一种TFPI2基因甲基化定量检测的引物探针组合及其应用、试剂盒和方法

摘要

本发明提供了TFPI2基因甲基化定量检测的引物探针组合及其应用、试剂盒和方法，属于基因工程技术领域，所述引物探针组合包括扩增TFPI2基因和ACTB基因的引物探针；所述TFPI2基因的引物探针包括T2‑F、T2‑R和T2‑P，核苷酸序列依次如SEQ ID No.1～3所示；所述ACTB基因的引物探针包括AB‑F、AB‑R和AB‑P，核苷酸序列依次如SEQ ID No.4～6所示。采用本发明提供的TFPI2基因甲基化定量检测的引物探针组合能够实现对TFPI2基因甲基化定量检测。

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种TFPI2基因甲基化定量检测的引物探针组合及其应用、试剂盒和方法。

背景技术

结直肠癌是全球最常见的恶性肿瘤之一，根据国家癌症中心2018年报道，结直肠癌是男性第三位和女性第二位常见的恶性肿瘤，死亡病例在全世界男性、女性中分别排名第四和第三位。发达国家中结直肠癌发病率明显高于发展中国家，这与发达国家较高的肥胖率、不健康的饮食习惯等因素有关。

大规模人群筛查是降低结直肠癌发病率与死亡率的重要途径，传统结直肠癌筛查存在敏感性差，患者接受度低等问题；新筛查方法(如血液，粪便DNA检测)存在价格昂贵，患者认可度低等问题。

DNA甲基化(DNA methylation)为DNA化学修饰的一种形式，能够在不改变DNA序列的前提下，改变遗传表现。所谓DNA甲基化是指在DNA甲基化转移酶的作用下，在基因组CpG二核苷酸的胞嘧啶5'碳位共价键结合一个甲基基团。大量研究表明，DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达。近年来的大量研究表明，DNA异常甲基化与肿瘤的发生、发展、细胞癌变有着密切的联系。DNA甲基化生物学效应作为肿瘤发生发展的早期标志物，在组织病理水平可以更好的标记现阶段组织癌变程度并预测组织癌变风险。但是现有技术中对甲基化的检测局限于定性检测，还未有关于如何设计引物探针，实现TFPI2基因甲基化定量检测。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种TFPI2基因甲基化定量检测的引物探针组合及其应用、试剂盒和方法，采用本发明提供的TFPI2基因甲基化定量检测的引物探针组合能够实现对TFPI2基因甲基化定量检测。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种TFPI2基因甲基化定量检测的引物探针组合，包括扩增TFPI2基因和ACTB基因的引物探针；

所述TFPI2基因的引物探针包括T2-F、T2-R和T2-P，所述T2-F的核苷酸序列如SEQID No.1所示，所述T2-R的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，所述T2-P的核苷酸序列如SEQID No.3所示；

所述ACTB基因的引物探针包括AB-F、AB-R和AB-P，所述AB-F的核苷酸序列如SEQID No.4所示，所述AB-R的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，所述AB-P的核苷酸序列如SEQID No.6所示。

优选的，所述T2-P的5`端添加6-FAM，3`端添加BHQ1；

所述AB-P的5`端添加ROX，3`端添加BHQ2。

优选的，所述TFPI2基因的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，所述ACTB基因的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示。

本发明还提供了一种TFPI2基因甲基化定量检测的试剂盒，包括定量PCR反应液、Taq酶、阳性校准品、阳性对照和阴性对照；所述定量PCR反应液中含有上述技术方案所述的引物探针组合。

优选的，所述定量PCR反应液每22.5μL包括：10×Buffer 2.5～5μL，浓度为100μM的T2-F 0.02～0.1μL，浓度为100μM的T2-R 0.02～0.1μL，浓度为100μM的AB-F 0.02～0.1μL，浓度为100μM的AB-R 0.02～0.1μL，浓度为100μM的T2-P 0.02～0.1μL，浓度为100μM的AB-P 0.02～0.1μL，浓度为10mM的dNTPs 0.1～1μL，Mg

优选的，所述阳性校准品为4种含有T2质粒的溶液，4种溶液中T2质粒的浓度分别为1×10

优选的，所述Taq酶的酶活为50U/μL；所述阳性对照为TFPI2基因甲基化阳性的DNA，所述阴性对照为TFPI2基因甲基化阴性的DNA。

本发明还提供了上述技术方案所述的引物探针组合在制备预测结直肠癌复发风险的试剂中的应用。

本发明还提供了一种非诊断目的基于上述技术方案所述的试剂盒对TFPI2基因甲基化定量检测的方法，包括以下步骤：

1)将样品DNA进行亚硫酸盐转化，得到转化DNA；

2)将所述步骤1)得到的转化DNA利用所述试剂盒进行荧光定量PCR反应，以阳性校准品为定量校准品，得到样品中TFPI2基因的拷贝数和ACTB基因的拷贝数；将TFPI2基因的拷贝数除以ACTB基因的拷贝数乘以100，得到样品中TFPI2基因甲基化率，实现对TFPI2基因甲基化的定量检测。

优选的，所述步骤2)荧光定量PCR反应的条件包括：95℃10min；95℃15s，60℃30s，40个循环。

本发明提供了一种TFPI2基因甲基化定量检测的引物探针组合。本发明针对TFPI2基因的CpG岛和ACTB序列，分别设计出特异性的引物，运用探针进行实时定量PCR，以T2质粒为定量校准品，得到样本中TFPI2和ACTB的拷贝数，将TFPI2拷贝数/ACTB拷贝数×100得出每个样本TFPI2的甲基化率，实现对TFPI2基因甲基化的定量检测。

附图说明

图1为TFPI2甲基化率(纵坐标)与不同结直肠组织类型(横坐标)统计分布的散点图，在病理水平，按照结直肠癌发生发展的进程分为六大类结直肠组织，每组测定几十个样本的TFPI2甲基化率，得到组TFPI2甲基化率；癌症组织：32，癌旁组织：32，高级别上皮内瘤变：50，低级别上皮细胞内瘤变：52，息肉组织：49，正常组织：49，总样本数：264。

具体实施方式

本发明提供了一种TFPI2基因甲基化定量检测的引物探针组合，包括扩增TFPI2基因和ACTB基因的引物探针；所述TFPI2基因的引物探针包括T2-F、T2-R和T2-P，所述T2-F的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述T2-R的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，所述T2-P的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；所述ACTB基因的引物探针包括AB-F、AB-R和AB-P，所述AB-F的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，所述AB-R的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，所述AB-P的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。

本发明针对TFPI2基因的CpG岛和ACTB序列，分别设计出特异性的引物。在本发明中，所述TFPI2基因的登录号为NG_032914，所述ACTB基因的登录号为NG_007992。在本发明中，TFPI2基因的CpG岛位于启动子区，是其基因转录调节的关键区域，CpG岛中特定位点的C甲基化对其基因的表达活性有重大影响，设计特定引物探针序列可以检出特定位点甲基化情况，阳性表示癌变风险高，阴性癌变风险低。

ACTB是细胞中常用的管家基因，检测引物探针序列设计在其基因外显子和内含子交界处，可以特异性标定细胞数目，为精准的甲基化定量所必须。

在本发明中，所述T2-F的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，具体如下：

GATCGTAGTGTAAGACGTTC；

所述T2-R的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，具体如下：

ATAACGAACACACGATCCG；

所述T2-P的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，具体如下：

AAAGAGCGTATGGCGAGATG，本发明优选在T2-P的5`端添加6-FAM，3`端添加BHQ1。

在本发明中，所述AB-F的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，具体如下：

TTATTGTGGGGTGTTTTAGGTATTAG；

所述AB-R的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，具体如下：

AAACACCCTTACCTCCCACC；

所述AB-P的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示，具体如下：

agttggttgggtggggtagttttggg，本发明优选在AB-P的5`端添加ROX，3`端添加BHQ2。

本发明还提供了一种TFPI2基因甲基化定量检测的试剂盒，包括定量PCR反应液、Taq酶、阳性校准品、阳性对照和阴性对照；所述定量PCR反应液中含有上述技术方案所述的引物探针。

在本发明中，所述定量PCR反应液每22.5μL优选包括：10×Buffer 2.5～5μL，浓度为100μM的T2-F 0.02～0.1μL，浓度为100μM的T2-R 0.02～0.1μL，浓度为100μM的AB-F0.02～0.1μL，浓度为100μM的AB-R 0.02～0.1μL，浓度为100μM的T2-P 0.02～0.1μL，浓度为100μM的AB-P 0.02～0.1μL，浓度为10mM的dNTPs 0.1～1μL，Mg

在本发明中，所述阳性校准品优选为4种含有T2质粒的溶液，4种溶液中T2质粒的浓度分别为1×10

在本发明中，所述T2质粒的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，具体如下：其中，粗体部分为TFPI2扩增片段，斜体部分为ACTB扩增片段。

在本发明中，所述Taq酶的酶活优选为50U/μL，本发明对Taq酶在试剂盒中放置的量没有特殊限定，采用常规在试剂盒中放置酶的量即可。

在本发明中，所述阳性对照优选为TFPI2基因甲基化阳性的DNA，所述阴性对照优选为TFPI2基因甲基化阴性的DNA。在本发明中，所述阳性对照为TFPI2基因甲基化阳性的肿瘤细胞株提取的DNA，阴性对照为TFPI2基因甲基化阴性的细胞株提取的DNA。具体的核苷酸序列如下：

TFPI2基因甲基化阳性对照(SEQ ID No.8)：

GTTCGTTGGGTAAGGCGTTCGAGAAAGCGTTTGGCGGGAGGAGGTGCGCGGTTTTTTGTTTTAGGCGGTTCGGGTGTTCGTTTT；

TFPI2基因甲基化阴性对照(SEQ ID No.9)：

GTTTGTTGGGTAAGGTGTTTGAGAAAGTGTTTGGTGGGAGGAGGTGTGTGGTTTTTTGTTTTAGGTGGTTTGGGTGTTTGTTTT。

本发明还提供了上述技术方案所述的引物探针组合在制备预测结直肠癌复发风险的试剂中的应用。

本发明还提供了一种非诊断目的基于上述技术方案所述的试剂盒对TFPI2基因甲基化定量检测的方法，包括以下步骤：

1)将样品DNA进行亚硫酸盐转化，得到转化DNA；

2)将所述步骤1)得到的转化DNA利用所述试剂盒进行荧光定量PCR反应，以阳性校准品为定量校准品，得到样品中TFPI2基因的拷贝数和ACTB基因的拷贝数；将TFPI2基因的拷贝数除以ACTB基因的拷贝数乘以100，得到样品中TFPI2基因甲基化率，实现对TFPI2基因甲基化的定量检测。

在本发明中，所述样品优选为结直肠癌组织。本发明对提取结直肠癌的DNA的方法没有特殊限定，采用常规提取组织中DNA的方法即可。本发明对样品DNA进行亚硫酸盐转化的方法没有特殊限定，优选按照Qiagen59104EpiTect Bisulfite Kit试剂盒中的说明书进行。在本发明中，亚硫酸盐转化的原理是：甲基化的C在亚硫酸盐环境中不被转化，未甲基化的C在亚硫酸盐环境中被转化成T，经过亚硫酸盐转化后，运用PCR荧光探针法，可以区分特定位点的C有没有被转化成T，从而判断此位点的C是否存在甲基化。

在本发明中，所述荧光定量PCR反应的条件优选包括：95℃10min；95℃15s，60℃30s，40个循环。在本发明中，所述荧光定量PCR反应的体系如表1所示：

表1荧光定量PCR反应体系

本发明优选使用ABI7500 PCR仪进行荧光定量PCR。以阳性校准品为定量校准品，得到样品中TFPI2基因的拷贝数和ACTB基因的拷贝数。在本发明中，四种校准品在检测样本时同步进行PCR反应并标定对应的浓度(TFPI2与ACTB拷贝数)，依据校准品Ct值与浓度(TFPI2与ACTB拷贝数)的关系，通过PCR仪自带软件分析计算出样本浓度(TFPI2与ACTB拷贝数)，甲基化率通过公式：TFPI2拷贝数/ACTB拷贝数×100算出每个样本的甲基化率(所以此甲基化率可以理解成：100个细胞中TFPI2甲基化阳性细胞的数目)。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

试剂及仪器来源：Qiagen EpiTect Bisulfite Kit(48)试剂盒购于上海优宁维生物科技股份有限公司；Omega FFPE DNA Kit D3399石蜡包埋组织DNA提取试剂盒购于南京优尔博生物科技有限公司；引物探针委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成；Taq酶购于Bioline(Meridian Life Science,Inc.)；dNTPs购于诺唯赞生物科技有限公司；校准品(T2质粒)委托金斯瑞生物科技有限公司合成；阳性对照为HT-29细胞株提取的全基因组DNA；阴性对照为293T细胞株提取的全基因组DNA。

实施例1

一、利用HT-29细胞株和293T细胞株制备TFPI2甲基化阳性和阴性对照品；合成含有TFPI2和ACTB基因片段的质粒(T2)，稀释成1×10

(一)石蜡组织DNA提取

1.取3～8片10～20μm石蜡切片样品至1.5mL离心管，加入1mL二甲苯，剧烈涡旋10s混匀。10,000g离心2min，小心吸掉上清(不要吸到切片)。

3.加入1mL无水乙醇涡旋混匀。

4. 10,000g离心2min，小心吸掉上清(不要吸到切片)；37℃开盖空气干燥5min，直至乙醇完全挥发(如蜡块没有去除干净，可重复脱蜡)。

5.加入200μL BufferFTL和20μl OB蛋白酶，涡旋混匀。

6. 55℃水浴3h或至组织消化，每隔20～30min混匀一次。如果有需要也可消化过夜。

7. 90℃水浴60min。

8.室温静置5min。

9.加入220μLl BufferBL，涡旋混匀。

10.加入250μL的无水乙醇，高速涡旋15s混匀。

11.转移混合液至套有收集管HiBind DNA柱子中，室温下10,000g离心1min，弃去滤液。

12.把柱子装在收集管，加入500μL HB Buffer，室温下10,000g离心1min，弃去滤液。

13.把柱子装在新收集管，加入500μL DNA Wash Buffer，室温10,000g离心1min。

14.弃去滤液，重复步骤13一次。倒弃滤液后将柱子重新套回收集管，10,000g离心3min。

15.把柱子装在干净的1.5mL离心管上，加入80μL 70℃预热的Elution Buffer到柱子基质上，室温下静置3min后，室温10,000g离心1min,以洗脱DNA，保留含DNA的洗脱液。

(二)DNA浓度测定

应用上海元析可见光光度计UV-5500PC测出DNA浓度，将DNA稀释成100ng/μL。

(三)亚硫酸盐转化

转化按照Qiagen 59104EpiTect Bisulfite Kit进行，具体步骤为：

1.转化反应体系配制：

表2转化反应体系

2.配制完成后混匀，放于PCR仪上，设置以下PCR程序：

表3 PCR程序

3.运行转化程序，转化完成后回收转化后DNA。

4.将转化完成的DNA吸入新的1.5ml离心管中。

5.加入310μL含10μL/ml carrier RNA的BufferBL，震荡混匀5s。

6.加入250μL无水乙醇，震荡混匀5s。

7.将步骤6混匀后的液体加入到EpiTect spin column中，10,000g离心1min。

8.弃滤液，向回收柱中加入500μL BufferBW，10,000g离心1min。

9.弃滤液，向回收柱中加入500μL Buffer BD，室温静置15min，10,000g离心1min。

10.弃滤液，向回收柱中加入500μL BufferBW，10,000g离心1min。

11.重复步骤10一次。

12.将回收柱放置于新的1.5mL离心管中，室温静置5min。

13.加入50μL Buffer EB(56℃预热)至吸附柱中，室温静置5min。

14. 10,000g离心2min，洗脱下来的转化后DNA保存备用。

选取六对结直肠癌组织和对应的癌旁组织进行甲基化定量分析。

按照以上流程提取转化DNA，按照以下成分配制PCR反应体系：

表1 PCR反应体系

ABI7500 PCR仪设置以下程序进行荧光PCR反应：

表4荧光PCR反应的程序

结果分析：

六对结直肠癌组织与对应癌旁组织甲基化定量检测结果如表5所示，其中13-1～18-1是六个不同病人额癌症组织及其对应的癌旁组织：

1.在ABI7500 PCR仪软件样本设置中将上述4种浓度的定量校准品设置为S并标示对应浓度。

2.调整基线，阈值线。

3.标准曲线判定：在Standard Curve中检查曲线是否准确，R

4.样本拷贝数计算：标准曲线检查良好后，点击Export菜单栏，生成样本TFPI2与ACTB的拷贝数。

5.在生成的Excel表格中计算每个样本的甲基化率：每个样本对应两个荧光通道，FAM(TFPI2)和ROX(ACTB)。甲基化率的公式为：TFPI2拷贝数/ACTB拷贝数*100，按照此公式计算出13-1～18-1和13-3～18-3甲基化率。

表5六对结直肠癌组织与对应癌旁组织甲基化定量检测结果

从表5中可以看出，结直肠癌症组织高度甲基化，癌旁组织可能存在少量甲基化。

图1是根据结直肠癌发生发展的时期不同所取样本采用上述引物探针组合和方法进行的统计分析，初步设置TFPI2甲基化率大于5为高风险(易复发，残留癌细胞等)。

检测限实验按照以下步骤检测：

1.500ng甲基化阳性细胞DNA转化，回收体积为50μl，转化后DNA浓度约10ng/μl。

2.500ng甲基化阴性细胞DNA转化，回收体积为50μl，转化后DNA浓度约10ng/μl。

3.用标准曲线对转化后的阳性阴性DNA的ACTB进行精准定量，调整二者ACTB拷贝数到同一水平。

4.按照甲基化阳性DNA：甲基化阴性DNA＝1:99配比配制1％甲基化DNA。

以1％甲基化DNA为模板进行25次PCR重复检测，TFPI2检出次数不低于23次。

结果为：最低检测限为1％甲基化(10ng/μl)。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 江苏默金生物工程技术有限公司

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gttcgttggg taaggcgttc gagaaagcgt ttggcgggag gaggtgcgcg gttttttgtt 60

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