人TNFα真核表达载体的构建及其在人肝癌耐药细胞株HepG2/ADM中的稳定表达

摘要

目的:构建可在真核细胞内表达人肿瘤坏死因子alpha(hTNF-α)基因的真核表达载体,建立稳定表达hTNF-α基因的细胞模型。方法:应用RT-PCR的方法从分离的正常人外周血单核细胞(LPS刺激)中,扩增出hTNF-αcDNA,连接至载体pMD18-Tvector中,经酶切鉴定与序列测定证实;以亚克隆法构建于真核表达载体pBK-CMV的相应酶切位点,转化至大肠埃希菌DH5α,最后将表达的pBK-hTNFα重组蛋白行SDS-PAGE电泳,并作考马斯亮蓝染色分析,Westernblot鉴定;经脂质体Lipo-fectamine2000转染HepG2/ADM细胞后,经G418筛选,通过ELISA、RT-PCR方法检测其在体外转染肝癌耐药细胞HepG2/ADM后hTNFα基因和蛋白的表达。结果:自正常人外周血单核细胞中克隆的hTNF-αcDNA成功连接到pMD18-Tvector,用BamHⅠ和HindⅢ双酶切、经序列测定证实,与Genbank的序列完全一致;pBK-hTNFα的克隆表达重组蛋白经Westernblot证实此蛋白为hTNFα。克隆基因正确插入载体pBK-CMV中。pBK-hTNFα经脂质体介导转染肝癌耐药细胞后,ELISA、RT-PCR方法检测到其在转染细胞中稳定表达。结论:通过DNA重组技术成功地构建了可在体外稳定表达hTNF-αcDNA全长的真核表达载体pBK-hTNFα。