包含三硫代磷酸酯核苷间键的寡核苷酸

摘要

本发明涉及一种寡核苷酸，其包含至少一个式(I)的三硫代磷酸酯核苷间键其中(A1)、(A2)和R如说明书和权利要求书中所定义。本发明所述的寡核苷酸可用作药物。

说明书

本发明涉及一种寡核苷酸，其包含至少一个式(I)的三硫代磷酸酯核苷间键

其中(A

短的合成核酸表现出作为治疗剂的巨大潜力。自20世纪70年代后期首次概念验证研究(证明未经修饰的脱氧核苷酸能够在体外抑制病毒的产生(P.C.Zamecnik,M.L.Stephenson,Proc.Nat.Acad.Sci.USA 1978,75,280-284))以外，通过化学修饰已经取得了显著进展。由于对于核酸降解的敏感性，核酸的磷酸二酯主链的稳定化是用于化学优化治疗性寡核苷酸的一个明显的起点。因此，人们已经研究了各种磷酸修饰，包括硫代磷酸酯(PS)(F.Eckstein,Antisense and Nucleic Acid Drug Development 2009,10,117-121)、二硫代磷酸酯(例如，W.T.Weisler，M.H.Caruthers，J.Org.Chem 1996，61，4272-4281)、硼代磷酸酯(例如，J.S.Summers，B.R.Shaw，Curr.Med.Chem.2001，8，1147-1155)、(硫代)氨基磷酸酯(例如S.Gryaznov，T.Skorski，C.Cucco，M.Nieborowska-Skorska，C.Y.Chiu，D.Lloyd，J.Chen，M.Koziolkiewicz，B.Calabretta，Nucleic Acids Res.1996，24，1508-1514)和甲基磷酸酯(例如P.S.Sarin，S.Agrawal，M.P.Civeira，J.Goodchild，T.Ikeuchi，P.C.Zamecnik，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 1988，20，7448-7451)。在这些磷酸酯类似物中，无疑最成功的修饰是硫代磷酸酯，其中一个非桥接磷酸酯氧原子被硫取代。由于其对于核酸酶的高度稳定性及其药代动力学优势，硫代磷酸酯寡核苷酸成为第一代寡核苷酸治疗药物，并且为新一代修饰方法诸如锁定核酸(LNA)或2'-O-(2-甲氧基乙基)-寡核糖核苷酸(2'-MOE)铺平了道路。

然而，用硫代磷酸酯取代磷酸二酯键会在磷原子上产生手性中心。因此，迄今为止，所有经批准的寡核苷酸治疗药物都是大量非对映异构化合物的混合物，具有可能不同(且可能相反)的物理化学性质。虽然现在可以实现单个立体化学定义的硫代磷酸酯寡核苷酸的立体专一性合成(N.Oka,M.Yamamoto,T.Sato,T.Wada,J.Am.Chem.Soc.2008,130,16031-16037)，但在大量可能的非对映异构体中鉴定具有最佳性质的立体异构体仍然是一个挑战。在这种情况下，通过使用非手性硫代磷酸酯键降低非对映异构复杂性是非常令人感兴趣的。引入寡核苷酸中的每个非手性(硫代)磷酸酯键使复杂性降低50％。我们已经研究了各种单硫代酸酯、二硫代酸酯和三硫代酸酯的性质。其中有新颖的对称三硫代酸酯，其中在磷酸酯键内，两个末端氧原子以及先前核苷酸的核糖部分中的5'-位被硫(-O-P(S)

非常出乎意料的是，当将这种对称三硫代酸酯引入寡核苷酸时，不仅降低了整个混合物的非对映异构复杂性，而且我们还发现它们产生了具有改善的治疗特性的分子。

图1示出LTK细胞中Malat-1减少的IC50值

在本说明书中，术语“烷基”在单独或组合下指具有1至8个碳原子的直链或支链烷基、特别是具有1至6个碳原子的直链或支链烷基并且更特别是具有1至4个碳原子的直链或支链烷基。直链和支链C

术语“环烷基”在单独或组合下指具有3至8个碳原子的环烷基环、特别是具有3至6个碳原子的环烷基环。环烷基的实例是环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基和环辛基，更特别是环丙基和环丁基。“环烷基”的一个特定实例是环丙基。

术语“烷氧基”单独或结合表示式烷基-O-的基团，其中术语“烷基”具有先前给出的含义，诸如甲氧基，乙氧基，正丙氧基，异丙氧基，正丁氧基，异丁氧基，仲丁氧基和叔丁氧基。特定的“烷氧基”是甲氧基和乙氧基。甲氧基乙氧基是“烷氧基烷氧基”的一个特定实例。

术语“氧基”在单独或组合下指-O-基团。

术语“链烯基”在单独或组合下指包含烯键和多达8个、优选地多达6个、特别优选多达4个碳原子的直链或支链烃残基。链烯基的实例是乙烯基、1-丙烯基、2-丙烯基、异丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、3-丁烯基和异丁烯基。

术语“炔基”在单独或组合下指包含叁键和多达8个、特别是2个碳原子的直链或支链烃残基。

术语“卤素”或“卤代”在单独或组合下指氟、氯、溴或碘并且特别地指氟、氯或溴，更特别地指氟。与另一种基团组合下，术语“卤代”指经至少一个卤素取代、尤其经一个至五个卤素、特别地一个至四个卤素(即一个、两个、三个或四个卤素)取代的所述基团。

术语“卤代烷基”在单独或组合下指经至少一个卤素取代、尤其经一个至五个卤素、特别地一个至三个卤素取代的烷基。卤代烷基的实例包括单氟、二氟或三氟代的甲基、乙基或丙基，例如3,3,3-三氟丙基、2-氟乙基、2,2,2-三氟乙基、氟代甲基或三氟甲基。氟代甲基、二氟甲基和三氟甲基是特定的“卤代烷基”。

术语“卤代环烷基”在单独或组合下指经至少一个卤素取代、尤其经一个至五个卤素、特别地一个至三个卤素取代的如上定义的环烷基。“卤代环烷基”的特定实例是卤代环丙基，尤其是氟代环丙基、二氟环丙基和三氟环丙基。

术语“羟基”(hydroxyl/hydroxy)在单独或组合下指-OH基团。

术语“氢硫基”和“巯基”在单独或组合下指-SH基团。

术语“羰基”在单独或组合下指-C(O)-基团。

术语“羧基”或“酸性基”在单独或组合下指-COOH基团。

术语“氨基”在单独或组合下指伯氨基(-NH

术语“烷基氨基”在单独或组合下指经一个或两个如上文定义的烷基取代的如上文定义的氨基。

术语“磺酰基”在单独或组合下意指-SO

术语“亚磺酰基”在单独或组合下指-SO-基团。

术语“硫烷基”在单独或组合下指-S-基团。

术语“氰基”在单独或组合下指-CN基团。

术语“叠氮基”在单独或组合下指-N

术语“硝基”在单独或组合下指NO

术语“甲酰基”在单独或组合下指-C(O)H基团。

术语“氨甲酰基”在单独或组合下指-C(O)NH

术语“脲基”在单独或组合下指-NH-C(O)-NH

术语“芳基”在单独或组合下指包含6至10个碳环原子的单价芳族碳环单环系统或双环系统，所述系统可选地经1至3个独立地选自以下的取代基取代：卤素、羟基、烷基、链烯基、炔基、烷氧基、烷氧烷基、链烯氧基、羧基、烷氧羰基、烷基羰基和甲酰基。芳基的实例包括苯基和萘基，特别是苯基。

术语“杂芳基”在单独或组合下指5至12个环原子的单价芳族杂环单环系统或双环系统，所述系统包含1、2、3或4个选自N、O和S的杂原子，剩余环原子是碳，可选地经1至3个独立地选自以下的取代基取代：卤素、羟基、烷基、链烯基、炔基、烷氧基、烷氧烷基、链烯氧基、羧基、烷氧羰基、烷基羰基和甲酰基。杂芳基的实例包括吡咯基、呋喃基、噻吩基、咪唑基、噁唑基、噻唑基、三唑基、噁二唑基、噻二唑基、四唑基、吡啶基、吡嗪基、吡唑基、哒嗪基、嘧啶基、三嗪基、氮杂环庚烯基(azepinyl)、二氮杂环庚烯基(diazepinyl)、异噁唑基、苯并呋喃基、异噻唑基、苯并噻吩基、吲哚基、异吲哚基、异苯并呋喃基、苯并咪唑基、苯并噁唑基、苯并异噁唑基、苯并噻唑基、苯并异噻唑基、苯并噁二唑基、苯并噻二唑基、苯并三唑基、嘌呤基、喹啉基、异喹啉基、喹唑啉基、喹噁啉基、咔唑基或吖啶基。

术语“杂环基”在单独或组合下指4至12个、特别4至9个环原子的单价饱和或部分不饱和单环系统或双环系统，所述系统包含1、2、3或4个选自N、O和S的环杂原子，剩余环原子是碳，可选地经1至3个独立地选自以下的取代基取代：卤素、羟基、烷基、链烯基、炔基、烷氧基、烷氧烷基、链烯氧基、羧基、烷氧羰基、烷基羰基和甲酰基。单环饱和杂环基的实例是氮杂环丁烷基、吡咯烷基、四氢呋喃基、四氢-噻吩基、吡唑烷基、咪唑烷基、噁唑啉基、异噁唑烷基、噻唑烷基、哌啶基、四氢吡喃基、四氢噻喃基、哌嗪基、吗啉基、硫代吗啉基、1,1-二氧代-硫代吗啉-4-基、氮杂环庚烷基、二氮杂环庚烷基、高哌嗪基或氧氮杂环庚烷基。双环饱和杂环烷基的实例是8-氮杂-双环[3.2.1]辛基、奎宁环基、8-氧杂-3-氮杂-双环[3.2.1]辛基、9-氮杂-双环[3.3.1]壬基、3-氧杂-9-氮杂-双环[3.3.1]壬基或3-噻-9-氮杂-双环[3.3.1]壬基。部分不饱和杂环烷基的实例是二氢呋喃基、咪唑啉基、二氢噁唑基、四氢吡啶基或二氢吡喃基。

术语“药用盐”是指那些保留游离碱或游离酸的生物有效性和特性的盐，其并非在生物学上或其它方面所不希望的。这些盐用无机酸诸如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸(特别是盐酸)和有机酸诸如乙酸、丙酸、乙醇酸、丙酮酸、草酸、马来酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲基磺酸、乙基磺酸、对甲苯磺酸、水杨酸、N-乙酰基半胱氨酸形成。此外，这些盐可以通过向游离酸添加无机碱或有机碱制备。衍生自无机碱的盐包括但不限于钠盐、钾盐、锂盐、铵盐、钙盐、镁盐。衍生自有机碱的盐包括但不限于与下述有机碱形成的盐：伯胺、仲胺和叔胺，取代胺包括天然出现的取代胺、环状胺和碱性离子交换树脂，诸如异丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺、乙醇胺、赖氨酸、精氨酸、N-乙基哌啶、哌啶、聚胺树脂。本发明的寡核苷酸也可以呈两性离子的形式存在。特别优选的本发明的药用盐是钠盐、锂盐、钾盐和三烷基铵盐。

单独或组合使用的术语“保护基”表示选择性地封闭多官能化合物中反应位点，从而可以在另一个未保护的反应位点选择性地进行化学反应的基团。保护基可以去除。示例性的保护基是氨基保护基、羧基保护基或羟基保护基。

“磷酸酯保护基”是磷酸酯基团的保护基。磷酸酯保护基的实例是2-氰基乙基和甲基。磷酸酯保护基的一个特定实例是2-氰基乙基。

“羟基保护基”是羟基的保护基并且还用来保护硫醇基。羟基保护基的实例是乙酰基(Ac)、苯甲酰基(Bz)、苄基(Bn)、β-甲氧基乙氧甲基醚(MEM)、二甲氧基三苯甲基(或双-(4-甲氧苯基)苯基甲基)(DMT)、三甲氧基三苯甲基(或三-(4-甲氧苯基)苯基甲基)(TMT)、甲氧甲基醚(MOM)、甲氧三苯甲基[(4-甲氧苯基)二苯基甲基(MMT)、对甲氧苄基醚(PMB)、甲基硫代甲基醚、新戊酰(Piv)、四氢吡喃基(THP)、四氢呋喃(THF)、三苯甲基或三苯基甲基(Tr)、甲硅烷基醚(例如三甲基甲硅烷基(TMS)、叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)、三异丙基甲硅烷氧基甲基(TOM)和三异丙基甲硅烷基(TIPS)醚)、甲醚和乙氧乙基醚(EE)。羟基保护基的特定实例是DMT和TMT，尤其是DMT。

“氢硫基保护基”是氢硫基基团的保护基。氢硫基保护基的实例是“羟基保护基”的那些基团。

如果本发明的起始材料或化合物之一含有一个或多个在一个或多个反应步骤的反应条件下不稳定或有反应性的官能团，则应用本领域熟知的方法，可以在关键步骤之前引入适宜的保护基(如在例如T.W.Greene和P.G.M.Wuts，第3版，1999，Wiley，New York的“有机化学中的保护基(Protective Groups in Organic Chemistry)”中所述)。可以使用文献中描述的标准方法，在合成的晚期移除这类保护基。保护基的实例是叔丁氧羰基(Boc)、9-芴基甲基氨基甲酸酯(Fmoc)、2-三甲基甲硅烷基乙基氨基甲酸酯(Teoc)、苄氧羰基(Cbz)和对甲氧基苄氧羰基(Moz)。

本文所述的化合物可以包含几个非对称中心，并且可以以光学纯的对映异构体、对映异构体的混合物例如外消旋体、非对映异构体的混合物、非对映异构外消旋体或非对映异构外消旋体混合物的形式存在。

寡核苷酸

如本文所用，术语“寡核苷酸”定义为如技术人员通常理解的包含两个或以上共价联接的核苷的分子。这样的共价结合的核苷也可以称为核酸分子或寡聚物。寡核苷酸通常在实验室中通过固相化学合成然后纯化的方式制备。当提及寡核苷酸的序列时，提及的是共价联接的核苷酸或核苷的核碱基部分或其修饰的序列或顺序。本发明的寡核苷酸是人造的，并且是化学合成的，并且通常是纯化或分离的。本发明的寡核苷酸可包含一个或多个修饰的核苷或核苷酸。

反义寡核苷酸

如本文所用，术语“反义寡核苷酸”定义为能够通过与靶核酸，特别是与靶核酸上的邻接序列杂交来调节靶基因的表达的寡核苷酸。反义寡核苷酸基本上不是双链的，因此不是siRNA或shRNA。优选地，本发明的反义寡核苷酸是单链的。应当理解，本发明的单链寡核苷酸可以形成发夹或分子间双链体结构(相同寡核苷酸的两个分子之间的双链体)，只要内部或之间自我互补性的程度跨寡核苷酸全长小于50％即可。

邻接核苷酸序列

术语“邻接核苷酸序列”是指与靶核酸互补的寡核苷酸区域。该术语在本文中与术语“邻接核碱基序列”和术语“寡核苷酸基序序列”互换使用。在一些实施例中，寡核苷酸的所有核苷酸构成邻接核苷酸序列。在一些实施例中，寡核苷酸包含邻接核苷酸序列，诸如F-G-F'缺口聚物区域，并且可以可选地包含其他核苷酸，例如可以用于将官能团附接至邻接核苷酸序列的核苷酸接头区域。核苷酸接头区域可以与靶核酸互补或可以不互补。

核苷酸

核苷酸是寡核苷酸和多核苷酸的结构单元，并且出于本发明的目的，包括天然存在的和非天然存在的核苷酸。实际上，核苷酸诸如DNA和RNA核苷酸包括核糖糖部分、核碱基部分和一个或多个磷酸基团(它们在核苷中不存在)。核苷和核苷酸也可以可互换地称为“单元”或“单体”。

修饰的核苷

如本文所用，术语“修饰的核苷”或“核苷修饰”是指与同等的DNA或RNA核苷相比，通过引入糖部分或(核)碱基部分的一种或多种修饰而被修饰的核苷。在一个优选的实施例中，修饰的核苷包含修饰的糖部分。术语修饰的核苷在本文中还可与术语“核苷类似物”或修饰的“单元”或修饰的“单体”互换使用。具有未修饰的DNA或RNA糖部分的核苷在本文中称为DNA或RNA核苷。如果允许Watson Crick碱基配对，则DNA或RNA核苷的碱基区域中修饰的核苷通常仍称为DNA或RNA。

修饰的核苷间键

如技术人员通常所理解的，术语“修饰的核苷间键”定义为除磷酸二酯(PO)键以外的键，其将两个核苷共价偶联在一起。因此，本发明的寡核苷酸可包含修饰的核苷间键。在一些实施例中，与磷酸二酯键相比，修饰的核苷间键增加了寡核苷酸的核酸酶抗性。对于天然存在的寡核苷酸，核苷间键包括在相邻核苷之间产生磷酸二酯键的磷酸基团。修饰的核苷间键特别可用于稳定寡核苷酸供体内使用，并且可以在本发明寡核苷酸中的DNA核苷或RNA核苷区域(例如在缺口聚物寡核苷酸的缺口区内部)以及在修饰的核苷区域(例如，区域F和区域F')中起到保护免受核酸酶剪切的作用。

在一个实施例中，寡核苷酸包含一个或多个由天然磷酸二酯修饰的核苷间键，例如一个或多个修饰的核苷间键，其例如对核酸酶的攻击更具抗性。核酸酶抗性可以通过在血清中孵育寡核苷酸或通过使用核酸酶抗性测定(例如蛇毒磷酸二酯酶(SVPD))来确定，两者均是本领域中众所周知的。能够增强寡核苷酸的核酸酶抗性的核苷间键称为抗核酸酶核苷间键。在一些实施例中，寡核苷酸或其邻接核苷酸序列中至少50％的核苷间键被修饰，诸如至少60％、诸如至少70％、诸如至少80％、诸如至少90％的寡核苷酸或其邻接核苷酸序列中的核苷间键是抗核酸酶核苷间键。在一些实施例中，寡核苷酸的所有核苷间键或其邻接核苷酸序列都是抗核酸酶核苷间键。应当认识到的是，在一些实施例中，将本发明的寡核苷酸与非核苷酸官能团诸如缀合物连接的核苷可以是磷酸二酯。

用于本发明寡核苷酸中的优选的修饰的核苷间键是硫代磷酸酯。

硫代磷酸酯核苷间键由于核酸酶抗性、有益的药代动力学和易于制造而特别有用。在一些实施例中，寡核苷酸或其邻接核苷酸序列中至少50％的核苷间键是硫代磷酸酯，诸如至少60％、诸如至少70％、诸如至少80％、诸如至少90％的寡核苷酸或其邻接核苷酸序列中的核苷间键是硫代磷酸酯。在一些实施例中，除三硫代磷酸酯核苷间键之外，寡核苷酸或其邻接核苷酸序列的所有核苷间键是硫代磷酸酯。在一些实施例中，除三硫代磷酸酯键之外，本发明的寡核苷酸还包含硫代磷酸酯核苷间键和至少一个磷酸二酯键诸如2、3或4个磷酸二酯键。在缺口聚物寡核苷酸中，当存在时，磷酸二酯键合适地不位于缺口区G中的邻接DNA核苷之间。

抗核酸酶键，诸如硫代磷酸酯键，在与靶核酸形成双链体时能够募集核酸酶的寡核苷酸区域中特别有用，诸如缺口聚物的区域G。然而，硫代磷酸酯键也可用于非核酸酶募集区域和/或亲和力增强区域，诸如缺口聚物的区域F和F'。在一些实施例中，缺口聚物寡核苷酸可在区域F或F'或区域F和F'两者均包含一个或多个磷酸二酯键合，其中区域G中的核苷间键可以完全是硫代磷酸酯。

有利地，在寡核苷酸的邻接核苷酸序列中的全部核苷间键或寡核苷酸的全部核苷间键均是硫代磷酸酯键。

应当认识到，如EP 2 742 135中所公开的，反义寡核苷酸可包含其他核苷间键(除磷酸二酯和硫代磷酸酯以外)，例如烷基膦酸酯/甲基膦酸酯核苷间，其根据EP 2 742 135可以例如在另外的DNA硫代磷酸酯的缺口区域中所耐受。

立构无规硫代磷酸酯键

硫代磷酸酯键是其中非桥接氧之一已经被硫取代的核苷间磷酸酯键。硫对非桥接氧之一的取代引入了手性中心并且从而在单一硫代磷酸酯寡核苷酸内部，每个硫代磷酸酯核苷间键将处于S(Sp)或R(Rp)立体异构形式。此类核苷间键称作“手性核苷间键”。相比之下，磷酸二酯核苷间键是非手性的，因为它们具有两个非末端氧原子。

依据首次发表于以下文献中的标准Cahn-Ingold-Prelog规则(CIP优先规则)确定立构中心手性的命名：Cahn,R.S.；Ingold,C.K.；Prelog,V.(1966)“分子手性规范(Specification of Molecular Chirality)”，Angewandte Chemie InternationalEdition 5(4):385–415，doi:10.1002/anie.196603851。

在标准寡核苷酸合成过程中，偶联和后续硫化的立体选择性不受控。出于这个原因，每个硫代磷酸酯核苷间键的立体化学随机地是Sp或Rp，因而通过传统寡核苷酸合成法产生的硫代磷酸酯寡核苷酸实际上可以按多达2

立体定义的核苷间键

立体定义的核苷间键是在其两种非对映异构体形式Rp或Sp中的一者中具有非对映异构体过量的手性核苷间键。

应当认识到，本领域中使用的立体选择性寡核苷酸合成方法通常在每个手性核苷间键处提供至少约90％或至少约95％的非对映选择性，因此最高约10％诸如约5％的寡核苷酸分子可能具有非对映异构体的替代形式。

在一些实施例中，每个立体定义的手性核苷间键的非对映异构体比率为至少约90:10。在一些实施例中，每个手性核苷间键的非对映异构体比率为至少约95:5。

立体定义的硫代磷酸酯键是立体定义的核苷间键的一个特定实例。

立体定义的硫代磷酸酯键

立体定义的硫代磷酸酯键是在其两种非对映异构体形式Rp或Sp中的一者中具有非对映异构体过量的硫代磷酸酯键。

硫代磷酸酯核苷间键的Rp和Sp构型如下所示

其中3'R基团代表相邻的核苷(5'核苷)的3'位置，而5'R基团代表相邻的核苷(3'核苷)的5'位置。

在本文中，Rp核苷间键也可以表示为srP，并且Sp核苷间键可以表示为ssP。

在一个特定实施例中，每个立体定义的硫代磷酸酯键的非对映体比率为至少约90:10或至少95:5。

在一些实施例中，每个立体定义的硫代磷酸酯键的非对映体比率为至少约97:3。在一些实施例中，每个立体定义的硫代磷酸酯键的非对映体比率为至少约98:2。在一些实施例中，每个立体定义的硫代磷酸酯键的非对映体比率为至少约99:1。

在一些实施例中，立体定义的核苷间键在至少97％诸如至少98％诸如至少99％或(基本上)全部的存在于寡核苷酸分子群内的寡核苷酸分子中具有相同的非对映异构形式(Rp或Sp)。

可以在仅具有非手性骨架(即磷酸二酯)的模型系统中测量非对映体纯度。可通过例如将具有立体定向核苷间键的单体偶联至以下模型系统“5't-po-t-po-t-po 3'”来测量每个单体的非对映体纯度。该测量的结果随后将给出：可使用HPLC分离的5'DMTr-t-srp-t-po-t-po-t-po 3'或5'DMTr-t-ssp-t-po-t-po-t-po 3'。通过积分来自两种可能非对映异构体的UV信号并且得到这些非对映异构体的比率(例如98:2、99:1或>99:1)，确定非对映异构体纯度。

应当理解，特定的单一非对映异构体(单一立体定义的寡核苷酸分子)的非对映异构体纯度将随每个核苷间位置处限定的立体中心的偶联选择性和待引入的立体定义的核苷间键的数目而变化。以举例方式而言，如果每个位置处的偶联选择性是97％，则具有15个立体定义的核苷间键的立体定义的寡核苷酸的所得纯度将是0.97

在一些实施例中，立体定义的寡核苷酸是指寡核苷酸群的至少约40％诸如至少约50％属于所需非对映异构体的寡核苷酸群。

换言之，在一些实施例中，立体定义的寡核苷酸是指寡核苷酸群的至少约40％诸如至少约50％由所需(特定)的立体定义的核苷间键基序(也称作立体定义的基序)组成的寡核苷酸群。

对于包含立构无规核苷间立体中心和立体定义的核苷间立体中心的立体定义的寡核苷酸，参考保留所需的立体定义的核苷间键基序的寡核苷酸群的百分比(％)，确定立体定义的寡核苷酸的纯度，计算时不考虑立构无规键。

核碱基

术语核碱基包括存在于核苷和核苷酸中的嘌呤(例如腺嘌呤和鸟嘌呤)和嘧啶(例如尿嘧啶、胸腺嘧啶和胞嘧啶)部分，其在核酸杂交中形成氢键。在本发明的背景中，术语“核碱基”也涵盖修饰的核碱基，其可以不同于天然存在的核碱基，但是在核酸杂交期间起作用。在此背景中，“核碱基”是指天然存在的核碱基，例如腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、黄嘌呤和次黄嘌呤，以及非天然存在的变体。此类变体例如描述于Hirao等人(2012)Accounts of Chemical Research第45卷第2055页和Bergstrom(2009)CurrentProtocols in Nucleic Acid Chemistry Suppl.37 1.4.1中。

在一些实施例中，通过以下方式修饰核碱基部分：将嘌呤或嘧啶改变为修饰的嘌呤或嘧啶，诸如取代的嘌呤或取代的嘧啶，诸如选自异胞嘧啶、假异胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-噻唑-胞嘧啶、5-丙炔基-胞嘧啶、5-丙炔基-尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-噻唑-尿嘧啶、2-硫代-尿嘧啶、2'-硫代-胸腺嘧啶、肌苷、二氨基嘌呤、6-氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、2,6-二氨基嘌呤和2-氯-6-氨基嘌呤的核碱基。

核碱基部分可以由每一个相应核碱基的字母代码来表示，例如A、T、G、C或U，其中每一个字母可以可选地包括具有同等功能的修饰的核碱基。例如，在示例性的寡核苷酸中，核碱基部分选自A、T、G、C和5-甲基胞嘧啶。可选地，对于LNA缺口聚物，可以使用5-甲基胞嘧啶LNA核苷。

修饰的寡核苷酸

术语“修饰的寡核苷酸”描述了一种寡核苷酸，其包含一个或多个糖修饰的核苷和/或修饰的核苷间键。术语“嵌合”寡核苷酸是在文献中已用于描述具有修饰的核苷的寡核苷酸的术语。

立体定义的寡核苷酸

立体定义的寡核苷酸是一种寡核苷酸，其中至少一个核苷间键是立体定义的核苷间键。

立体定义的硫代磷酸酯寡核苷酸是一种寡核苷酸，其中至少一个核苷间键是立体定义的硫代磷酸酯核苷间键。

互补性

术语“互补性”描述了核苷/核苷酸的Watson-Crick碱基配对的能力。Watson-Crick碱基对是鸟嘌呤(G)-胞嘧啶(C)和腺嘌呤(A)-胸腺嘧啶(T)/尿嘧啶(U)。应当理解的是，寡核苷酸可包含具有修饰的核碱基的核苷，例如，经常使用5-甲基胞嘧啶代替胞嘧啶，因此，术语互补性涵盖未修饰的和修饰的核碱基之间的Watson Crick碱基配对(参见例如Hirao等人(2012)Accounts of Chemical Research第45卷第2055页和Bergstrom(2009)Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry Suppl.37 1.4.1)。

如本文所用，术语“％互补的”是指核酸分子(例如寡核苷酸)中邻接核苷酸序列内核苷酸的比例，其中在给定位置，所述核苷酸与不同的核酸分子(例如靶核酸)在给定位置处的邻接核苷酸序列互补(即与之形成Watson Crick碱基对)。通过以下方式计算百分比：(与靶序列5'-3'和寡核苷酸序列从3'-5'对齐时)计数两个序列之间形成配对的对齐碱基的数目，除以寡核苷酸中核苷酸的总数并且乘以100。在这种比较中，未对准(形成碱基对)的核碱基/核苷酸被称为错配。优选地，计算邻接核苷酸序列的互补性％时不允许插入和缺失。

术语“完全互补”是指100％的互补性。

同一性

如本文所用，术语“同一性”是指核酸分子(例如寡核苷酸)中邻接核苷酸序列以百分比计的核苷酸数目，其中在给定位置，所述核苷酸与不同的核酸分子(例如靶核酸)在给定位置处的邻接核苷酸序列(即在其与互补性核苷形成Watson Crick碱基对的能力方面)相同。通过以下方式计算该百分比：计数两个序列之间相同的对齐碱基的数目，除以寡核苷酸中核苷酸的总数并且乘以100。同一性百分比＝(匹配×100)/对齐区域的长度。优选地，计算邻接核苷酸序列的互补性％时不允许插入和缺失。

杂交

如本文所用，术语“杂交”(hybridizing/hybridizes)应当理解为两条核酸链在相对链上的碱基对之间形成氢键从而形成双链体(例如寡核苷酸和靶核酸)。两条核酸链之间结合的亲和力是杂交的强度。通常用解链温度(T

糖修饰

与DNA和RNA中发现的核糖糖部分相比时本发明的寡聚物可包含一种或多种具有修饰的糖部分(即糖部分的修饰)的核苷。

已经制备了许多具有核糖部分的修饰的核苷，主要目的是改善寡核苷酸的某些性质，诸如亲和力和/或核酸酶抗性。

此类修饰包括以下修饰，其中例如通过用以下取代而修饰核糖环结构：己糖环(HNA)或一般在核糖环上C2和C4碳之间具有双基桥的双环状环(LNA)或一般在C2碳和C3碳之间缺少键的非连接核糖环(例如UNA)。其他糖修饰的核苷包括例如双环己糖核酸(WO2011/017521)或三环核酸(WO 2013/154798)。修饰的核苷还包括其中糖部分被替换为非糖部分的核苷，例如在肽核酸(PNA)或吗啉代核酸的情况下。

糖修饰还包括通过将核糖环上的取代基更改为氢以外的基团或天然存在于DNA和RNA核苷中的2'-OH基团所做出的修饰。例如，可以在2'、3'、4'或5'位置引入取代基。

2'糖修饰的核苷。

A 2'糖修饰的核苷是一种核苷，其在2'位置具有除H或-OH以外的取代基(2'取代的核苷)的核苷或包含能够在核糖环中2'碳与和第二个碳原子之间形成桥的2'连接双基，诸如LNA(2'-4'双基桥连)核苷。

事实上，人们已花费很多精力开发2'取代的核苷，并且发现许多2'取代的核苷并入寡核苷酸后具有有益的特性。例如，2'修饰的糖可以提供增强的结合亲和力和/或增加的对寡核苷酸的核酸酶抗性。2'取代的修饰的核苷实例是2'-O-烷基-RNA、2'-O-甲基-RNA、2'-烷氧基-RNA、2'-O-甲氧乙基-RNA(MOE)、2'-氨基-DNA、2'-氟-RNA和2'-F-ANA核苷。其他实例可参见例如：Freier和Altmann，Nucl.Acid Res.，1997，25，4429-4443；Uhlmann，Curr.Opinion in Drug Development，2000，3(2)，293-213；以及Deleavey和Damha，Chemistry and Biology 2012，19，937。下面是一些2'取代的修饰的核苷的示意图。

关于本发明，2'取代不包括2'桥接的分子如LNA。

锁定核酸核苷(LNA核苷)

“LNA核苷”是一种2'-修饰的核苷，其包含链接所述核苷的核糖环的C2'和C4'的双基(也称为“2'-4'桥”)，其限制或锁定核糖环的构象。这些核苷在文献中也称为桥连核酸或双环核酸(BNA)。将LNA掺入互补RNA或DNA分子的寡核苷酸中时，核糖构象的锁定与杂交的增强亲和力(双链体稳定化)有关。这可以常规地通过测量寡核苷酸/互补双链体的解链温度确定。

非限制性的示例性LNA核苷公开于WO 99/014226、WO 00/66604、WO 98/039352、WO2004/046160、WO 00/047599、WO 2007/134181、WO 2010/077578、WO 2010/036698、WO2007/090071、WO 2009/006478、WO 2011/156202、WO 2008/154401、WO 2009/067647、WO2008/150729、Morita等人(Bioorganic&Med.Chem.Lett.12,73-76,Seth等人J.Org.Chem.2010,Vol 75(5)pp.1569-81)和Mitsuoka等人(Nucleic Acids Research2009,37(4),1225-1238)。

2'-4'桥键包含2至4个桥接原子，并且特别地具有式-X-Y-，其中X与C4'连接并且Y与C2'连接，

其中

X为氧、硫、-CR

Y为氧、硫、-(CR

条件是-X-Y-不为-O-O-、Si(R

J为氧、硫、＝CH

R

或两个偕R

或两个偕R

其中取代的烷基、取代的链烯基、取代的炔基、取代的烷氧基和取代的亚甲基是经1至3个取代基取代的烷基、链烯基、炔基和亚甲基，所述取代基独立地选自卤素、羟基、烷基、链烯基、炔基、烷氧基、烷氧烷基、链烯氧基、羧基、烷氧羰基、烷基羰基、甲酰基、杂环基、芳基和杂芳基；

X

R

n为1、2或3。

在本发明的又一个特定实施例中，X为氧、硫、-NR

在本发明的另一个特定实施例中，Y为-CR

在本发明的一个特定实施例中，-X-Y-为-O-(CR

在本发明的一个特定实施例中，R

在本发明的另一个特定实施例中，R

有利地，-X-Y-的R

在本发明的又一个特定实施例中，R

在本发明的另一个特定实施例中，R

在本发明的一个特定实施例中，R

在本发明的一个特定实施例中，R

在本发明的一个特定实施例中，R

在本发明的一个特定实施例中，R

在本发明的一个特定实施例中，-X-Y-为-O-CH

在本发明的一个特定实施例中，-X-Y-为-O-CR

在一个特定实施例中，-X-Y-为-O-CH

2'-4'桥键可以位于核糖环平面的下方(β-D-构型)，或位于该环平面的上方(α-L-构型)，分别如式(A)和式(B)中所示。

根据本发明所述的LNA核苷特别地具有式(B1)或式(B2)

其中

W为氧、硫、-N(R

B为核碱基或修饰的核碱基；

Z为至相邻核苷的核苷间键或5'末端基团；

Z*为至相邻核苷的核苷间键或3'末端基团；

R

X、Y、R

在一个特定实施例中，在-X-Y-的定义中，R

在又一个特定实施例中，在X的定义中，R

在又一个特定实施例中，在Y的定义中，R

在本发明的一个特定实施例中，R

在本发明的又一个特别有利的实施例中，R

在本发明的另一个特定实施例中，R

在本发明的一个特定实施例中，R

在本发明的一个特定实施例中，-X-Y-为-O-CH

在本发明的另一个特定实施例中，-X-Y-为-S-CH

在本发明的另一个特定实施例中，-X-Y-为-NH-CH

在本发明的另一个特定实施例中，-X-Y-为-O-CH

在本发明的另一个特定实施例中，-X-Y-为-O-CH

在本发明的另一个特定实施例中，-X-Y-为-O-CR

在本发明的另一个特定实施例中，-X-Y-为-O-CHR

在本发明的另一个特定实施例中，-X-Y-为-O-CH(CH

在本发明的另一个特定实施例中，-X-Y-为-O-CH(CH

在本发明的另一个特定实施例中，-X-Y-为-O-CH(CH

在本发明的另一个特定实施例中，-X-Y-为-O-CH(CH

在本发明的另一个特定实施例中，-X-Y-为-O-CH

在本发明的另一个特定实施例中，-X-Y-为-O-CH(CH

在本发明的另一个特定实施例中，-X-Y-为-O-CR

在本发明的另一个具体实施例中，-X-Y-为-S-CHR

在本发明的一个特定实施例中，-X-Y-为-C(＝CH

在本发明的一个特定实施例中，-X-Y-为-N(OR

在本发明的一个特定实施例中，-X-Y-为-O-N(R

在本发明的一个特定实施例中，-X-Y-为-O-N(CH

在本发明的一个特定实施例中，R

在本发明的一个特定实施例中，-X-Y-为-CR

在本发明的一个特定实施例中，-X-Y-为-O-CR

应当认识到，除非另外说明，否则LNA核苷可处于β-D或α-L立体异构形式。

本发明的LNA核苷的特定实例在方案1中给出(其中B如上所定义)。

方案1

特定的LNA核苷为β-D-氧基-LNA、6'-甲基-β-D-氧基LNA诸如(S)-6'-甲基-β-D-氧基-LNA((S)-cET)和ENA。

核糖核酸酶H活性和募集

反义寡核苷酸的核糖核酸酶H活性是指其与互补RNA分子形成双链体时募集核糖核酸酶H的能力。WO01/23613提供了用于确定核糖核酸酶H活性的体外方法，其可以用于确定募集核糖核酸酶H的能力。如果寡核苷酸在提供互补靶核酸序列时具有的初始速率是使用WO01/23613(通过引用并入本文)示例91至95提供的方法测量(以pmol/l/min计)具有与所测试修饰的寡核苷酸相同的碱基序列但仅包含在寡核苷酸中所有单体之间均具有硫代磷酸酯键合的DNA单体的寡核苷酸初始速率的至少5％，诸如至少10％或超过20％时，则一般认为能够募集核糖核酸酶H。为了用于确定核糖核酸酶H活性，可从Lubio Science GmbH,Lucerne,Switzerland获得重组人核糖核酸酶H1。

缺口聚物

本发明的反义寡核苷酸或其邻接核苷酸序列可以是缺口聚物。反义缺口聚物一般用于通过核糖核酸酶H介导的降解来抑制靶核酸。缺口聚物寡核苷酸包含至少三个不同的结构区域，分别为“5->3”方向的5'侧翼、缺口和3'侧翼F-G-F'。“缺口”区域(G)包含一段使寡核苷酸能够募集核糖核酸酶H的邻接DNA核苷酸。该缺口区域的侧翼是包含一个或多个糖修饰的核苷(优选地是高亲和力糖修饰的核苷)的5'侧翼区域(F)，以及包含一个或多个糖修饰的核苷(优选地是高亲和力糖修饰的核苷)的3'侧翼区域(F')。区域F和F'中的一个或多个糖修饰的核苷增强寡核苷酸对靶核酸的亲和力(即，亲和力增强的糖修饰的核苷)。在一些实施例中，区域F和F'中的一个或多个糖修饰的核苷是2'糖修饰的核苷，诸如高亲和力的2'糖修饰、诸如独立地选自LNA和2'-MOE。

在缺口聚物设计中，缺口区域的5'和3'最末端核苷是DNA核苷，分别位于5'(F)或3'(F')区域的糖修饰核苷附近。侧翼可进一步定义为在距缺口区域最远的末端，即在5'侧翼的5'端和3'侧翼的3'端，具有至少一个糖修饰的核苷。

区域F-G-F'形成邻接核苷酸序列。本发明的反义寡核苷酸或其邻接核苷酸序列可包含式F-G-F'的缺口聚物区域。

缺口聚物设计F-G-F′的总长度可以是例如12个至32个核苷，诸如13个至24个核苷、诸如14个至22个核苷、诸如14个至17个核苷、诸如16个至18个核苷。

举例来说，本发明的缺口聚物寡核苷酸可以由下式表示：

F

F

前提条件是缺口聚物区域F-G-F'的总长度至少为12个，诸如至少14个核苷酸。

以下进一步定义了区域F、G和F'，并且可以将其掺入到F-G-F'式中。

缺口聚物-区域G

缺口聚物的区域G(缺口区域)是核苷的区域，其使得寡核苷酸能够募集核糖核酸酶H诸如人核糖核酸酶H1，通常是DNA核苷。核糖核酸酶H是一种细胞酶，其识别DNA和RNA之间的双链体，并酶切裂解RNA分子。合适的缺口聚物可具有长度至少5个或6个邻接DNA核苷、诸如5-16个邻接DNA核苷、诸如6-15个邻接DNA核苷、诸如7-14个邻接DNA核苷、诸如8-12个邻接DNA核苷酸、诸如8-12个邻接DNA核苷的缺口区(G)。在一些实施例中，缺口区G可由6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16个邻接DNA核苷组成。在一些实例下，缺口区中的胞嘧啶(C)DNA可以甲基化，此类残基标记为5-甲基-胞嘧啶(

在一些实施例中，缺口区G可由6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16个邻接的硫代磷酸酯连接的DNA核苷组成。在一些实施例中，缺口中的所有核苷间键是硫代磷酸酯键。

尽管常规的缺口聚物具有DNA缺口区域，但是有许多修饰核苷的实例，当所述核苷在缺口区域内使用时，它们可以募集核糖核酸酶H。已报道当包含在缺口区域内时能够募集核糖核酸酶H的修饰的核苷包括，例如，α-L-LNA、C4'烷基化的DNA(如PCT/EP2009/050349和Vester等人，Bioorg.Med.Chem.Lett.18(2008)2296-2300，两者均通过引用并入本文)、阿拉伯糖衍生的核苷例如ANA和2'F-ANA(Mangos等人，2003J.AM.CHEM.SOC.125,654-661)、UNA(非锁定核酸)(如Fluiter等人，Mol.Biosyst.,2009,10,1039中所述，通过引用并入本文)。UNA是非锁定核酸，通常是核糖的C2和C3之间的键已被去除，形成未锁定的“糖”残基。用于这种缺口聚物中的修饰的核苷可以是当被引入缺口区域时采用2'内式(类DNA)结构的核苷，即允许核糖核酸酶H募集的修饰)。在一些实施例中，本文所述的DNA缺口区域(G)可以可选地包含1个至3个糖修饰的核苷，所述核苷当被引入缺口区域时采用2'内式(类DNA)结构。

区域G-“缺口破坏者”

另选地，存在向缺口聚物的缺口区插入赋予3'内式构象的修饰的核苷，同时保留某种核糖核酸酶H活性的众多报告。此类具有以下缺口区的缺口聚物称作“缺口破坏者(gap-breaker)”或“妨碍缺口的(gap-disrupted)”缺口聚物，该缺口区包含一个或多个3'内式修饰的核苷，参见例如WO2013/022984。缺口破坏者寡核苷酸在缺口区内部保留足够的DNA核苷区域以允许募集核糖核酸酶H。缺口破坏者寡核苷酸设计募集核糖核酸酶H的能力一般具有序列特异性或甚至化合物特异性–参见Rukov等人2015 Nucl.Acids Res.Vol.43pp.8476-8487，该文献公开了在一些情况下提供更特异的靶RNA切割作用的募集核糖核酸酶H的“缺口破坏者”寡核苷酸。用于缺口破坏者寡核苷酸的缺口区内部的修饰的核苷可例如为赋予3'内式构象的修饰的核苷诸如2'-O-甲基(OMe)或2'-O-MOE(MOE)核苷或β-D LNA核苷(核苷的核糖糖环的C2'和C4'之间的桥处于β构象)诸如β-D-氧基LNA或ScET核苷。

与包含上述区域G的缺口聚物一样，缺口破坏者缺口聚物或妨碍缺口的缺口聚物的缺口区在缺口的5'末端具有DNA核苷(与区域F的3'核苷相邻)并且在缺口的3'末端具有DNA核苷(与区域F'的5'核苷相邻)。包含妨碍缺口的缺口聚物一般在缺口区的5'末端或3'末端保留至少3或4个邻接DNA核苷的区域。

缺口破坏者寡核苷酸的示例性设计包括

F

F

F

其中区域G处于括号[Dn-Er-Dm]内，D为邻接DNA核苷序列，E为经修饰的核苷(缺口破坏者或妨碍缺口的核苷)，并且F和F'为本文所定义的侧翼区，并且条件是缺口聚物区域F-G-F'的总体长度为至少12个诸如至少14个核苷酸。

在一些实施例中，妨碍缺口的缺口聚物的区域G包含至少6个DNA核苷，诸如6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16个DNA核苷。如前文所述，DNA核苷可以是邻接的或者可以可选地散布有一个或多个经修饰的核苷，条件是缺口区G能够介导核糖核酸酶H募集。

缺口聚物-侧翼区域，F和F'

区域F紧邻区域G的5'DNA核苷。区域F的3'最末端核苷是糖修饰的核苷，诸如高亲和力糖修饰的核苷，例如2'取代的核苷，诸如MOE核苷或LNA核苷。

区域F'紧邻区域G的3'DNA核苷。区域F'的5'最末端核苷是糖修饰的核苷，诸如高亲和力糖修饰的核苷，例如2'取代的核苷，诸如MOE核苷或LNA核苷。

区域F的长度为1-8个邻接核苷酸，诸如长度为2-6个诸如3-4个邻接核苷酸。优选地，区域F的5'最末端核苷是糖修饰的核苷。在一些实施例中，区域F的两个5'最末端核苷是糖修饰的核苷。在一些实施例中，区域F的5'最末端核苷是LNA核苷。在一些实施例中，区域F的两个5'最末端核苷是LNA核苷。在一些实施例中，区域F的两个5'最末端核苷是2'取代的核苷，诸如两个3'MOE核苷。在一些实施例中，区域F的5'最末端核苷是2'取代的核苷，诸如MOE核苷。

区域F'的长度为2-8个邻接核苷酸，诸如长度为3-6个诸如4-5个邻接核苷酸。优选地的是，在实施例中，区域F'的3'最末端核苷是糖修饰的核苷。在一些实施例中，区域F'的两个3'最末端核苷是糖修饰的核苷。在一些实施例中，区域F'的两个3'最末端核苷是LNA核苷。在一些实施例中，区域F'的3'最末端核苷是LNA核苷。在一些实施例中，区域F'的两个3'最末端核苷是2'取代的核苷，诸如两个3'MOE核苷。在一些实施例中，区域F'的3'最末端核苷是2'取代的核苷，诸如MOE核苷。

应当注意，当区域F或F′的长度为一时，优选地，它是LNA核苷。

在一些实施例中，区域F和F′独立地由糖修饰的核苷的邻接序列组成或包含糖修饰的核苷的邻接序列。在一些实施例中，区域F的糖修饰的核苷可独立地选自2'-O-烷基-RNA单元、2'-O-甲基-RNA、2'-氨基-DNA单元、2'-氟-DNA单元、2'-烷氧基-RNA、MOE单元、LNA单元、阿拉伯糖核酸(ANA)单元和2'-氟-ANA单元。

在一些实施例中，区域F和F′独立地包含LNA和2′取代的修饰核苷两者(混合型翼设计)。

在一些实施例中，区域F和F′仅由一种类型的糖修饰的核苷组成，诸如仅由MOE组成或仅由β-D-氧基LNA组成或仅由ScET组成。这样的设计也称为均匀侧翼或均匀缺口聚物设计。

在一些实施例中，区域F或F′或者F和F′的所有核苷均为LNA核苷，诸如独立地选自β-D-氧基LNA、ENA或ScET核苷。在一些实施例中，区域F由1-5个，诸如2-4个、诸如3-4个、诸如1个、2个、3个、4个或5个邻接LNA核苷组成。在一些实施例中，区域F和F′的所有核苷都是β-D-氧基LNA核苷。

在一些实施例中，区域F或F'或者F和F'的所有核苷都是2'取代的核苷，诸如OMe或MOE核苷。在一些实施例中，区域F由1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个或8个邻接OMe或MOE核苷组成。在一些实施例中，仅一个侧翼区域可以由2′取代的核苷，诸如OMe或MOE核苷组成。在一些实施例中，5'(F)侧翼区域由2'取代的核苷诸如OMe或MOE核苷组成，而3'(F')侧翼区域包含至少一个LNA核苷，诸如β-D-氧基LNA核苷或cET核苷。在一些实施例中，3'(F')侧翼区域由2'取代的核苷，诸如OMe或MOE核苷组成，而5'(F)侧翼区域包含至少一个LNA核苷，诸如β-D-氧基LNA核苷或cET核苷。

在一些实施例中，区域F和F'的所有修饰的核苷都是LNA核苷，诸如独立地选自β-D-氧基LNA、ENA或ScET核苷，其中区域F或F'或者F和F'可以可选地包含DNA核苷(交替侧翼，有关更多详细信息，请参见这些的定义)。在一些实施例中，区域F和F'的所有修饰核苷均为β-D-氧基LNA核苷，其中区域F或F'或者F和F'可以可选地包含DNA核苷(交替侧翼，有关更多详细信息，请参见这些的定义)。

在一些实施例中，区域F和F'的5'和3'最末端核苷是LNA核苷，诸如β-D-氧基LNA核苷或ScET核苷。

在一些实施例中，区域F和区域G之间的核苷间键是硫代磷酸酯核苷间键。在一些实施例中，区域F'和区域G之间的核苷间键是硫代磷酸酯核苷间键。在一些实施例中，区域F或F′、F和F′的核苷之间的核苷间键是硫代磷酸酯核苷间键。

其他缺口聚物设计公开于WO 2004/046160、WO 2007/146511和WO 2008/113832中，这些专利据此以引用方式并入本文。

LNA缺口聚物

LNA缺口聚物是其中区域F和F'中的一者或两者包含LNA核苷或由LNA核苷组成的缺口聚物。β-D-氧基缺口聚物是其中区域F和F'中的一者或两者包含β-D-氧基LNA核苷或由其组成的缺口聚物。

在一些实施例中，LNA缺口聚物具有下式：[LNA]

MOE缺口聚物

MOE缺口聚物是其中区域F和F′由MOE核苷组成的缺口聚物。在一些实施例中，MOE缺口聚物设计为[MOE]

混合型翼缺口聚物

混合型翼缺口聚物为以下LNA缺口聚物，其中区域F和区域F'中的一者或两者包含2'取代的核苷，诸如独立地选自由以下项组成的组中的2'取代的核苷：2'-O-烷基-RNA单元、2'-O-甲基-RNA、2'-氨基-DNA单元、2'-氟-DNA单元、2'-烷氧基-RNA、MOE单元、阿糖核酸(ANA)单元和2'-氟-ANA单元诸如MOE核苷。在其中区域F和F'中的至少一者或区域F和F'两者都包含至少一个LNA核苷的一些实施例中，区域F和F'的其余核苷独立地选自由MOE和LNA组成的组。在其中区域F和F'中的至少一者或区域F和F'两者都包含至少两个LNA核苷的一些实施例中，区域F和F'的其余核苷独立地选自由MOE和LNA组成的组。在一些混合型翼的实施例中，区域F和F′中的一者或两者可进一步包含一个或多个DNA核苷。

混合型翼缺口聚物设计公开于WO 2008/049085和WO 2012/109395中，这两件专利均据此以引用方式并入本文。

交替性侧翼缺口聚物

侧翼区域可以包含LNA和DNA核苷两者，并被称为“交替侧翼”，因为它们包含LNA-DNA-LNA核苷的交替基序。包括这样的交替侧翼的缺口聚物被称为“交替侧翼缺口聚物”。因此，“交替性侧翼缺口聚物”是LNA缺口聚物寡核苷酸，其中至少一个侧翼(F或F')除LNA核苷以外还包含DNA。在一些实施例中，区域F或F'中的至少一者或区域F和F'两者既包含LNA核苷又包含DNA核苷。在这样的实施例中，侧翼区域F或F'，或F和F'两者都包含至少三个核苷，其中F和/或F'区域的5'和3'最末端核苷是LNA核苷。

交替性侧翼LNA缺口聚物公开于WO 2016/127002中。

交替侧翼区域可包含最多3个邻接DNA核苷，例如1至2个或1个或2个或3个邻接DNA核苷。

可以将交替性侧翼标记为一系列整数，其代表LNA核苷(L)的数目，随后是DNA核苷(D)的数目，例如

[L]

[L]

在寡核苷酸设计中，这些将经常表示为数字，使得2-2-1代表5'[L]

[L]

[L]

[L]

条件是缺口聚物的总体长度为至少12个诸如至少14个核苷酸。

寡核苷酸中的区域D'或D”

在一些实施例中，本发明的寡核苷酸可以包含以下项或由其组成：与靶核酸互补的寡核苷酸的邻接核苷酸序列，诸如缺口聚物F-G-F′，以及另外的5′和/或3′核苷。另外的5'和/或3'核苷可以与靶核酸完全互补或可以不与靶核酸完全互补。这种另外的5'和/或3'核苷在本文中可以称为区域D'和D”。

出于将邻接核苷酸序列(诸如缺口聚物)与缀合物部分或另一个官能团接合的目的，可以使用添加区域D'或D”。当用于将邻接核苷酸序列与缀合物部分接合时，其可用作可生物裂解的接头。可替代地，它可以用于提供核酸外切酶保护或使合成或制造变得容易。

可以将区域D'和D”分别附接于区域F的5'端或区域F'的3'端，以生成下式D'-F-G-F'、F-G-F'-D”或

D'-F-G-F'-D”的设计。在这种情况下，F-G-F'是寡核苷酸的缺口聚物部分，而区域D'或D”构成寡核苷酸的单独部分。

区域D'或D”可以独立地包含1个、2个、3个、4个或5个另外的核苷酸或由其组成，它们可以与靶核酸互补或不互补。与F或F′区域相邻的核苷酸不是糖修饰的核苷酸，诸如DNA或RNA或这些的碱基修饰形式。D'或D”区域可以用作核酸酶敏感的可生物裂解的接头(参见接头的定义)。在一些实施例中，另外的5'和/或3'端核苷酸与磷酸二酯键联接，并且是DNA或RNA。WO 2014/076195中公开了适合用作区域D'或D”的基于核苷酸的生物可切割接头，其以举例方式包括磷酸二酯连接的DNA二核苷酸。WO 2015/113922中公开了生物可切割接头在多-寡核苷酸构建体中的用途，其中它们用来连接单个寡核苷酸内部的多个反义构建体(例如缺口聚物区域)。

在一个实施例中，本发明的寡核苷酸除构成缺口聚物的邻接核苷酸序列外还包含区域D'和/或D”。

在一些实施例中，本发明的寡核苷酸可以由下式表示：

F-G-F'，特别是F

D'-F-G-F'，特别是D'

F-G-F'-D”，特别是F

D'-F-G-F'-D”，特别是D'

在一些实施例中，位于区域D'和区域F之间的核苷间键是磷酸二酯键。在一些实施例中，位于区域F'和区域D'之间的核苷间键是磷酸二酯键。

全聚物

在一些实施例中，寡核苷酸或其邻接核苷酸序列的全部核苷均为糖修饰的核苷。此类寡核苷酸在本文中称为全聚物。

在一些实施例中，全聚物的全部糖修饰的核苷包含相同的糖修饰，例如，它们可以全部是LNA核苷，或可以全部是2'O-MOE核苷。在一些实施例中，全聚物的糖修饰的核苷可独立地选自LNA核苷和2'取代的核苷，诸如选自由以下项组成的组中的2'取代的核苷：2'-O-烷基-RNA、2'-O-甲基-RNA、2'-烷氧基-RNA、2'-O-甲氧乙基-RNA(MOE)、2'-氨基-DNA、2'-氟-RNA和2'-F-ANA核苷。在一些实施例中，寡核苷酸包含LNA核苷和2'取代的核苷，诸如选自由以下项组成的组中的2'取代的核苷：2'-O-烷基-RNA、2'-O-甲基-RNA、2'-烷氧基-RNA、2'-O-甲氧乙基-RNA(MOE)、2'-氨基-DNA、2'-氟-RNA和2'-F-ANA核苷。在一些实施例中，寡核苷酸包含LNA核苷和2'-O-MOE核苷。在一些实施例中，寡核苷酸包含(S)cET LNA核苷和2'-O-MOE核苷。在一些实施例中，寡核苷酸的每个核苷单元为2'取代的核苷。在一些实施例中，寡核苷酸的每个核苷单元为2'-O-MOE核苷。

在一些实施例中，寡核苷酸或其邻接核苷酸序列的全部核苷是LNA核苷，诸如β-D-氧基-LNA核苷和/或(S)cET核苷。在一些实施例中，此类LNA全聚物寡核苷酸的长度介于7和12个核苷(参见例如WO 2009/043353)。此类短的完整LNA寡核苷酸在抑制微小RNA方面特别有效。

多种全聚物化合物作为治疗用寡聚物时非常有效，特别是在靶向微小RNA(抗miR)或作为剪接转换寡聚物(SSO)时。

在一些实施例中，全聚物包含至少一个XYX或YXY序列基序诸如重复序列XYX或YXY或由其组成，其中X是LNA并且Y是替代(即非LNA)核苷酸类似物，诸如2'-OMe RNA单元和2'-氟DNA单元。在一些实施例中，以上序列基序可为例如XXY、XYX、YXY或YYX。

在一些实施例中，全聚物可包含介于7个和24个核苷酸之间诸如7、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或23个核苷酸的邻接核苷酸序列或由其组成。

在一些实施例中，全聚物的邻接核苷酸序列包含至少30％、诸如至少40％、诸如至少50％、诸如至少60％、诸如至少70％、诸如至少80％、诸如至少90％、诸如95％、诸如100％的LNA单元。对于完全LNA化合物，有利的是它们的长度小于12个诸如7-10个核苷酸。

剩余单元可选自本文中提及的非LNA核苷酸类似物，诸如选自由以下项组成的组中的那些：2'-O-烷基-RNA单元、2'-OMe-RNA单元、2'-氨基-DNA单元、2'-氟-DNA单元、LNA单元、PNA单元、HNA单元、INA单元和2'MOE RNA单元或2'-OMe RNA单元和2'-氟DNA单元。

混聚物

术语“混聚物”是指包含DNA核苷和糖修饰的核苷二者的寡聚物，其中存在募集核糖核酸酶H的不足长度的邻接DNA核苷。合适的混聚物可包含多达3个或多达4个邻接DNA核苷。在一些实施例中，混聚物或其连续核苷酸序列包含交替的糖修饰的核苷区域和DNA核苷区域。通过并入寡核苷酸时与短DNA核苷区域形成RNA样(3'内式)构象的糖修饰的核苷的交替区域，可以制备不募集核糖核酸酶H的寡核苷酸。有利地，糖修饰的核苷是增强亲和力的糖修饰的核苷。

寡核苷酸混聚物通常用于提供基于占据对靶基因(诸如剪接调节物或微小RNA抑制物)的调节作用。

在一些实施例中，混聚物或其邻接核苷酸序列中的糖修饰的核苷包含或全部是LNA核苷，诸如(S)cET或β-D-氧基LNA核苷。

在一些实施例中，混聚物的全部糖修饰的核苷包含相同的糖修饰，例如，它们可以全部是LNA核苷，或可以全部是2'O-MOE核苷。在一些实施例中，混聚物的糖修饰的核苷可独立地选自LNA核苷和2'取代的核苷，诸如选自由以下项组成的组中的2'取代的核苷：2'-O-烷基-RNA、2'-O-甲基-RNA、2'-烷氧基-RNA、2'-O-甲氧乙基-RNA(MOE)、2'-氨基-DNA、2'-氟-RNA和2'-F-ANA核苷。在一些实施例中，寡核苷酸包含LNA核苷和2'取代的核苷，诸如选自由以下项组成的组中的2'取代的核苷：2'-O-烷基-RNA、2'-O-甲基-RNA、2'-烷氧基-RNA、2'-O-甲氧乙基-RNA(MOE)、2'-氨基-DNA、2'-氟-RNA和2'-F-ANA核苷。在一些实施例中，寡核苷酸包含LNA核苷和2'-O-MOE核苷。在一些实施例中，寡核苷酸包含(S)cET LNA核苷和2'-O-MOE核苷。

在一些实施例中，混聚物或其连续核苷酸序列仅包含LNA和DNA核苷，此类LNA混聚物寡核苷酸的长度可介于例如8个和24个核苷之间(参见例如WO2007112754，其公开了微小RNA的LNA抗miR抑制剂)。

多种混聚物化合物作为治疗用寡聚物时非常有效，特别是在靶向微小RNA(抗miR)或作为剪接转换寡聚物(SSO)时。

在一些实施例中，混聚物包含以下基序

…[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m…或

…[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m…或

…[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m…或

…[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m[D]n[L]m…

其中L代表糖修饰的核苷诸如LNA或2'取代的核苷(例如2'-O-MOE)，D代表DNA核苷，并且其中每个m独立地选自1-6，并且每个n独立地选自1、2、3和4，诸如1-3。在一些实施例中，每个L为LNA核苷。在一些实施例中，至少一个L为LNA核苷，并且至少一个L为2'-O-MOE核苷。在一些实施例中，每个L独立地选自：LNA和2'-O-MOE核苷。

在一些实施例中，混聚物可包含介于10个和24个核苷酸之间诸如11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或23个核苷酸的邻接核苷酸序列或由其组成。

在一些实施例中，混聚物的邻接核苷酸序列包含至少30％诸如至少40％诸如至少50％的LNA单元。

在一些实施例中，混聚物包含核苷酸类似物和天然存在的核苷酸重复模式的邻接核苷酸序列或一种类型的核苷酸类似物和第二类型的核苷酸类似物或由其组成。该重复模式可例如为：每个第二或每个第三核苷酸为核苷酸类似物诸如LNA，并且剩余核苷酸为天然存在的核苷酸诸如DNA，或可以为2'取代的核苷酸类似物，如本文所提及的2'氟类似物的2'MOE，或在一些实施例中，选自本文中提及的核苷酸类似物群组。应当认识到，核苷酸类似物诸如LNA单元的重复模式可与固定位置处(例如5'或3'末端)的核苷酸类似物组合。

在一些实施例中，从3'末端计数，寡聚物的第一核苷酸为核苷酸类似物，诸如LNA核苷酸或2'-O-MOE核苷。

在可以相同或不同的一些实施例中，从3'末端计数，寡聚物的第二核苷酸为核苷酸类似物，诸如LNA核苷酸或2'-O-MOE核苷。

在可以相同或不同的一些实施例中，寡聚物的5'末端为核苷酸类似物，诸如LNA核苷酸或2'-O-MOE核苷。

在一些实施例中，混聚物包含至少一个区域，该区域包含至少两个连续核苷酸类似物单元诸如至少两个连续LNA单元。

在一些实施例中，混聚物包含至少一个区域，该区域包含至少三个连续核苷酸类似物单元诸如至少三个连续LNA单元。

缀合物

如本文所用，术语“缀合物”是指与非核苷酸部分(缀合物部分或区域C或第三区域)共价联接的寡核苷酸。

本发明的寡核苷酸与一个或多个非核苷酸部分的缀合可以改善该寡核苷酸的药理学，例如，通过影响寡核苷酸的活性、细胞分布、细胞吸收或稳定性实现。在一些实施例中，缀合物部分通过改善寡核苷酸的细胞分布、生物利用度、代谢、排泄、渗透性和/或细胞摄取来修饰或增强寡核苷酸的药代动力学性质。特别地，缀合物可使寡核苷酸靶向特定的器官、组织或细胞类型，并且由此增强寡核苷酸在这种器官、组织或细胞类型中的有效性。同时，缀合物可用于降低寡核苷酸在非靶细胞类型、组织或器官中的活性，例如脱靶活性或在非靶细胞类型、组织或器官中的活性。

WO 93/07883和WO 2013/033230提供了合适的缀合物部分，这两件专利据此以引用方式并入本文。其他合适的缀合物部分是那些能够结合脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)的缀合物部分。特别地，三价N-乙酰半乳糖胺缀合物部分适用于与ASGPR结合，参见例如WO2014/076196、WO 2014/207232和WO 2014/179620(通过引用并入本文)。此类缀合物用于增强肝脏对寡核苷酸的摄取，同时减少寡核苷酸在肾脏中的存在，从而与相同寡核苷酸的非缀合形式相比，增加缀合寡核苷酸的肝脏/肾脏比率。

寡核苷酸缀合物及其合成也在Manoharan于Antisense Drug Technology,Principles,Strategies,and Applications,S.T.Crooke编辑，第16章，Marcel Dekker,Inc.,2001中所作综述和Manoharan,Antisense and Nucleic Acid Drug Development,2002,12,103中报导，上述文献各自通过引用整体并入本文。

在一个实施例中，非核苷酸部分(缀合物部分)选自由以下项组成的组：糖、细胞表面受体配体、药物、激素、亲脂物质、聚合物、蛋白质、肽、毒素(例如细菌毒素)、维生素、病毒蛋白(例如衣壳)或它们的组合。

接头

键或接头是两个原子之间的连接，其经由一个或多个共价键将一个目标化学基团或区段与另一个目标化学基团或区段联接。缀合物部分可直接或通过联接部分(例如接头或系链)附接于寡核苷酸。接头用于将第三区域诸如缀合物部分(区域C)与第一区域共价连接，该第一区域例如与靶核酸互补的寡核苷酸或邻接核苷酸序列(区域A)。

在本发明的一些实施例中，本发明的缀合物或寡核苷酸缀合物可以可选地包含位于与靶核酸互补的寡核苷酸或邻接核苷酸序列(区域A或第一区域)和缀合物部分(区域C或第三区域)之间的接头区域(第二区域或区域B和/或区域Y)。

区域B是指包含生理上不稳定的键或由其组成的可生物裂解的接头，该键在哺乳动物体内通常遇到的条件下或与之相似的条件下可裂解。生理上不稳定的接头经历化学转化(例如裂解)的条件包括化学条件，诸如pH、温度、氧化或还原条件或试剂，以及在哺乳动物细胞中遇到的盐浓度或与之相似的盐浓度。哺乳动物细胞内条件还包括通常存在于哺乳动物细胞中的酶活性，诸如来自蛋白水解酶或水解酶或核酸酶的酶活性。在一个实施例中，可生物裂解的接头对S1核酸酶裂解敏感。在一个优选的实施例中，对核酸酶敏感的接头包含介于1个至10个核苷，诸如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个核苷，更优选地包含介于2个至6个核苷，并且最优选地包含介于2个至4个联接的核苷，该核苷包含至少两个连续的磷酸二酯键，诸如至少3个或4个或5个连续的磷酸二酯键。优选地，核苷是DNA或RNA。包含磷酸二酯的可生物裂解的接头更加详细地描述于WO 2014/076195(通过引用并入本文)中。

区域Y是指不必为可生物裂解的但主要用于将缀合物部分(区域C或第三区域)共价连接至寡核苷酸(区域A或第一区域)的接头。区域Y接头可包含重复单元诸如乙二醇单元、氨基酸单元或氨基烷基的链结构或寡聚物。本发明的寡核苷酸缀合物可以由以下区域性元件A-C、A-B-C、A-B-Y-C、A-Y-B-C或A-Y-C构成。在一些实施例中，接头(区域Y)为氨基烷基诸如C2-C36氨基烷基，包括例如C6至C12氨基烷基。在优选的实施例中，接头(区域Y)是C6氨基烷基基团。

因此，本发明特别地涉及：

根据本发明所述的寡核苷酸，其中核苷(A1)为DNA核苷、RNA核苷或糖修饰的核苷；

根据本发明所述的寡核苷酸，其中核苷(A1)为DNA核苷或糖修饰的核苷；

根据本发明所述的寡核苷酸，其中核苷(A2)为DNA核苷、RNA核苷或糖修饰的核苷；

根据本发明所述的寡核苷酸，其中核苷(A2)为DNA核苷或糖修饰的核苷；

根据本发明所述的寡核苷酸，其中糖修饰的核苷为2'糖修饰的核苷；

根据本发明所述的寡核苷酸，其中核苷(A

根据本发明所述的寡核苷酸，其中核苷(A

根据本发明所述的寡核苷酸，其中LNA核苷独立地选自β-D-氧基LNA、6'-甲基-β-D-氧基LNA和ENA，特别是β-D-氧基LNA；

根据本发明所述的寡核苷酸，其中核苷(A

根据本发明所述的寡核苷酸，其中2'-烷氧基烷氧基-RNA为2'-甲氧基乙氧基-RNA；

根据本发明所述的寡核苷酸，其中核苷(A

根据本发明所述的寡核苷酸，其包含选自磷酸二酯核苷间键、硫代磷酸酯核苷间键以及如上文所定义的式(I)的三硫代磷酸酯核苷间键中的其他核苷间键；

根据本发明所述的寡核苷酸，其包含选自硫代磷酸酯核苷间键以及如上文所定义的式(I)的三硫代磷酸酯核苷间键中的其他核苷间键；

根据本发明所述的寡核苷酸，其包含介于1个和15个之间、特别地介于1个和5个之间、更特别地1个、2个、3个、4个或5个的如上文所定义的式(I)的三硫代磷酸酯核苷间键；

根据本发明所述的寡核苷酸，其中其他核苷间键全部为式-P(＝S)(OR)O

根据本发明所述的寡核苷酸，其包含选自DNA核苷、RNA核苷和糖修饰的核苷的其他核苷；

根据本发明所述的寡核苷酸，其中一个或多个核苷为核碱基修饰的核苷；

根据本发明所述的寡核苷酸，其中寡核苷酸为反义寡核苷酸、siRNA、微小RNA模拟物或核酶；

根据本发明所述的寡核苷酸，其中寡核苷酸为反义缺口聚物寡核苷酸；

根据本发明所述的寡核苷酸，其中式(I)的三硫代磷酸酯核苷间键在所述缺口聚物寡核苷酸的缺口区中；

根据本发明所述的寡核苷酸，其中式(I)的三硫代磷酸酯核苷间键在所述缺口聚物寡核苷酸的缺口区中；

根据本发明所述的寡核苷酸，其中缺口聚物寡核苷酸为LNA缺口聚物、混合型翼缺口聚物或2'-取代的缺口聚物，特别是2'-O-甲氧基乙基缺口聚物；

根据本发明所述的缺口聚物寡核苷酸，其中缺口聚物寡核苷酸包含式5'-F-G-F'-3'的邻接核苷酸序列，其中G为能够募集核糖核酸酶H的具有5至18个核苷的区域，并且所述区域G在5'和3'侧面分别具有侧翼区F和F'，其中区域F和F'独立地包含1至7个2'-糖修饰的核苷酸或由其组成，其中与区域G毗邻的区域F的核苷为2'-糖修饰的核苷并且其中与区域G毗邻的区域F'的核苷为2'-糖修饰的核苷；

根据本发明所述的缺口聚物寡核苷酸，其中所述至少一个如上文所定义的式(I)的三硫代磷酸酯核苷间键定位在区域G的毗邻核苷之间或介于区域G和区域F'之间；

根据本发明所述的寡核苷酸，其中寡核苷酸为反义寡核苷酸混聚物或全聚物，特别是剪接-转换寡核苷酸或微小RNA抑制剂寡核苷酸；

根据本发明所述的寡核苷酸的药用盐，特别是钠盐或钾盐；

一种缀合物，其包含根据本发明所述的寡核苷酸或药用盐以及与所述寡核苷酸或所述药用盐共价连接的至少一个缀合物部分，可选地经接头部分连接；

一种药物组合物，其包含根据本发明所述的寡核苷酸、药用盐或缀合物以及治疗惰性载体；

根据本发明所述的寡核苷酸、药用盐或缀合物，其用作治疗活性物质；

根据本发明所述的寡核苷酸、药用盐或缀合物，其用于治疗或预防心脏病或血液病；

根据本发明所述的寡核苷酸、药用盐或缀合物用于制备治疗或预防心脏病或血液病的药物的用途；

根据本发明所述的寡核苷酸、药用盐或缀合物在治疗或预防心脏病或血液病中的用途；

一种用于治疗或预防心脏病或血液病的方法，其包括将有效量的根据本发明所述的寡核苷酸、药用盐或缀合物施用于有需要的患者；

一种抑制细胞中靶RNA(特别是人mRNA或病毒RNA)的方法，包括向表达所述靶RNA的细胞施用根据本发明所述的寡核苷酸；

一种体外调节或抑制细胞中的靶RNA(特别是人mRNA或病毒RNA)的方法，包括向表达所述靶RNA的细胞施用根据本发明所述的寡核苷酸或缺口聚物寡核苷酸；

一种用于制造根据本发明所述的寡核苷酸的方法，其包括以下步骤：

(a)将硫代亚磷酰胺偶联至5'S-修饰的核苷或寡核苷酸的末端5'硫原子，以产生二硫代亚磷酸三酯中间体；

(b)使步骤a)中获得的所述二硫代亚磷酸三酯中间体硫氧化；以及

(c)可选地进一步延伸该寡核苷酸；

根据本发明所述的方法，其中将步骤(a)的5'S-修饰的核苷或寡核苷酸连接至固相支持物；

根据本发明所述的方法，其进一步包括从固相支持物上裂解寡核苷酸；并且

一种根据本发明所述的方法制造的寡核苷酸。

在一些实施例中，与相应的完全硫代磷酸酯连接的寡核苷酸相比，本发明的寡核苷酸在调节其靶核酸方面具有更高的活性。在一些实施例中，本发明提供了具有增强的活性、增强的功效、增强的比活性或增强的细胞摄取的寡核苷酸。在一些实施例中，本发明提供了具有改变的体外或体内作用持续时间诸如延长的体外或体内作用持续时间的寡核苷酸。在一些实施例中，在表达靶核酸的细胞中，在体外或体内测得更高的调节靶核酸的活性。

在一些实施例中，本发明的寡核苷酸具有改变的药理特性，诸如毒性下降，例如肾毒性下降、肝毒性下降或免疫刺激下降。肝毒性可例如在体内测定或通过使用WO 2017/067970(据此以引用方式并入本文)中公开的体外测定法来测定。肾毒性可例如在体内测定或通过使用PCT/EP2017/064770(据此以引用方式并入本文)中公开的体外测定法来测定。在一些实施例中，本发明的寡核苷酸包含5'CG 3'二核苷酸，诸如DNA 5'CG 3'二核苷酸，其中介于C和G之间的核苷间键为具有上文所定义的式(I)的三硫代磷酸酯核苷间键。

在一些实施例中，本发明的寡核苷酸具有改善的核酸酶抗性，诸如在血清中具有改善的生物稳定性。在一些实施例中，本发明的寡核苷酸的3'末端核苷具有A或G碱基，诸如3'末端LNA-A或LNA-G核苷。合适地，根据上文所定义的式(I)，介于寡核苷酸的两个3'最末端核苷之间的核苷间键可为三硫代磷酸酯核苷间键。

在一些实施例中，本发明的寡核苷酸具有增强的生物利用度。在一些实施例中，本发明的寡核苷酸具有更高的血液暴露量，诸如更长的血液保留时间。

根据本发明所述的寡核苷酸可例如根据以下方案进行制备。

可利用亚磷酰胺法通过固相合成将在非桥接位置以及相邻呋喃糖环的3'和5'位含有硫原子的三硫代磷酸酯键引入寡核苷酸中。使用配有通用接头作为载体的可控孔玻璃(CPG)进行合成。在此类固体支持物上，寡核苷酸通常通过顺序循环在3'至5'方向上构建，该顺序循环包括偶联5'O-DMT保护的核苷亚磷酰胺结构单元，然后进行DMT基团的(硫代)氧化、封端和脱保护。对于如本专利申请所述的三硫代磷酸酯的引入，将DMT保护的5'-脱氧-5'-巯基亚磷酰胺结构单元偶联至固体支持物结合的寡核苷酸链的游离5'-羟基基团。在(硫代)氧化和封端后，将所得的中间体脱保护以释放5'-硫醇基。

方案2

该脱保护具有挑战性，并且最好通过重复(超过15次)应用标准脱保护条件(通常为3-5％二氯乙酸或三氯乙酸的二氯甲烷溶液)或使用较高的酸浓度(例如，最高为10％三氯乙酸的二氯甲烷溶液)或强酸(例如，5％三氟乙酸的二氯甲烷溶液)来进行，优选地使用适当的阳离子清除剂(通常为20％三乙基硅烷、5％4-甲氧基苯硫酚或两者的混合物)。

方案3

然后将由此获得的游离的5'硫醇基与适当的5'O-DMT保护的硫代亚磷酰胺构件偶联。与标准的未修饰的DNA亚磷酰胺相比，这种硫代亚磷酰胺基构件通常以较高浓度(例如0.15M)的溶液偶联并且具有延长的偶联时间。然后可使用适当的试剂(例如，3-氨基-1,2,4-二噻唑-5-硫酮)对所得的二硫代亚磷酸酯中间体进行硫氧化，以提供所需的对称三硫代磷酸酯键。

方案4

在上述方案中：

R

R

R

R

R

R

R

R

R如上文所定义。

现在将通过以下实例说明本发明，所述实例不具有限制性。

实施例

实例1

寡核苷酸合成

使用Bioautomation的MerMade 12自动化DNA合成仪合成寡核苷酸。使用带有通用接头的受控孔玻璃支持物

在偶联DNA和LNA亚磷酰胺的标准循环程序中，用3％(w/v)三氯乙酸的CH

并入2',5'-脱氧-5'-巯基亚磷酰胺的合成循环包括使用100μL 0.1M乙腈溶液和110μL 0.1M的5-(3,5-双(三氟甲基苯基))-1H-四唑溶液的乙腈溶液处理180秒以偶联亚磷酰胺结构单元。进行三次偶联。使用0.1M的3-氨基-1,2,4-二噻唑-5-硫酮在乙腈/吡啶1:1中的溶液(3×190μL，55秒)进行硫氧化。为了封端，将THF/二甲基吡啶/Ac

硫代亚磷酰胺作为活化剂与100μL 0.15M 10％(v/v)CH

使用含有20mM DTT的氨水(32％):乙醇(3:1,v:v)混合物在55℃下干燥15-16小时，即可除去核碱基保护基并从固体支持物上裂解。使用固相萃取柱纯化粗DMT-寡核苷酸，并用离子交换色谱法纯化，或使用C18柱通过RP-HPLC纯化，然后用80％乙酸水溶液除去DMT，并进行乙醇沉淀。

根据上述一般步骤制得以下分子。

粗体和带下划线的核苷酸之间的三硫代酯修饰

A、G、

a、g、c、t代表DNA核苷酸

所有其他键均制备为硫代磷酸酯

化合物#1-13基于SEQ ID NO:1。如上表所示，它们在式(I)的三硫代磷酸酯核苷间键的位置有所不同。

实例1

体外活性数据

LTK细胞在补充有10％胎牛血清[Sigma，目录号F7524]和0.025mg/ml庆大霉素[Sigma，目录号G1397])的细胞培养基(DMEM[Sigma，目录号D0819]中生长。每5天用胰蛋白酶消化细胞一次，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)，[Sigma目录号14190-094]洗涤，然后加入0.25％胰蛋白酶-EDTA溶液(Sigma,T3924)，在37℃孵育2-3分钟，并且细胞播种前先研磨。将细胞保持培养最多15代。

作为实验用途，将每孔2000个细胞接种在100μL生长培养基中的96孔板(Nunc目录号167008)中。寡核苷酸是从750μM储备溶液中制备的。在将细胞接种到最终浓度范围为16-50,000nM后约24小时，添加溶于PBS的寡核苷酸。细胞在寡核苷酸存在下培养3天。

除去培养基，然后加入125μL

结果在图1中示出。

数据清楚地表明了这种修饰的耐受性。此外，这种修饰对于优化常规的硫代磷酸酯寡核苷酸具有很大的潜力。在许多情况下，只需进行一次单一的修改即可获得显著低于的IC50值。将此修饰引入间隔器的LNA侧翼具有特别的好处。这清楚地表明了修饰的价值，以优化效能和从硫代磷酸酯寡核苷酸中除去手性中心。

实例2

以15mg/kg的剂量测量心脏中的目标mRNA水平(Malat1)

在第1、2和3天(n＝5)以三剂皮下给予小鼠(C57/BL6)15mg/kg剂量的寡核苷酸。在第8天处死小鼠，并测量心脏的MALAT-1 RNA减少。以3*15mg/kg和3*30mg/kg的两种剂量施用母体化合物。

结果在图2中示出。

实例3

对ApoB RNA的结合亲和力

根据实例1的程序生成以下ApoB序列。

粗体和带下划线的核苷酸之间的三硫代酯修饰

A、G、C、T代表LNA核苷酸

a、g、c、t代表DNA核苷酸

所有其他键均制备为硫代磷酸酯

化合物#14-21基于SEQ ID NO:2。如上表所示，它们在式(I)的三硫代磷酸酯核苷间键的位置有所不同。

LNA双链体的解链温度在配备有热控制器的Cary 300(Agilent)上测量。对LNA和反向链RNA进行退火，以使其在磷酸盐缓冲液(20mM Na