稳定表达人转铁蛋白受体1细胞株的制备方法及其应用

摘要

本发明公开了一种稳定表达人转铁蛋白受体1的细胞系及其在药物筛选中的应用，本发明提供了该细胞株的构建方法及其应用实例，包括(1)将hTfR1基因插入真核表达载体；（2）将步骤1得到的载体导入到宿主细胞中，经过加压筛选得到稳定表达hTfR1的细胞系；3）步骤2得到的细胞系用于药物筛选。

说明书

技术领域

本发明涉及一种稳定表达人转铁蛋白受体1(TfR1)细胞株的制备方法及其在药物筛选中的应用

背景技术

转铁蛋白(transferrin，Tf)是一类广泛存在于脊椎动物体液及其细胞中的单体糖蛋白家族，主要在肝脏合成，半衰期8天，血清浓度200–300mg/dL。成熟的Tf由679个氨基酸组成，分子质量约80kDa。晶体结构显示Tf的第1-336的氨基酸酸残基构成它的N端结构域，第337-679残基构成它的C端结构域。N端、C端结构域又由两个大小相同的小亚基构成。小亚基间的间隙是Fe结合位点，每分子的转铁蛋白能携带2个三价铁离子(Fe

转铁蛋白受体(CD7l)是参与铁的吸收和调节细胞生长的必需的蛋白。人体铁通过Tf运输，组织细胞通过Tf-TfR介导的内化过程实现铁的吸收。TfR1是一种II型跨膜糖蛋白，通过两个二硫键交联而成同源二聚体(180kDa)。其单体(含760个氨基酸，分子量为90-95kDa)包含一个大的胞外C端区域(671个氨基酸)，一个单跨膜区域(包含28氨基酸)及一个短的N端胞内调节区域(包含61氨基酸)。C端区域是一个外功能区，它包含Tf的结合位点。外功能区包含3个N-糖基化位点及一个O-糖基化位点，这些位点的糖基化作用是TfR1功能所必需的。

在高通量筛选、评估与transferrin结合或者靶向TfR1的药物(包括小分子化合物、短肽、基因工程改造的蛋白或抗体等)能否有效结合TfR1的过程中，需要使用一种快捷的transferrin-TfR1或药物-TfR1结合的体外细胞模型。本发明建立了HEK293F-hTfR1细胞模型，便于做transferrin介导的或者靶向TfR1的药物抗体或其它药物分子有效结合TfR1的细胞筛选模型。

发明内容

本发明提供一种稳定表达人转铁蛋白受体1细胞株的制备方法及其应用。

本发明提供的稳定表达人转铁蛋白受体1细胞株的制备方法，具体步骤如下：

将人源转铁蛋白受体1基因克隆到真核表达载体。

该真核表达载体具有如下特点：人源转铁蛋白受体编码基因TfR1与绿色荧光素基因(eGFP)处于同样的转录调控原件的控制之下，可以在哺乳动物细胞中共表达。

该真核表达载体具备在真核细胞中驱动外源基因表达的所有转录、翻译所需要的调控原件，包括启动子promoter、增强子enhancer、转录起始区、polyA加工和转录终止信号，以及核糖体结合区、翻译起始信号、翻译终止信号等；使TfR1与eGFP处于同样的转录、翻译调控原件控制之下，即处于同一个转录本或mRNA。

上述表达载体中人源TfR1和eGFP编码基因之间包含自剪切肽T2A序列，使其在同一开放读码框(ORF)中，由CMV启动子及其基因转录调控元件驱动TfR1和eGFP共表达。翻译后的多肽序列在T2A自剪切位点被切割成TfR1以及eGFP。TfR1通过二硫键的形式组成成熟的同源二聚体TfR1受体。

为了便于观察转染效率和基因在细胞中的表达，可在真核表达载体中加入可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因，如GFP。载体开放读码框示意图如说明书附图1所示：

将上述步骤中获得的表达载体导入到宿主细胞中，经过筛选得到稳定表达且具有功能活性的人转铁蛋白受体1细胞株。

表达载体导入细胞的方式包括经化学方式(包括liposome，lipofectamin等脂质成份为主体的微球结构介导的细胞转染)、物理方式或生物学方式导入哺乳动物细胞；

表达载体导入细胞方式中的物理学方式包括但不限于利用电穿孔方式导入DNA到哺乳动物细胞；

表达载体导入细胞中的生物学方式包括但不限于构建得到的载体包裹入病毒颗粒，通过病毒颗粒感染哺乳动物细胞的方式导入外源基因片段；

阳性细胞株筛选

上述细胞的筛选可以通过以下途径得到：

基于单细胞分离技术比如流式细胞分选，可以是通过构建得到的载体相关联的荧光素基因(如绿色、黄色、红色荧光蛋白GFP、YFP、RFP等)的表达，以荧光强度挑选高表达的细胞株；

上述细胞的筛选还可以是通过表达载体中基因片段相关联的抗菌素抗性基因表达以及应用抗生素去除没有基因整合或表达量相对较低的细胞；可以用逐步提高抗生素浓度的方式挑选高表达细胞株；经过有限稀释方法的得到单克隆细胞。

人转铁蛋白受体1稳定表达细胞株的鉴定：

人转铁蛋白受体1高表达细胞株中转铁蛋白受体的表达量可以利用转铁蛋白受体特异抗体对细胞进行FACS检测，或者用相应抗体通过西方印染(western blot)或酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞裂解物中hTfR1的含量来确定；

利用上述方法制备的人转铁蛋白受体1稳定表达细胞株可以应用在如下方面：

运用HEK293F-hTfR1细胞模型，采用FACS筛选噬菌体展示中的阳性克隆；

用于筛选transferrin介导的或者靶向TfR1的药物分子，包括小分子化合物、短肽、基因工程改造的蛋白或抗体等。

一株稳定表达人转铁蛋白受体的细胞株HEK 293F-hTfR1于2020年08月04日保藏于中国典型培养物保藏中心。保藏单位代码：CCTCC中国典型培养物保藏中心；保藏地址：中国武汉大学；保藏状态：存活；保藏日期：2020年8月4日；保藏编号：C2020143；分类命名：人TfR1过表达人胚肾细胞系HEK293F-hTfR1。

附图说明：

图1：人源转铁蛋白受体1基因真核表达载体开放读码框示意图。

图2：hTfR1同源二聚体表达质粒：hTfR1和eGFP编码基因之间包含自剪切肽T2A序列，两者在同一开放读码框(ORF)中，由CMV启动子及其基因转录调控元件驱动hTfR1和eGFP共表达。翻译后的多肽序列在T2A自剪切位点被切割成hTfR1以及eGFP。TfR1通过二硫键的形式组成成熟的同源二聚体hTfR1受体。

图3：FACS检测HEK 293F细胞转染后hTfR1的表达：转染后48小时hTfR1细胞阳性率为9.09％；72小时阳性率为15.88％。

图4：FACS检测HEK293F-hTfR1细胞GFP阳性细胞：HEK293F-hTfR1细胞GPF阳性细胞占比19.27％。

图5：FACS检测Tf与HEK 293F-hTfR1细胞结合：Tf可以与HEK 293F-hTfR1细胞结合，其阳性细胞率为21.99％。

图6：FACS筛选anti-transferrin噬菌体阳性克隆：噬菌体克隆A2、E11、G9、D5、A5、F10在有Tf条件下GFP/M13双阳性率大于5％，提示这些克隆可以通过Tf介导与TfR1结合。

图7：应用稳定表达HEK293-hTfR1细胞筛选Tf结合蛋白：Tf结合蛋白SLN0042、SLN0044和SLN0049GFP/OVA双阳性率分别为：7.12％，11.34％和20.95％，可以与Tf结合，并通过Tf-TfR1结合到细胞表面。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。

下述实施例中所用的方法如无特殊说明均为常规方法。

实施例1重组真核表达载体pcDNA3.1-TfR1的构建

在真核表达载体pcDNA3.1多克隆位点中插入human transferring receptor 1(UniProtKB-P02786(TFR1_HUMAN),该序列为Seq 1；eGFP序列来自于P42212.1的基因编码序列(CDS)，该序列为Seq 2。

两者之间通过自剪切肽T2A序列连接，T2A的序列为Seq 3,使其在同一开放读码框(ORF)中由CMV启动子及其基因转录调控元件驱动TfR1和eGFP共表达。翻译后的多肽序列在T2A自剪切位点被切割成TfR1以及eGFP。TfR1通过二硫键结合的形式组成成熟的同源二聚体TfR1受体。该载体如说明书附图2所示。

宿主细胞HEK293F为悬浮培养人胚肾细胞。针对该细胞将上述表达序列进行密码子优化。合成基因片段和pcDNA3.1载体经BamH I,Xba I双酶切，T4 ligase连接，DH 5α感受态细胞转化，扩增，抽取质粒备用。

实施例2HEK 293F-hTfR1稳定细胞系的建立

HEK 293F细胞采用奥普迈(OPM-CD05，81075-001)培养液培养。按常规传代培养。采用含10％DMSO培养液冻存细胞，1×10

pcDNA3.1-TfR1-T2A-eGFP转染HEK 293F细胞：转染前一天D0，接种1.5×10

稳定表达HEK293-hTfR1细胞系的建立：D3，细胞传代，并加入400ug/ml G418加压筛选。D7，细胞换液，G418 400ug/ml.。D10，对照细胞全部死亡，HEK 293F-hTfR1细胞改用含G418 200ug/ml培养基培养。FACS鉴定TfR1阳性表达并按常规传代、扩增培养、液氮保存备用。

实施例3稳定表达HEK293F-hTfR1细胞系的鉴定

通过流式细胞仪检测HEK 293F-hTfR1细胞TfR1的表达：

pcDNA3.1-TfR1-T2A-eGFP转染HEK 293F细胞，分别在转染后48小时、72小时收集细胞。用含1％BSA PBS室温封闭细胞30min；300g离心，弃上清；一抗anti-TfR1(Abcam,ab214039)1:100稀释，4℃摇床孵育1小时；预冷PBS洗涤细胞3次；二抗Alexa

流式细胞仪检测稳定表达HEK 293F-hTfR1细胞中GFP阳性细胞：分别收集HEK293F和HEK 293F-hTfR1细胞，300g离心，弃上清；FACS缓冲液200ul重悬细胞后上机检测。CytExpert软件分析数据。实验结果如说明书附图4显示：HEK293F-hTfR1细胞GPF阳性细胞占比19.27％。

实施例4稳定表达HEK293-hTfR1细胞生物学功能检测

流式细胞仪检测transferrin与HEK 293F-hTfR1细胞的结合：分别收集HEK 293F和HEK 293F-hTfR1细胞，300g离心，弃上清；用含1％BSA PBS室温封闭细胞30min；300g离心，弃上清；一抗anti-Tf(abcam,ab82411)1:100稀释，4℃摇床孵育1小时；300g离心，弃上清；预冷PBS洗涤细胞3次；二抗Alexa

实施例5稳定表达HEK293-hTfR1细胞在药物筛选中的应用

例1：应用稳定表达HEK293-hTfR1细胞筛选噬菌体展示文库中anti-transferrin抗体阳性克隆：分别收集HEK 293F和HEK 293F-hTfR1细胞，300g离心，弃上清；用含1％BSAPBS室温封闭细胞30min；分别取噬菌体克隆上清90ul或PBS，加入U型96孔板中；配置20×Tf(Sigma,T3309)(终浓度5ug/ml)和20×anti-M13抗体(abcam,ab9225)终浓度1：100稀释；U型96孔板中分别加入5ul/孔Tf和5ul/孔anti-M13抗体，或5ul/孔PBS和5ul/孔anti-M13抗体，充分混合后室温孵育1小时；将细胞离心弃上清后，分别加入前述U型96孔板中混合物，4℃摇床孵育1小时；300g离心，弃上清；预冷PBS洗涤细胞3次；山羊抗小鼠IgG-AlexaFluor647(abcam,ab150115)1：2000稀释，4℃避光孵育30分钟；预冷PBS洗涤细胞3次；FACS缓冲液200ul重悬细胞后上机检测。CytExpert软件分析数据。实验结果如说明书附图6显示：噬菌体克隆A2、E11、G9、D5、A5、F10在有Tf条件下GFP/M13双阳性率大于5％，提示这些克隆可以通过Tf介导与TfR1结合。

例2：应用稳定表达HEK293-hTfR1细胞筛选Tf结合蛋白：收集HEK 293F-hTfR1细胞，300g离心，弃上清；用含1％BSA PBS室温封闭细胞30min；配置4×Tf(Sigma,T3309)(终浓度5ug/ml)，4×anti-OVA抗体(abcam,ab181688)(终浓度1：100稀释)和2X Tf结合蛋白(终浓度10ug/ml),U型96孔板中分别加入25ul/孔Tf、25ul/孔anti-OVA抗体和50ul Tf结合蛋白，或25ul/孔PBS、25ul/孔anti-OVA抗体和50ul Tf结合蛋白，充分混合后室温孵育1小时；将细胞离心弃上清后，分别加入前述U型96孔板中混合物，4℃摇床孵育1小时；300g离心，弃上清；预冷PBS洗涤细胞3次；Alexa

序列表

<110> 领诺（上海）医药科技有限公司

<120> 稳定表达人转铁蛋白受体1细胞株的制备方法及其应用

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<170> SIPOSequenceListing 1.0

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<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 1

Met Asp Gln Ala Arg Ser Ala Phe Ser Asn Leu Phe Gly Gly Glu Pro

1 5 10 15

Leu Ser Tyr Thr Arg Phe Ser Leu Ala Arg Gln Val Asp Gly Asp Asn

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Ser His Val Glu Met Lys Leu Ala Val Asp Glu Glu Glu Asn Ala Asp

35 40 45

Asn Asn Thr Lys Ala Asn Val Thr Lys Pro Lys Arg Cys Ser Gly Ser

50 55 60

Ile Cys Tyr Gly Thr Ile Ala Val Ile Val Phe Phe Leu Ile Gly Phe

65 70 75 80

Met Ile Gly Tyr Leu Gly Tyr Cys Lys Gly Val Glu Pro Lys Thr Glu

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Glu Asp Phe Pro Ala Ala Arg Arg Leu Tyr Trp Asp Asp Leu Lys Arg

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Lys Leu Ser Glu Lys Leu Asp Ser Thr Asp Phe Thr Gly Thr Ile Lys

130 135 140

Leu Leu Asn Glu Asn Ser Tyr Val Pro Arg Glu Ala Gly Ser Gln Lys

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Asp Glu Asn Leu Ala Leu Tyr Val Glu Asn Gln Phe Arg Glu Phe Lys

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Leu Ser Lys Val Trp Arg Asp Gln His Phe Val Lys Ile Gln Val Lys

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Asp Ser Ala Gln Asn Ser Val Ile Ile Val Asp Lys Asn Gly Arg Leu

195 200 205

Val Tyr Leu Val Glu Asn Pro Gly Gly Tyr Val Ala Tyr Ser Lys Ala

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Ala Thr Val Thr Gly Lys Leu Val His Ala Asn Phe Gly Thr Lys Lys

225 230 235 240

Asp Phe Glu Asp Leu Tyr Thr Pro Val Asn Gly Ser Ile Val Ile Val

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Arg Ala Gly Lys Ile Thr Phe Ala Glu Lys Val Ala Asn Ala Glu Ser

260 265 270

Leu Asn Ala Ile Gly Val Leu Ile Tyr Met Asp Gln Thr Lys Phe Pro

275 280 285

Ile Val Asn Ala Glu Leu Ser Phe Phe Gly His Ala His Leu Gly Thr

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Pro Pro Ser Arg Ser Ser Gly Leu Pro Asn Ile Pro Val Gln Thr Ile

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Ser Arg Ala Ala Ala Glu Lys Leu Phe Gly Asn Met Glu Gly Asp Cys

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Pro Ser Asp Trp Lys Thr Asp Ser Thr Cys Arg Met Val Thr Ser Glu

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Trp Leu Glu Gly Tyr Leu Ser Ser Leu His Leu Lys Ala Phe Thr Tyr

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Ile Asn Leu Asp Lys Ala Val Leu Gly Thr Ser Asn Phe Lys Val Ser

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Ser Lys Val Glu Lys Leu Thr Leu Asp Asn Ala Ala Phe Pro Phe Leu

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