一种体外诊断试剂盒通用型质控品保存液

摘要

本发明公开了一种体外诊断试剂盒通用型质控品保存液，pH＝7‑8，由PBS、BSA、海藻糖和EDTA组成。本发明配制简单、成本低廉、能长时间有效的保持包括包括支原体、细菌、DNA类假病毒和RNA类假病毒的质控品的稳定性。本发明的兼容性好，无需离心去除，可以直接用于后续的一步法核酸释放剂使用，也可以通过磁珠法提取，是一款通用型保存液。

说明书

技术领域

本发明属于体外诊断试剂盒试剂技术领域，具体涉及一种体外诊断试剂盒通用型质控品保存液。

背景技术

在体外诊断试剂盒中，质控品(包括校准品、参考品)是必备组分，它们大多为相应的灭活培养物或假病毒组成，质控品的稳定性对实验数据的可靠性至关重要.

现有的保存液大多针对的是某一特定类型的样本，比如呼吸道样本类保存液、粪便保存液、血液保存液、组织保存液等，没有专门针对试剂盒中质控品的保存液配方，且大多配方复杂，有些组分甚至是有潜在致癌性的化学物质，威胁生产者及使用者健康安全。

CN110684869A公开了一种核酸保存液及其应用、含有该核酸保存液的质控品。该核酸保存液的配方为0.03-0.05mg/ml BSA，0.3-1wt％PEG 8000、2-8wt‰NaN

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术缺陷，提供一种体外诊断试剂盒通用型质控品保存液。

本发明的技术方案如下：

一种体外诊断试剂盒通用型质控品保存液，pH＝7-8，由PBS、BSA、海藻糖和EDTA组成。

在本发明的一个优选实施方案中，以浓度为10-100mM的PBS为溶剂，以BSA、海藻糖和EDTA为溶质。

进一步优选的，所述BSA、海藻糖和EDTA在所述PBS中的浓度依次为1-5wt％、1-5wt％和1-5mM。

更进一步优选的，所述PBS的浓度为9-11mM。

再进一步优选的，所述BSA、海藻糖和EDTA在所述PBS中的浓度依次为0.8-1.2wt％、0.8-1.2wt％和0.8-1.2mM。

更进一步优选的，所述PBS的浓度为48-52mM。

再进一步优选的，所述BSA、海藻糖和EDTA在所述PBS中的浓度依次为2.8-3.2wt％、2.8-3.2wt％和2.8-3.2mM。

更进一步优选的，所述PBS的浓度为98-102mM。

再进一步优选的，所述BSA、海藻糖和EDTA在所述PBS中的浓度依次为4.8-5.2wt％、4.8-5.2wt％和4.8-5.2mM。

在本发明的一个优选实施方案中，pH为7.3-7.5。

本发明的有益效果是：

1、本发明配制简单、成本低廉、能长时间有效的保持包括包括支原体、细菌、DNA类假病毒和RNA类假病毒的质控品的稳定性。

2、本发明的兼容性好，无需离心去除，可以直接用于后续的一步法核酸释放剂使用，也可以通过磁珠法提取，是一款通用型保存液。

3、本发明未添加裂解剂和杀菌剂，可增强核酸类物质的稳定性，同时兼顾生产者和使用者的安全性。

具体实施方式

以下通过具体实施方式对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。

实施例1

根据下表1的配方，用常规溶解的方法配制质控品保存液：

表1

本实施例用于检验保存效果的质控品为支原体(MH)质控品、大肠杆菌(E.coli)质控品、HBV假病毒质控品(DNA类假病毒)、COVID-19假病毒质控品(RNA类假病毒)。其中人型支原体和大肠杆菌是天然的灭活菌，HBV假病毒和COVID-19假病毒是人工合成的，它们都含有相应的靶基因片段。

MH质控品制备：MH支原体外购，用质控品保存液稀释至相应浓度即为MH质控品。

E.coli质控品制备：将E.coli菌株进行37℃培养，培养物经离心，去除上清液，用生理盐水复悬后，65℃30min灭活，用质控品保存液稀释至相应浓度即为E.coli质控品。

假病毒质控品制备：①目的基因的制备：根据NCBI数据库中的基因序列，设计保守引物序列，合成目的基因。②用限制性内切酶对目的基因片段和载体进行双酶切，将酶切产物进行琼脂糖电泳，并切胶回收。将酶切产物进行连接，然后将连接产物转化感受态细胞，经37℃平板LB培养，挑选单个阳性菌，接种到含抗性的LB液体培养基中，37℃振荡培养后进行PCR验证。③将培养后的菌液进行离心，弃上清，留沉淀。加入缓冲液进行冰浴超声处理，然后将超声产物进行离心收集上清，即为假病毒溶液。④用DNaseI或RNase A进行消化，然后加入质控品保存液即为HBV和COVID-19假病毒质控品。

后续用于扩增检测各质控品的引物序列如下表2所示：

表2

具体配制过程如下：

(1)配制200mM pH7.4的PBS缓冲液作为母液。

(2)按表1准确称量BSA、海藻糖和EDTA，根据PBS的终浓度计算上述母液的使用量，用该特定使用量的母液溶解BSA、海藻糖和EDTA，最后用超纯水定容至相应体积。

具体检测过程和结果如下：

以MH质控品进行初步筛选，考察37℃下表1中的不同配方的质控品保存液保存的质控品的稳定性。在37℃加速试验前，通过一步法核酸释放剂提取MH质控品，用表2的引物和探针序列对MH质控品进行PCR检测，并记录Ct均值作为0天数据。在37℃3天、7天、10天加速后分别进行提取和扩增，记录Ct均值与第0天进行比较。

偏差＝(第N天Ct值-第0天Ct值)/第0天Ct值×100％

试验结果如表3所示：

表3

由上述实验结果可知，本发明质控品保存液(配方1～3)在37℃10天条件下目标核酸降解率分别为2.26％、1.79％和0.09％，均低于5％。在后续的PCR扩增中发现，配方3荧光信号比配方1和配方2要下降约30％，所以更加优选配方2，在相同条件下，对照组和其他实验组核酸降解率远高于配方1-3。说明配方1-3能够很好的稳定支原体类的质控品。

将上述配方2作为E.coli质控品的保存液。考察37℃3天、7天、10天加速后用一步释放剂进行核酸提取，然后用表2中的相应的引物和探针进行PCR检测，记录Ct均值，计算与0天的偏差。具体结果如下表4所示：

表4

由上述实验结果可知，配方2在37℃ 10天条件下，目标核酸降解率为-3.86％，低于5％。在相同条件下，对照组的核酸降解率远高于本发明，说明配方2能够很好的稳定细菌类的质控品。

将上述配方2作为HBV质控品的保存液。考察37℃ 3天、7天、10天加速后分别用磁珠法进行核酸提取，然后用表2中的相应的引物和探针进行PCR检测，记录Ct均值，计算与0天的偏差。具体结果如下表5所示：

表5

由上述实验结果可知，配方2在37℃ 10天条件下目标核酸降解率为-0.37％，低于5％。在相同条件下，对照组的核酸降解率高于配方2。说明配方2能够很好的稳定DNA类假病毒的质控品。

将上述配方2作为COVID-19质控品的保存液。考察37℃3天、7天、10天加速后分别用磁珠法进行核酸提取，然后用表2中的相应的引物和探针进行PCR检测，记录Ct均值，计算与0天的偏差。具体结果如下表6所示：

表6

由上述实验结果可知，配方2在37℃10天条件下目标核酸降解率为4.07％，低于5％。在相同条件下，对照组中的目标核酸在37℃ 3天已完全降解。说明配方2能够很好的稳定RNA类假病毒的质控品。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。

序列表

<110> 英科新创（苏州）生物科技有限公司

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