一种富硒鼠李糖乳杆菌工业化生产方法及其所用培养基

摘要

本发明公开了一种富硒鼠李糖乳杆菌工业化生产方法及其所用培养基。所述方法包括如下步骤：1)将鼠李糖乳杆菌在种子培养基中进行活化，得到活化后的种子液；2)将所述活化后的种子液在基础发酵培养基中进行发酵培养，得到发酵液；3)将所述发酵液在富硒发酵培养基中进行发酵培养，得到发酵产物；所述富硒发酵培养基中含有破壁的富硒酵母。本发明采用高硒含量破壁的酵母作为发酵培养基中的硒源不仅有效提高了鼠李糖乳杆菌发酵过程中的硒转化率，而且还解决了现有技术用亚硒酸钠作为硒源进行发酵培养后的菌体表面残留无机亚硒酸钠的弊病。最终得到的富硒鼠李糖乳杆菌产品中的有机硒占总硒的比可达到99.5％以上。

说明书

技术领域

本发明涉及微生物发酵工程领域，具体涉及一种富硒鼠李糖乳杆菌工业化生产方法及其所用培养基。

背景技术

鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnose)是一种能够利用发酵性糖类产生乳酸的益生菌，可黏附于肠道上皮细胞并定植在人体中，具有多种生理功能。例如：抑制肠道中有害菌生长(如抑制幽门螺旋杆菌生长)，促进乳糖消化，辅助治疗便秘、腹泻，缓解溃疡性结肠炎，降低血清胆固醇，抗癌、抗过敏，提高免疫力，调节尿酸代谢改善痛风症状等生理功能。

硒是人体必需的微量元素，人体不能自己合成，必须从外界获取。世界有四十个国家土地贫硒或缺硒，中国有2/3的地区土地缺硒。科学家证实缺硒可引起人体40多种疾病(如克山病、大骨节病、癌症、心脑血管病、衰老、不孕不育等)和动物多种疾病。

富硒鼠李糖乳杆菌兼有补充硒和鼠李糖乳杆菌的双重功效，具有更好的调节胃肠道菌群和提高免疫力的作用。然而目前富硒鼠李糖乳杆菌的工业化生产方法仍未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种富硒鼠李糖乳杆菌大规模工业化生产的技术，以获得高活性、高浓度和高富有机硒鼠李糖乳杆菌。

为了实现上述目的，本发明首先提供了一种富硒鼠李糖乳杆菌的生产方法。

本发明提供的富硒鼠李糖乳杆菌的生产方法包括如下步骤：

1)将鼠李糖乳杆菌在种子培养基中进行活化，得到活化后的种子液；

2)将所述活化后的种子液在基础发酵培养基中进行发酵培养，得到发酵液；

3)将所述发酵液在富硒发酵培养基中进行发酵培养，得到发酵产物；

所述富硒发酵培养基中含有破壁的富硒酵母。

上述富硒鼠李糖乳杆菌的生产方法中，所述步骤1)包括如下步骤：

1-1)将鼠李糖乳杆菌(冻干粉)接种至种子培养基(含有种子培养基的试管)中过夜，得到过夜后的菌液；

1-2)将所述过夜后的菌液在种子培养基(含有种子培养基的试管)中继代培养，得到继代培养后的菌液；

1-3)将所述继代培养后的菌液在种子培养基(含有种子培养基的三角瓶)中进行培养，得到活化后的种子液。

进一步的，所述种子培养基包括酪蛋白胨、牛肉粉、酵母粉、葡萄糖、乙酸钠、柠檬酸二胺、吐温80、K

所述酪蛋白胨在所述种子培养基中的浓度可为8-12g/L(或8-10g/L或10-12g/L)；具体可为8g/L或10g/L或12g/L；

所述牛肉粉在所述种子培养基中的浓度可为8-12g/L(或8-10g/L或10-12g/L)；具体可为8g/L或10g/L或12g/L；

所述酵母粉在所述种子培养基中的浓度可为4-6g/L(或4-5g/L或5-6g/L)；具体可为4g/L或5g/L或6g/L；

所述葡萄糖在所述种子培养基中的浓度可为4-6g/L(或4-5g/L或5-6g/L)；具体可为4g/L或5g/L或6g/L；

所述乙酸钠在所述种子培养基中的浓度可为4-6g/L(或4-5g/L或5-6g/L)；具体可为4g/L或5g/L或6g/L；

所述柠檬酸二胺在所述种子培养基中的浓度可为1-3g/L(或1-2g/L或2-3g/L)；具体可为1g/L或2g/L或3g/L；

所述吐温80在所述种子培养基中的浓度可为0.5-2g/L(或0.5-1g/L或1-2g/L)；具体可为0.5g/L或1g/L或2g/L；

所述K

所述MgSO

所述1-1)中，所述过夜的条件可为28-32℃条件下静止；具体可为30℃条件下静止。

所述1-2)中，所述继代培养的次数可为1次；所述继代培养的条件可为28-32℃培养12-16小时；具体可为30℃培养15小时。

所述1-3)中，所述培养的条件可为28-32℃培养18-24小时；具体可为30℃培养20小时。

更进一步的，所述种子培养基由水(蒸馏水)、酪蛋白胨、牛肉粉、酵母粉、葡萄糖、乙酸钠、柠檬酸二胺、吐温80、K

所述种子培养基的pH值为6.2-6.4。

上述富硒鼠李糖乳杆菌的生产方法中，所述步骤2)包括如下步骤：

2-1)将所述活化后的种子液在基础发酵培养基中进行一级放大培养，得到一级种子液；

2-2)将所述一级种子液在基础发酵培养基中进行二级放大培养，得到二级种子液。

进一步的，所述基础发酵培养基包括酵母粉、牛肉粉、葡萄糖、KH

所述酵母粉在所述基础发酵培养基中的质量分数可为2-4％(或2-3％或3-4％)；具体可为2％或3％或4％；

所述牛肉粉在所述基础发酵培养基中的质量分数可为0.4-0.6％(或0.4-0.5％或0.5-0.6％)；具体可为0.4％或0.5％或0.6％；

所述葡萄糖在所述基础发酵培养基中的质量分数可为0.4-0.5％；具体可为0.4％或0.5％；

所述KH

所述吐温80在所述基础发酵培养基中的质量分数可为0.4-0.6％(或0.4-0.5％或0.5-0.6％)；具体可为0.4％或0.5％或0.6％；

所述乙酸钠在所述基础发酵培养基中的质量分数可为0.4-0.6％(或0.4-0.5％或0.5-0.6％)；具体可为0.4％或0.5％或0.6％；

所述柠檬酸钠在所述基础发酵培养基中的质量分数可为0.1-0.3％(或0.1-0.2％或0.2-0.3％)；具体可为0.1％或0.2％或0.3％；

所述硫酸锌在所述基础发酵培养基中的质量分数可为0.04-0.06％(或0.04-0.05％或0.05-0.06％)；具体可为0.04％或0.05％或0.06％；

所述硫酸镁在所述基础发酵培养基中的质量分数可为0.04-0.06％(或0.04-0.05％或0.05-0.06％)；具体为0.04％或0.05％或0.06％；

所述维生素B1在所述基础发酵培养基中的浓度可为90-110ppm(或90-100ppm或100-110ppm)；具体可为90ppm或100ppm或110ppm。

所述2-1)中，所述一级放大培养的条件可为36-38℃、搅拌速度140-160转/分条件下发酵培养16-18小时；具体可为37℃、搅拌速度150转/分的条件下发酵培养16-18小时；

所述2-2)中，所述二级放大培养的条件可为36-38℃、搅拌速度140-160转/分条件下发酵培养16-18小时；具体为37℃、搅拌速度150转/分的条件下发酵培养16-18小时。

更进一步的，所述基础发酵培养基由水、酵母粉、牛肉粉、葡萄糖、KH

所述基础发酵培养基的pH值为6.8。

上述富硒鼠李糖乳杆菌的生产方法中，所述3)中，所述富硒发酵培养基为将所述基础发酵培养基中的酵母粉替换为破壁的富硒酵母后得到的培养基。

所述破壁的富硒酵母的制备方法包括如下步骤：将富硒酵母粉与水混匀，制成酵母水清液；将所述酵母水清液搅拌后先在-15℃中冷冻0.5小时，然后加热到80℃，保持0.5小时，再降温到60℃，得到破壁的富硒酵母。所述富硒酵母粉与水的质量比可为1:20。所述搅拌的条件可为：室温下搅拌2小时。

进一步的，所述破壁的富硒酵母在所述富硒发酵培养基中的质量分数可为3-5％(或3-4％或4-5％)；具体可为3％或4％或5％。

所述发酵培养的条件可为36-38℃发酵培养22-25小时，具体为37℃发酵培养24小时。

上述富硒鼠李糖乳杆菌的生产方法中，所述发酵产物还依次包括压滤、冷冻干燥和过筛的步骤。

所述压滤的压力可为(50-60)Kg，所述压滤的时间可为1小时。

所述冷冻干燥的条件可为先-20℃预冻3小时，然后降温至-45℃，在-45℃下真空冷冻干燥12小时。

为了实现上述目的，本发明又提供了上述富硒鼠李糖乳杆菌的生产方法的新用途。

本发明提供了上述富硒鼠李糖乳杆菌的生产方法在提高富硒鼠李糖乳杆菌中的硒含量和/或活菌数中的应用。

为了实现上述目的，本发明还提供了如下a1)-a5)任一所述的产品：

a1)按照上述富硒鼠李糖乳杆菌的生产方法制备得到的富硒鼠李糖乳杆菌；

a2)上述富硒鼠李糖乳杆菌的生产方法中的种子培养基；

a3)上述富硒鼠李糖乳杆菌的生产方法中的基础发酵培养基；

a4)上述富硒鼠李糖乳杆菌的生产方法中的富硒发酵培养基；

a5)成套培养基，其包括上述富硒鼠李糖乳杆菌的生产方法中的种子培养基、基础发酵培养基和富硒发酵培养基。

为了实现上述目的，本发明最后提供了如下b1)-b6)任一所述的应用：

b1)上述种子培养基或基础发酵培养基或富硒发酵培养基或成套培养基在生产富硒鼠李糖乳杆菌中的应用；

b2)上述种子培养基或基础发酵培养基或富硒发酵培养基或成套培养基在制备生产富硒鼠李糖乳杆菌的产品中的应用；

b3)上述种子培养基或基础发酵培养基或富硒发酵培养基或成套培养基在提高富硒鼠李糖乳杆菌中的硒含量和/或活菌数中的应用；

b4)上述种子培养基或基础发酵培养基或富硒发酵培养基或成套培养基在制备提高富硒鼠李糖乳杆菌中的硒含量和/或活菌数的产品中的应用；

b5)按照上述富硒鼠李糖乳杆菌的生产方法制备得到的富硒鼠李糖乳杆菌在调节胃肠道菌群和/或提高免疫力中的应用；

b6)按照上述富硒鼠李糖乳杆菌的生产方法制备得到的富硒鼠李糖乳杆菌在制备调节胃肠道菌群和/或提高免疫力的产品中的应用。

上述任一所述应用或产品中，所述硒含量为有机硒含量。

上述任一所述方法或应用或产品中，所述鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnose)为鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnose)CGMCC 1.8882。

本发明的有益效果如下：

1、本发明富硒发酵培养基中的硒源采用破壁的富硒酵母，富硒酵母是国家批准的营养强化剂，有机硒含量占总硒的质量百分比达97％以上，破壁方法采用自溶法使酵母细胞壁溶解(富硒酵母破壁自溶法可参考文献“徐那,等.几种不同破壁方法对提取酵母内容物的影响[J].农产品加工,2015，380(3)：1-6”中的方法)。采用高硒含量破壁的酵母作为发酵培养基中的硒源有如下优势：1)破壁后的酵母的内容物中包含硒蛋白、硒核糖核酸、硒多糖等有机硒化合物，可有效提高鼠李糖乳杆菌发酵过程中的硒转化率。2)解决了现有技术用亚硒酸钠作为硒源进行发酵培养后的菌体表面残留无机亚硒酸钠的弊病，省去了为冲洗掉菌体表面的亚硒酸钠的工序，不仅使本发明的富硒鼠李糖乳杆菌生产方法更加省时省力，而且使最终得到的富硒鼠李糖乳杆菌产品所含的硒元素中，有机硒占总硒的质量百分比达到99.5％以上。

2、本发明发酵工艺采用二级鼠李糖乳杆菌发酵放大，使得有机硒发酵培养生产时，鼠李糖乳杆菌的对数生长期延长，获得高活性、高浓度菌体，菌体产量增加。

3、本发明可实现6吨发酵罐的发酵生产，有规模效益，适于大规模的工业化生产。

本发明采用新的富硒发酵培养基配方和二次种子扩增技术的高密度发酵方法制备得到富硒鼠李糖乳杆菌。该方法是以鼠李糖乳杆菌为菌种，首先用改良的MRS种子培养基对菌种进行活化，然后用基础发酵培养基进行二次扩增工艺后，再用本发明富硒发酵培养基进行高密度发酵，最后用工业级板框压缩菌体，并对菌体进行冷冻干燥，获得富硒鼠李糖乳杆菌产品。该产品中的有机硒含量可达3760ppm，占总硒的质量百分比可达99.95％以上，活菌数可达9.0×10

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中的鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnose)购自中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC1.8882。

下述实施例中的酪蛋白胨是北京鸿润宝顺科技有限公司的产品，货号为Y010A。

下述实施例中的牛肉粉是北京鸿润宝顺科技有限公司的产品，货号为Y014A。

下述实施例中的酵母粉是北京鸿润宝顺科技有限公司的产品，货号为Y017A。

下述实施例中的冻干保护剂为含有葡萄糖、海藻糖、甘油的溶液，其中，葡萄糖12％，海藻糖22％，甘油2％。

下述实施例中的破壁的富硒酵母的制备方法如下：

1、将150kg的富硒酵母粉(购自安琪酵母股份有限公司，符合国家标准产品，有机硒含量为2000ppm)与3000kg去离子水混匀，制成酵母水清液，在室温下搅拌2小时，目的是通过去离子水使酵母细胞肿胀而发生破裂(在去离子水环境下，细胞内的离子离开胞内，引起细胞肿胀破裂)。

2、为了使未破壁的酵母细胞破裂，进一步增加破壁效果，将酵母水清液在搅拌2小时后先置于-15℃的冰柜中冷冻0.5小时，然后在反应罐中迅速加热到80℃，保持0.5小时，再降温到60℃，得到破壁的富硒酵母。

实施例1、富硒鼠李糖乳杆菌的生产方法及有机硒和活菌数检测

(一)富硒鼠李糖乳杆菌的生产方法

一、菌种的活化

从冰箱取出鼠李糖乳杆菌冻干粉0.5g，接种到含有10毫升改良的MRS种子培养基的试管中，在30℃条件下静止过夜，得到过夜后的菌液。过夜后的菌液在试管中进行1次继代培养(继代培养的培养基为改良的MRS种子培养基，培养条件为30℃培养15小时)，得到继代培养后的菌液。将继代培养后的菌液接种到含有400毫升的改良的MRS种子培养基的三角瓶(1000毫升)中，在30℃条件下培养20小时后，得到活化后的鼠李糖乳杆菌种子液。

改良的MRS液体种子培养基的制备方法如下：将酪蛋白胨10克，牛肉粉10克，酵母粉5克，葡萄糖5克，乙酸钠5克，柠檬酸二胺2克，吐温80 1克，K

二、种子液的一级放大培养

完成步骤一后，将活化后的鼠李糖乳杆菌种子液(400毫升)加入含有6L基础发酵培养基的10L种子罐中，在37℃、搅拌速度150转/分的条件下发酵培养16-18小时，得到一级种子液。

基础发酵培养基的溶剂为水，溶质及其质量分数分别如下：酵母粉3％，牛肉粉0.5％，葡萄糖0.5％，KH

三、种子液的二级放大培养

完成步骤二后，将种子罐中的一级种子液全部负压吸入含有120L基础发酵培养基的200L发酵罐中，在37℃、搅拌速度150转/分的条件下发酵培养16-18小时，得到二级种子液。

四、种子液在富硒发酵培养基中发酵培养

完成步骤三后，将种子罐中的二级种子液全部负压吸入含有3.6吨(3600L)富硒培养基甲的6吨(6000L)发酵罐中，37℃发酵培养24小时，得到发酵产物。

富硒发酵培养基甲的溶剂为水，溶质及其质量分数分别如下：破壁的富硒酵母3％，牛肉粉0.5％，葡萄糖0.5％，KH

五、板框压滤

完成步骤四后，取出发酵罐中的发酵产物，用板框压滤机(购自上海信步科技有限公司)压滤，压滤的压力为50-60kg，压滤的时间为1小时，得到固体产物。

六、冷冻干燥

完成步骤五后，先向固体产物中加入冻干保护剂(固体产物与冻干保护剂的质量比为1:4)中，然后经冷冻干燥后得到干燥粉，冷冻干燥条件如下：先-20℃预冻3小时，然后降温至-45℃，在-45℃下，真空冷冻干燥12小时；再将干燥粉过筛，得到颗粒直径为60-80目的富硒鼠李糖乳杆菌产品(富硒鼠李糖乳杆菌干粉)，该产品含水率为3％。

(二)富硒鼠李糖乳杆菌产品中有机硒含量的检测

首先采用氢化物原子荧光光谱法(GB 5009.93-2017食品安全国家标准食品中硒的测定)，检测步骤(一)中获得的富硒鼠李糖乳杆菌干粉中的总硒含量。然后参照GB1903.21-2016食品安全国家标准食品营养强化剂富硒酵母项下的方法制备无机硒测定的试样。再采用氢化物原子荧光光谱法测定产品中的无机硒含量。最后用总硒含量减去无机硒含量得到有机硒含量，从而计算出富硒鼠李糖乳杆菌干粉中有机硒的百分含量以及有机硒占总硒的质量百分比。

无机硒测定的试样制备方法的具体步骤如下：称取约1g试样，精确至0.0001g，置于50mL容量瓶中，加入约25mL水，超声溶解10min，使试样充分溶解，加水定容至刻度，摇匀。将定容后的溶液置于5000r/min的离心机中，离心10min，吸取10.0mL离心上清液于15mL离心管中，加盐酸2.0mL、铁氰化钾溶液1.0mL，混匀待测。同时做空白试验。

结果表明：富硒鼠李糖乳杆菌干粉中的有机硒含量为1980ppm(1980mg/kg)，占总硒的质量百分比为99.95％。

(三)富硒鼠李糖乳杆菌产品中活菌数的测定

采用国标法(GB4789.35-2010)检测富硒鼠李糖乳杆菌干粉中的活菌数。

结果表明：富硒鼠李糖乳杆菌干粉中的活菌数为2×10

实施例2、富硒鼠李糖乳杆菌的生产方法及有机硒和活菌数检测

(一)富硒鼠李糖乳杆菌的生产方法

将实施例1(一)的步骤四中的富硒发酵培养基甲替换为富硒发酵培养基乙；富硒发酵培养基乙的溶剂为水，溶质及其质量分数分别如下：破壁的富硒酵母4％，牛肉粉0.5％，葡萄糖0.5％，KH

其他步骤与实施例1(一)相同。

(二)富硒鼠李糖乳杆菌产品中有机硒含量的检测

按照实施例1中步骤(二)中的方法检测步骤(一)中获得的富硒鼠李糖乳杆菌干粉中有机硒的百分含量以及有机硒占总硒的质量百分比。

结果表明：富硒鼠李糖乳杆菌干粉中的有机硒含量为2630ppm(2630mg/kg)，占总硒的质量百分比为99.93％。

(三)富硒鼠李糖乳杆菌产品中活菌数的测定

采用国标法(GB4789.35-2010)检测富硒鼠李糖乳杆菌干粉中的活菌数。

结果表明：富硒鼠李糖乳杆菌干粉中的活菌数为6.0×10

实施例3、富硒鼠李糖乳杆菌的生产方法及有机硒和活菌数检测

(一)富硒鼠李糖乳杆菌的生产方法

将实施例1(一)的步骤四中的富硒发酵培养基甲替换为富硒发酵培养基丙；富硒发酵培养基丙的溶剂为水，溶质及其质量分数分别如下：破壁的富硒酵母5％，牛肉粉0.5％，葡萄糖0.5％，KH

其他步骤与实施例1(一)相同。

(二)富硒鼠李糖乳杆菌产品中有机硒含量的检测

按照实施例1中步骤(二)中的方法检测步骤(一)中获得的富硒鼠李糖乳杆菌干粉中有机硒的百分含量以及有机硒占总硒的质量百分比。

结果表明：富硒鼠李糖乳杆菌干粉中的有机硒含量为3760ppm(3760mg/kg)，占总硒的质量百分比为99.95％。

(三)富硒鼠李糖乳杆菌产品中活菌数的测定

采用国标法(GB4789.35-2010)检测富硒鼠李糖乳杆菌干粉中的活菌数。

结果表明：富硒鼠李糖乳杆菌干粉中的活菌数为9.0×10

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。