r-VWF多肽分离以测试额外唾液酸化的替代的变化实施方案。图74-78中描绘了纯化工艺的另外的细节和结果。

1.实验编号：VW_USS_08

1.去除r-vWF-前肽

2.在柱上在r-vWF上产生额外的2,6唾液酸化

2.实验编号：VW_USS_08

在捕获重组因子VIII的单克隆抗体步骤之后，将含有r-VWF的流过物上样至Franctogel TMAE阴离子交换器上。r-vWF结合在阴离子交换器上并在钙存在下用弗林蛋白酶成熟。从具有提高电导率的阴离子交换器洗脱r-vWF。通过Mustang Q(Mustang Q，Pall零件号XT5000MSTGQP1)过滤单元过滤TMAE-洗脱物，以除去结合于滤膜的CHO-DNA和杂质。含有产物的MUQ_流过物通过用[60mM柠檬酸钠pH 7.6]进行1:2稀释而调节至19.97mS/cm的电导率和pH 7.33。选择高电导率以确保除去r-vWF前肽和低分子量r-vWF，从而将树脂的容量用于所需高分子量r-vWF。将经过调节的负荷上样至UNOsphereTM S阳离子交换介质(BioRad，产品编号：156-0115)上，柱的内径＝10mm，床高8.8cm，体积为6.91ml以及流速为100cm/h，接着用2CV[30mM柠檬酸钠、180mM NaCl pH 7.5]进行第一次洗涤(再平衡)，以除去强烈结合的HCP和r-vWF-前肽。为了引入额外的2,6唾液酸化，通过在线混合，将基于[30mM柠檬酸钠、180mM NaCl pH 7.5]的50％(v/v)CMP-NANA溶液和基于[30mM柠檬酸钠、180mM NaCl pH 7.5]的50％(v/v)α2,6唾液酸转移酶的混合物施加至柱上，10柱体积和25cm/h的流速。CMP-NANA溶液的组成是14mg CMP_NANA C8271-25mg货号：SLBV 7777，溶于121,57g[30mM柠檬酸钠、180mM NaCl pH 7.5]中。α2,6唾液酸转移酶缓冲液的组成是来自美人鱼发光杆菌的α2,6唾液酸转移酶S2076-1UN SIGMA，货号SLBV0552，溶于121.10g[30mM柠檬酸钠、180mM NaCl pH7.5]。用2柱体积[30mM柠檬酸钠、180mM NaCl pH 7.5]进一步洗涤，除去过量的CMP_NANA和α2,6唾液酸转移酶。通过施加4柱体积[50mM HEPES、150mM NaClpH 6.0]提供缓冲液交换。用4柱体积[50mM HEPES、500mM NaCl pH 7.5]进行洗脱。

3.完整纯化顺序VW_USS_08

本实施例的关键步骤的顺序由以下步骤组成：

1.Mab FVIII捕获(FT是含有r-vWF的洗脱份)

2.Fractogel TMAE捕获+成熟

3.以FT模式的Mustang Q

4.如所述的CEX(VW_USS_08)

结果：

使用本实施例中的方法未检测到额外2,6唾液酸化。然而，发现2,3唾液酸化，其是r-vWF的常见唾液酸化模式。

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