培育博德特氏菌属菌种的方法

摘要

本公开文本涉及一种用于培育博德特氏菌属(Bordetella)菌种的方法，所述方法包括：在液体培养基中在有氧条件下培育博德特氏菌属菌种；以及通过使用强酸如硝酸或者使用第一酸和第二酸来维持所述液体培养基的pH，其中所述第一酸是基本上在水中完全解离的无机酸如硝酸、盐酸或硫酸，并且其中所述第二酸是酸解离常数(pKa)大于1的无机酸如磷酸。还提供了用于提高来自博德特氏菌属培养物的上清液级分中的博德特氏菌属菌毛凝集原2和菌毛凝集原3(FIM2/3)产量的方法。

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求2018年3月20日提交的美国临时专利申请号62/645,473的权益，并依赖于美国临时专利申请号62/645,473的申请日期，将其全部公开内容通过引用并入本文。

技术领域

本申请总体上涉及用于培育博德特氏菌属(Bordetella)菌种如百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)的方法。

背景技术

百日咳是一种特征在于严重咳嗽发作的肺部细菌感染。百日咳博德特氏菌是此病症的主要病原体。几十年来，已经有包含百日咳博德特氏菌(B.pertussis)的灭活的全细胞的疫苗(wP)可用，所述疫苗是化学解毒的并且用白喉和破伤风抗原配制。自20世纪90年代以来，wP疫苗在许多国家已经被无细胞百日咳疫苗替代。与wP疫苗相比，无细胞百日咳(aP)疫苗诱导相对较少的副作用，所述副作用与发烧高风险、注射部位的反应原性以及(在较小程度上)惊厥相关。

当前的无细胞疫苗基于以下毒力因子：百日咳毒素(PT)、丝状血凝素(FHA)、百日咳杆菌粘附素(PRN)、菌毛凝集原(fimbrial agglutinogen)2和菌毛凝集原3(FIM2/3或FIM)。尽管一些无细胞疫苗仅含有PT和FHA或仅含有PT，但是通常认为含有PT、FHA、PRN、菌毛凝集原2和菌毛凝集原3组分的无细胞百日咳疫苗是当前可用的最有效的aP疫苗。

百日咳aP疫苗的本领域已知的制造过程主要由两个阶段组成：上游发酵过程和下游纯化过程。上游发酵过程通常涉及在一系列体积渐增的生物反应器中培育博德特氏菌属，在所述生物反应器中，微生物在受控条件下生长。通常，博德特氏菌属培育的受控条件包括含有氨基酸作为能源的培养基。博德特氏菌属细胞的培育是不寻常的，因为所述细胞不能有效地利用某些能源，如碳水化合物、乳酸和糖酵解的中间体。相反，所述生物体使用氨基酸(通常是谷氨酸)作为其主要碳源和能源。在利用谷氨酸时，除去α-氨基基团，并且将碳骨架转化为代谢中间体α-酮戊二酸。由酶谷氨酸脱氢酶调节的谷氨酸的氧化脱氨遵循以下反应：

谷氨酸+NAD

由于培养基中氨向铵离子的反应，博德特氏菌属对氨基酸的脱氨基作用导致培育过程中pH升高。通过持续维持培养基的pH，至少部分地，在博德特氏菌属培育过程中可以获得升高的细胞密度。因此，用于培育博德特氏菌属的方法通常还包括通过添加酸(通常是磷酸)来控制pH以将pH维持在较低的碱性水平。

培育后，将细胞与上清液(也称为离心液)分开，这通常涉及将培育的培养物离心，从而得到细胞和上清液级分，并且可以从细胞和/或上清液级分中进一步适当地分离目标抗原。尽管在上清液中也可以发现较少量的FIM，FIM通常是从细胞级分中分离的。相反，在培育过程中从细胞释放的PT、FHA和PRN通常是从上清液中分离的。然而，相当大一部分的PRN通常与细胞保持关联，并且因此，它不存在于上清液中，从而导致抗原的潜在损失。因此，在本领域中需要博德特氏菌属抗原生产、特别是PRN生产的更有效的方法，所述方法增加上清液中此抗原的量。

发明内容

诸位发明人已经开发出了用于培育博德特氏菌属的方法，所述方法导致上清液中PRN的量增加。出人意料地，诸位发明人认识到上清液中PRN的量至少部分取决于用于在培育过程中维持pH的一种或多种酸的类型。此外，诸位发明人出人意料地认识到，通过使用用于控制pH的特定的酸混合物，可以在上清液中增加PRN而不影响其他抗原的产量。此外，诸位发明人发现强酸或酸混合物的使用不会导致生物量水平的任何实质性变化。因此，用于pH控制的酸的类型的简单改变对下游博德特氏菌属抗原制造过程的影响最小。下文描述了本发明方法的这些和其他意想不到的益处。

更具体地，在一方面，本公开文本涉及一种用于培育博德特氏菌属菌种(通常是百日咳博德特氏菌)的方法，所述方法包括：在液体培养基中在有氧条件下培育博德特氏菌属菌种；以及在所述菌种的培育过程中维持所述液体培养基的pH，其中维持所述液体培养基的pH包括：根据需要将强酸如硝酸添加到所述液体培养基中，以在所述博德特氏菌属菌种的培育过程中将所述液体培养基的pH维持在pH值的预定范围内。

另外，在另一方面，本公开文本涉及一种用于提高来自博德特氏菌属培养物的上清液级分中博德特氏菌属菌毛凝集原2和菌毛凝集原3(FIM2/3)的产量的方法，所述方法包括：在液体培养基中在有氧条件下培育博德特氏菌属菌种，通常是百日咳博德特氏菌；在所述菌种的培育过程中维持所述液体培养基的pH，其中维持所述液体培养基的pH包括：根据需要将酸添加到所述液体培养基中，以在所述博德特氏菌属菌种的培育过程中将所述液体培养基的pH维持在pH值的预定范围内，其中所述酸包括基本上在水中完全解离的无机酸，如硝酸、盐酸或硫酸，将博德特氏菌属培育后的所述液体培养基分为细胞级分和上清液级分；以及从所述上清液级分中分离FIM2/3。

在又另一方面，本公开文本涉及一种用于培育博德特氏菌属菌种(通常是百日咳博德特氏菌)的方法，所述方法包括：在液体培养基中在有氧条件下培育博德特氏菌属菌种；以及在所述菌种的培育过程中维持所述液体培养基的pH，其中维持所述液体培养基的pH包括：根据需要将第一酸和第二酸添加到所述液体培养基中，以在所述博德特氏菌属菌种的培育过程中将所述液体培养基的pH维持在pH值的预定范围内，其中所述第一酸是基本上在水中完全解离的无机酸，如硝酸、盐酸或硫酸，最通常是硝酸，并且其中所述第二酸是酸解离常数(pKa)大于1的有机酸或无机酸，如磷酸。

在一些实施方案中，将所述第一酸和所述第二酸合并为溶液，其中所述溶液包括约20％至约75％(如约30％至约50％，如约40％)的所述第一酸和约25％至约80％(如约50％至约70％，如约60％)的所述第二酸(v/v)。

在一些实施方案中，本文所述的方法还包括从所述液体培养基中分离博德特氏菌属抗原，其包括例如将博德特氏菌属培育后的所述液体培养基分为细胞级分和上清液级分。

在一些实施方案中，本文所述的方法还包括将百日咳毒素(PT)、丝状血凝素(FHA)和百日咳杆菌粘附素(PRN)中的一种或多种从所述上清液级分中分离，以及将FIM2/3从所述细胞级分和/或所述上清液中分离。

在一些实施方案中，本文所述的方法还包括将所述分离的博德特氏菌属抗原配制为亚单位疫苗。

在本文所述的任何方法中，所述pH值的预定范围可为6.0-9.0，如6.8-7.3。

在一些实施方案中，根据本发明方法的所述博德特氏菌属菌种的培育在大规模生产条件下进行。

在一些实施方案中，用于培育所述博德特氏菌属菌种的所述液体培养基是化学成分确定的液体培养基，如补充有二甲基-β-环糊精的Stainer-Scholte培养基。

根据下文提供的具体实施方式，本公开文本的另外的适用范围将变得清楚。应当理解，尽管具体实施方式和特定实施例指示了本公开文本的一些期望的方面，但是其仅旨在用于说明的目的，而不旨在限制本公开文本的范围。

附图说明

图1描绘了免疫印迹，其示出了如实施例1中所述，从在博德特氏菌属培育过程中使用各种酸维持pH的控制而制备的博德特氏菌属培养物获得的上清液或细胞级分中PRN的相对量。

图2A-2D描绘了如实施例2中所述，在复合培养基中在博德特氏菌属培育过程中以不同比率的3.5M硝酸和2.5M磷酸的混合物进行pH控制对来自上清液的PRN(图2A)、PT(图2B)和FHA(图2C)以及来自细胞级分和上清液的FIM2/3(图2D)的产量的影响。

图3A-3D描绘了如实施例3中所述，在化学成分确定的培养基中在博德特氏菌属培育过程中以不同比率的3.5M硝酸和2.5M磷酸的混合物进行pH控制对来自上清液的PRN(图3A)、PT(图3B)和FHA(图3C)以及来自细胞级分和上清液的FIM2/3(图3D)的产量的影响。

图4A-B描绘了如实施例4中所述，在复合培养基中在博德特氏菌属培育过程中以不同比率的3.5M硝酸和2.5M磷酸的混合物进行pH控制对来自20L和200L规模的上清液的PRN(图4A)以及来自200L规模的上清液(离心液)的FIM2/3(图4B)的产量的影响。

具体实施方式

各个期望方面的以下描述本质上仅是示例性的，并且绝不旨在限制本公开文本、其应用或用途。

除非上下文另有明确规定，否则如在本说明书和所附权利要求书中所使用的，单数形式“一种/一个”(“a”、“an”)和“所述”包括复数指称。因此，例如，对“一种方法”的提及包括一种或多种方法、和/或本文所述的和/或在阅读本公开文本之后对于本领域技术人员而言将变得清楚的类型的步骤等等。

如全文所用，范围用作描述范围内每个值的简写。范围内的任何值都可选为范围的终点。另外，本文引用的所有参考文献都通过引用以其整体特此并入。在本公开文本中的定义与所引用的参考文献的定义冲突的情况下，以本公开文本为准。

如本文所用，“博德特氏菌属”是指变形细菌门的小(0.2-0.7μm)革兰氏阴性球杆菌属。通常，博德特氏菌属菌种是专性需氧微生物。博德特氏菌属菌种也是高度挑剔的，即难以培养。所有菌种都可以感染人类。

如本文所用的术语“培育”(“cultivate”或“cultivating”)是指培养中细胞的生长。如本文所用的术语“培养”是指细胞或生物体在培养基中的任何生长。术语“培养基”(“culture medium”或“medium”)在本领域中是公认的，并且通常是指用于培育活细胞的任何物质或制剂。如关于细胞培养所用，术语“培养基”包括包围细胞的环境的组分。

在各种实施方案中，本发明方法包括：在液体培养基中在有氧条件下培育博德特氏菌属菌种；以及在所述菌种的培育过程中维持液体培养基的pH，其中维持液体培养基的pH包括：根据需要将基本上在水中完全解离的无机酸(如硝酸)添加到液体培养基中，以在博德特氏属菌种的培育过程中将液体培养基的pH维持在pH值的预定范围内。

本领域已知的用于培育博德特氏菌属细胞的任何液体培养基均可以与本发明方法一起使用。在多种实施方案中，使用复合培养基。如本文所用，“复合培养基”是指含有植物或动物来源的蛋白胨消化物或提取物的培养基。适用于与本发明方法一起使用的复合培养基的例子包括例如Hornibrook氏培养基、Cohen-Wheeler培养基、B2培养基或其他类似的液体培养基。适合使用的另一个例子是还包括二甲基β环糊精和酪蛋白氨基酸的改良的Stainer&Scholte培养基。然而，通常，如下面的实施例中所述，在培育过程中首先使用含有酪蛋白氨基酸的复合培养基，随后随着营养素供应的消耗，补充包含生长因子和谷氨酸单钠的进料补充剂。如本文所用，“酪蛋白氨基酸”是指通过酪蛋白水解获得的氨基酸的混合物。

在其他实施方案中，将化学成分确定的培养基与本发明方法一起用于培育博德特氏菌属菌种。通常认为化学成分确定的培养基是有益的，因为不像非化学成分确定的培养基，化学成分确定的培养基含有精确浓度的每种营养素，因此减少了培养基的变异性并且提高了发酵产物的质量。如本文所用，术语“化学成分确定的培养基”是指基本上不含复合材料(如酵母、酵母提取物、蛋白胨、胰胨和酪蛋白氨基酸)的培养基。

下表1提供了适用于与本发明方法一起使用的化学成分确定的培养基(即，Stainer&Scholte(SS)培养基和改良版的SS培养基(补充的SS培养基))的组成的例子，所述改良版的SS培养基包括二甲基-β-环糊精、百日咳博德特氏菌的生长刺激剂和其他微小改变。在这些例子中，复合培养基中的酪蛋白氨基酸已经被选定的氨基酸替代。也可以包括一种或多种另外的氨基酸。

表1 Stainer Scholte(SS)培养基和补充的SS培养基的组成

在一些实施方案中，液体培养基包含博德特氏菌属菌种。在各种实施方案中，博德特氏菌属菌种是选自禽博德特氏菌(Bordetella avium)、欣氏博德特氏菌(Bordetellahinzii)、创口博德特氏菌(Bordetella trematum)、霍氏博德特氏菌(Bordetellaholmesii)、副百日咳博德特氏菌(Bordetella parapertussis)、支气管败血博德特氏菌(Bordetella bronchiseptica)和百日咳博德特氏菌(原本称为百日咳嗜血杆菌(Haemophilus pertussis))的菌种。通常，博德特氏菌属菌种选自副百日咳博德特氏菌、支气管败血博德特氏菌和百日咳博德特氏菌。更通常地，博德特氏菌属菌种是百日咳博德特氏菌。

通常，发酵过程以至少两个阶段进行：(i)种子繁殖和(ii)培育。第一阶段在摇瓶中完成。首先通过从储用培养物(例如，工作种子)中接种使相对较小的种子培养物生长，然后使其生长并且用于接种培养物(例如，种子培养物、发酵培养物)。一个以上的种子生长阶段可用于按比例放大用于接种培养基的博德特氏菌属菌种的量。可替代地，若需要，在培育中菌种的生长可以通过直接接种而从储存的培养物直接进行。为了开始培育阶段，使用部分或全部种子培养物接种培养基。有一个或多个培育培养步骤或传代。例如，为了在2000L生物反应器中培育博德特氏菌属，可使用种子培养物接种第一培养容器(20L)，所述第一培养容器用于接种第二培养容器(200L)，所述第二培养容器用于接种第三培养容器(2000L)。通过进一步举例，为了在200L容器中培养博德特氏菌属，可以使用种子培养物接种第一烧瓶，所述第一烧瓶用于接种第二烧瓶，所述第二烧瓶用于接种20L容器，所述20L容器进而用于接种200L容器。

在一些实施方案中，博德特氏菌属菌种的培育包括在小容器中使博德特氏菌属生长，所述小容器是例如含有例如1、2、3或5升的液体培养基的2、5或10升烧瓶。在其他实施方案中，培育博德特氏菌属的本发明方法使用大规模生产条件。如本文所用，“大规模生产条件”是指在通常为生物反应器的培养容器中培育细胞，所述培养容器具有10-10,000升、25-5000升、25-2000升、50升-1000升、100升-5000升、500升-8000升、1500升-6500升、约1500-1600升、约3000-3200升、约6000-6400升、大于或等于25升、如大于或等于100升、如至少100升并且小于或等于10,000升、如至少100升并且小于或等于8000升、如至少100升并且小于或等于4000升或如至少100升并且小于或等于2000升的工作体积。

在各种实施方案中，培育过程在大于或等于32℃、大于或等于33℃、大于或等于34℃、小于或等于45℃、小于或等于42℃、小于或等于40℃、小于或等于38℃、在32℃-45℃、33℃-42℃、33℃-40℃或33℃-38℃的温度进行。通常，在范围从34℃至38℃的温度进行培育。

可在培育过程中通过本领域已知的任何方法(如通过摇动或滚动培养容器或通过使用安装在生物反应器的轴上的一个或多个叶轮)实现通气。可替代地，可将空气或纯氧引入培养容器中。可将溶解氧调节至例如空气饱和度的约20％至40％或约30％的水平。在一些实施方案中，溶解氧的水平为10μM-160μM、15μM-140μM、30μM-120μM、45μM-15μM、60μM-100μM或约80μM。

在一些实施方案中，在培育过程期间，可将消泡剂(如聚二甲基硅氧烷)掺入液体培养基中。

在一些实施方案中，培育时间段的范围是从9小时至56小时，如26小时或更短或48小时或更短。培育过程的每个步骤都可以有自己的培育时间段。

强酸

在各种实施方案中，在生物体的培育过程中持续评估液体培养基的pH，并且在生物体的生长过程中，根据需要将酸以足以将培养基的pH维持在值的预定范围内的浓度进料到液体培养基中。通常，在整个培育过程中控制培养基的pH范围通常是从约6.0至约9.0，更通常是从约6.8至约7.3，如从约7.0至7.2。pH的确定以及必要时的调节通常是自动进行的，例如使用可操作地连接到泵(其可以是蠕动泵)的pH计，所述泵用于响应于在预定范围之外的pH测定，将酸泵送到液体培养基中。

如本文所用，“酸”是指当添加到水性溶液中时，将质子贡献给水分子(H

还可以参考Ka和/或pKa值来定义强酸。如本文所用，Ka是指在解离平衡状态下的平衡常数：[H

例如，水(H

除HCl外，在本发明博德特氏菌属培育方法中可以用于控制pH的其他强酸的例子包括氢溴酸、硫酸、硝酸、氯酸、高氯酸、高锰酸和氢碘酸。然而，通常使用盐酸(HCl)、硫酸(H

与本文公开的强酸相比之下，“弱(mild或weak)酸”是指Ka值小于约10

表2.适用于与本发明方法一起使用的强酸和弱酸的Ka和pKa

在一些实施方案中，将包含仅一种酸(如仅一种强酸，如仅一种强无机酸，例如硝酸)的溶液用于维持本发明方法的液体培养基的pH。也就是说，用于控制pH的溶液中的100％的酸是强酸，如强无机酸，如HCl、H

在各种实施方案中，通常在培育之后进行使用例如离心将培养基分为细胞级分和上清液级分的步骤。使用本领域可用的方法，包括美国专利号5,877,298中描述的那些(将其通过引用以其整体特此并入)，可以从细胞和上清液级分中进一步分离来自博德特氏菌属培养物的一种或多种抗原，包括PRN、PT、FHA和FIM2/3。如本文所用，术语“抗原”或“免疫原”是指含有一个或多个表位(线性、构象或两者)的分子，所述表位在暴露于受试者(例如哺乳动物，如人)时，将诱导对此抗原具有特异性的免疫反应。表位是与T细胞受体或特异性抗体结合的抗原的特异性位点，并且通常包含约3个氨基酸残基至约20个氨基酸残基。术语抗原是指亚单位抗原：与整个生物体分开和离散的抗原，所述抗原在自然界中与所述整个生物体相关。

术语“分离”(“isolated”或“isolating”)是指基本上纯的形式(例如，大于约95％纯度)或至少部分纯化(例如，大于85％纯、大于75％纯或大于50％纯)或以某种方式从其自然环境或其生长培养基中除去的物质。因此，对“分离”(“isolated”或“isolating”)的任何提及涵盖从其液体培养基和/或从全细胞细菌制剂中除去，以及可以基本上或至少部分地纯化的试剂(如抗原)，包括例如通过离心博德特氏菌属培养基获得的细胞或上清液级分。术语“分离”(“isolated”)还涵盖与其他试剂、稀释剂、赋形剂、佐剂和/或蛋白质一起在溶液中的免疫原。

分离抗原(如PRN)可以通过本领域已知的任何方法来进行，例如如美国专利号5,667,787和5,877,298中所述，将其通过引用以其整体并入本文。通常，分离过程开始于将液体培养基分为水性材料(在本文中也称为上清液级分或离心液)和细胞级分。分开可以通过多种方法来实现。例如，可以允许培养物中的固体在重力作用下沉降，然后可以通过倾析或通过抽吸除去水性材料。然而，通常，使用离心以给出可以轻松分开的固体沉淀物和上清液。沉淀物包括博德特氏菌属细胞和其他不溶性材料。上清液包括培养基和培养过程中细菌释放的任何组分。

可以将上清液过滤，然后通过使用例如纤维素膜浓缩，所述上清液通常含有PT、FHA和PRN。PT、FHA和PRN可以例如通过珍珠岩分馏而分开。若需要，可以在此分开步骤中在通过使用的柱时收集PRN，而可以将PT和FHA从柱上洗脱下来。

在一些实施方案中，使用三种不同浓度的硫酸铵在三个连续的沉淀步骤中沉淀PRN，如例如在美国专利号5,667,787中所述，将其通过引用以其整体并入本文。例如，在第一次和第三次沉淀中，沉淀物是目标级分，而在第二次沉淀中，使用上清液。然后可以将通过离心收集的最终沉淀物溶解于例如10mM HCl Tris缓冲液中，并且加载到色谱柱上。然后在使产物经受最终的色谱步骤之前，可以将产物超滤和渗滤。在定量PRN之前，最终的过滤可以涉及预过滤步骤和无菌过滤(0.2μm过滤器)。

在一些实施方案中，将经纯化的PRN吸附到佐剂(如磷酸铝)上。如本领域已知的，佐剂是用于增强免疫系统对抗原响应的化合物。在吸附过程中，例如，将磷酸铝溶液添加到抗原中，并且在16℃至24℃下混合4天。在吸附后，PRN可以在2℃至8℃下储存长达36个月。

在一些实施方案中，与仅使用一种或多种如本文所定义的较弱(weaker或milder)酸(如磷酸(H

在一些实施方案中，与仅使用一种或多种如本文所定义的较弱(weaker或milder)酸(如磷酸(H

在一些实施方案中，与仅使用一种或多种如本文所定义的较弱(weaker或milder)酸(如磷酸(H

本公开文本还涉及用于提高来自博德特氏菌属培养物的上清液级分中菌毛凝集原2和菌毛凝集原3的产量的方法，所述方法包括：如本文所述，在液体培养基中在有氧条件下培育博德特氏菌属菌种；如本文所述，在所述菌种的培育过程中维持液体培养基的pH，其中维持液体培养基的pH包括：根据需要将酸添加到培养基中，以在所述博德特氏菌属菌种的培育过程中将培养基的pH维持在pH值的预定范围内，其中如本文所述，酸包含基本上在水中完全解离的无机酸(即，作为强酸)，并且将博德特氏菌属培育后的液体培养基分为细胞级分和上清液级分(离心液)；以及将2型和3型菌毛从细胞级分和/或上清液级分中分离。

在一些实施方案中，从博德特氏菌属培养物中分离FIM2/3。在这些实施方案中，用于培育的液体培养基可以是复合培养基或化学成分确定的培养基。通常，在这些实施方案中，液体培养基是如本文所述的化学成分确定的培养基，例如补充的SS培养基。在各种实施方案中，如本文所述，例如通过离心将液体培养基分为细胞级分和上清液级分后，从上清液和/或细胞级分获得FIM2/3。根据本领域已知的任何方法，可以从上清液级分和/或细胞级分中分离FIM2/3。在某些实施方案中，从上清液级分中分离FIM2/3。在其他实施方案中，从细胞级分中分离FIM2/3。例如，使用本领域已知的技术(例如，尿素、加热或超声处理)通过裂解细胞，之后进一步分离FIM2/3，可以从细胞级分中分离FIM2/3。

在一些实施方案中，与仅使用一种或多种如本文所定义的较弱(weaker或milder)酸(如磷酸(H

在一些实施方案中，与仅使用一种或多种如本文所定义的较弱(weaker或milder)酸(如磷酸(H

酸混合物

如本文所述，本公开文本还涉及用于培育博德特氏菌属菌种的方法，所述方法包括：如本文所述，在液体培养基中在有氧条件下培育博德特氏菌属菌种；以及在所述菌种的培育过程中维持液体培养基的pH，其中维持液体培养基的pH包括：如本文所述，根据需要将第一酸和第二酸添加到培养基中，以在所述博德特氏菌属菌种的培育过程中将液体培养基的pH维持在pH值的预定范围内，其中所述第一酸是基本上在水中完全解离的无机酸，并且其中所述第二酸是酸解离常数(pKa)大于1的无机酸或有机酸。

在各种实施方案中，在博德特氏菌属培育过程中，通过使用第一酸和第二酸的混合物来维持液体培养基的pH。在使用酸混合物控制pH的一些实施方案中，液体培养基可以是复合培养基或化学成分确定的培养基。然而，通常，液体培养基是如本文所述的化学成分确定的培养基，例如补充的SS培养基。

在使用酸混合物用于pH控制的一些实施方案中，如本文所述，第一酸是强酸，即基本上在水中完全解离的酸。更通常地，第一酸是强无机酸，如氢溴酸、硫酸、硝酸、氯酸、高氯酸、高锰酸和氢碘酸。然而，甚至更通常地，第一酸是盐酸(HCl)、硫酸(H

在各种实施方案中，第二酸也用于维持培养基的pH。通常，第二酸是比第一酸弱的酸。将第一酸与第二酸混合，从而形成共轭酸-碱对，其中第二酸(作为较弱酸)有效地作为碱起作用以接受来自第一酸的氢离子(H

在一些实施方案中，较弱酸是有机酸。有机酸往往比无机酸解离更慢，并且解离不完全。用于与本发明方法一起使用的Ka值小于约10

在一些实施方案中，混合的酸溶液包含至多约99％(如约98％、如约97％、如约95％、如约90％、如约80％、如约75％、如约70％、如约60％、如约55％、如约50％、如约45％、如约40％、如约35％、如约30％、如约25％、如约20％、如约10％、如约5％、如约1％)的强酸，其中混合的酸溶液的剩余部分包含较弱酸(v/v)，即pKa大于1的酸。

在一些实施方案中，混合的酸溶液包含至多约99％(如约98％、如约97％、如约95％、如约90％、如约80％、如约75％、如约70％、如约60％、如约55％、如约50％、如约45％、如约40％、如约35％、如约30％、如约25％、如约20％、如约10％、如约5％、如约1％)的pKa大于1的弱酸，其中混合的酸溶液的剩余部分包含强酸(v/v)，即基本上在水中完全解离的酸。

通常，混合的酸溶液包含30％-50％，如约40％)的如本文所定义的强酸(如强无机酸，如硝酸、硫酸或盐酸)以及50％-70％(如约60％)的pKa值大于1的较弱酸(v/v)。通常，pKa大于1的第二酸是磷酸。

在一些实施方案中，包含如本文所定义的强酸(其在本发明混合的酸溶液中使用，如强无机酸，例如硝酸)的溶液的摩尔浓度的范围是从0.5M-5.0M，如1.0M-4.0M、如3.5M，如3.5M的硝酸或3.5M HCl，通常是3.5M硝酸。

在一些实施方案中，包含如本文所定义的弱酸(其在混合的酸溶液中使用，如弱有机酸或无机酸，例如磷酸)的溶液的摩尔浓度的范围是从0.5M-5.0M，如1.0M-4.0M、如3.5M、如2.5M，如2.5M磷酸。在一些实施方案中，混合的酸溶液包含30％-50％的3.5M HCl或3.5MHNO

在一些实施方案中，与仅使用一种或多种如本文所定义的较弱(weaker或milder)酸(如磷酸(H

在一些实施方案中，在上清液中观察到的PRN的增加不伴随上清液中其他抗原的量的减少。例如，在一些实施方案中，与仅使用一种或多种如本文所定义的较弱(weaker或milder)酸(如磷酸(H

在一些实施方案中，在上清液中观察到的PRN的增加不伴随细胞级分中其他抗原的量的减少。例如，在一些实施方案中，与仅使用一种或多种如本文所定义的较弱(weaker或milder)酸(如磷酸(H

如本文所用，关于博德特氏菌属抗原的量，“没有实质性减少”意指，与当如本文所述的混合的酸溶液未用于维持获得上清液和细胞级分的博德特氏菌属培养物的pH时(如当在培育过程中如本文所述的2.5M磷酸的溶液或另一种弱酸的溶液用于维持博德特氏菌属液体培养基的pH时)观察到的或从博德特氏菌属培养物分离的博德特氏菌属抗原的量相比，减少约25％或更少，如20％或更少、如15％或更少、如10％或更少、如5％或更少或如2％或更少。

在根据本发明方法培育博德特氏菌属菌种后，可以使用本领域已知的任何方法获得抗原PRN、PT、FHA和FIM2/3，其中如本文所述，第一酸和第二酸用于pH控制。如前所述，可以根据本领域已知的方法分离PRN。

例如，可以如美国专利号5,877,298的实施例2中所述分离PT，将其通过引用以其整体并入本文。也可以例如使用美国专利号5,085,862、WO96/34623、美国专利号4,705,868、EP 0336736、WO 9115505、EP 0306318、EP 0322533、EP 0396964、EP 0275689、WO 91/12020、EP 0427462、WO9819702和美国专利号4,784,589中描述的方法分离PT，将其中的每一个均通过引用以其整体并入本文。

例如，可以如美国专利号5,877,298的实施例2中所述分离FHA，将其通过引用以其整体并入本文。也可以例如如WO 9013313、EP 0484621、WO9634623、EP 0336736、WO9115505、美国专利号4,784,589和WO 9004641中所述分离FHA，将其中的每一个均通过引用以其整体并入本文。

可以如例如美国专利号5,877,298中所述从细胞级分中分离FIM2/3，将其通过引用以其整体并入本文。也可以例如如美国专利号4,784,589、美国专利号6,475,754、EP0555894、WO 9858668和WO 0207764中所述分离FIM2/3，将其中的每一个均通过引用以其整体并入本文。

在一些实施方案中，从上清液而不是细胞级分中分离FIM2/3。通常，在这些实施方案中，本发明培育方法包括化学成分确定的而不是复合的液体培养基。

在一些实施方案中，与仅使用一种或多种如本文所定义的较弱(weaker或milder)酸(如磷酸(H

配制疫苗

在一些实施方案中，将如本文所述的一种或多种分离的抗原配制为免疫原性组合物或亚单位疫苗。如本文所用，“亚单位疫苗”是指一种类型的疫苗，其包括一种或多种抗原-但不是所有抗原-所述抗原衍生自来自目的病原体(如病毒、细菌、寄生虫、真菌或真菌样生物体)的抗原或与其同源。这样的疫苗基本上不含完整的病原体细胞或病原性颗粒或者此类细胞或颗粒的裂解物。因此，亚单位疫苗或亚单位组合物可以由来自病原体的至少部分纯化的或基本上纯化的免疫原性多肽或其类似物制备。获得亚单位疫苗中的一种或多种抗原的方法包括标准纯化技术、重组生产或化学合成。因此，“亚单位疫苗”是指由病毒、细菌或其他免疫原的确定的一种或多种抗原组分组成的疫苗。

在各种实施方案中，将一种或多种抗原配制为人剂量的亚单位疫苗。如本文所用的“人剂量”是指单次给药中向人给予的疫苗量。通常，此量以0.1-2毫升(例如0.2-1毫升，通常0.5毫升)的体积存在。因此，所指示的量可以例如以每0.5毫升散装疫苗中的微克浓度存在。在某些实施方案中，因此，(单个)人剂量等于0.5毫升。

在一些实施方案中，配制为疫苗的一种或多种抗原包含PT和FHA。在一些实施方案中，配制为疫苗的一种或多种抗原包含PT、FHA和FIM2/3以及PRN。

在一些实施方案中，将PT掺入疫苗中包括PT的解毒。PT可以是化学或基因解毒的。化学解毒可以例如通过多种常规化学解毒方法中的任何一种进行，如用甲醛、过氧化氢、四硝基甲烷或戊二醛处理。例如，可以如美国专利号5,877,298的实施例3中所述进行解毒，将其通过引用以其整体并入本文。

在某些实施方案中，PT是基因解毒的。这可以通过使百日咳毒素基因突变以使百日咳毒素的催化亚基S1的酶活性失活来实现，如已经例如在美国专利号7,144,576、7,666,436和7,427,404中所述，将其各自通过引用以其整体并入本文。

在某些实施方案中，将本发明抗原配制为疫苗包括掺入范围从2-50μg、5-40μg、10-30μg或20-25μg/人剂量的PT的量。

在某些实施方案中，将本发明抗原配制为疫苗包括掺入范围从2-50μg、5-40μg、10-30μg或20-25μg/人剂量的FHA的量。

在某些实施方案中，将本发明抗原配制为疫苗包括掺入范围从0.5-100μg、1-50μg、2-20μg、3-30μg、5-20μg或6-10μg/人剂量的PRN的量。

在某些实施方案中，可以配制为疫苗的FIM 2与FIM 3的重量比是从约1:3至约3:1，例如从约1:1至约3:1、例如从约1.5:1至约2:1。在某些实施方案中，将本发明抗原配制为疫苗包括掺入范围从1-100μg/人剂量(如3-50μg或3-30μg，如5μg/人剂量)的FIM2/3的量。

在某些实施方案中，配制为免疫原性组合物或疫苗的抗原可以进一步与来自一种或多种除博德特氏菌属以外的病原体的抗原一起配制。例如，在某些实施方案中，配制品包含以下中的一种或多种：破伤风类毒素(TT)、白喉类毒素(DT)、b型流感嗜血杆菌寡糖或多糖缀合物(Hib)、乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)和/或灭活的脊髓灰质炎病毒(IPV)。

配制为免疫原性组合物或疫苗的本发明抗原可以配制为注射剂、液体溶液或乳剂。例如，本发明博德特氏菌属抗原可以与和抗原相容的药学上可接受的赋形剂混合。此类赋形剂可以包括水、盐水、右旋糖、甘油、乙醇及其组合。免疫原性组合物和疫苗还可以含有辅助物质，如湿润剂或乳化剂、pH缓冲剂或增强其效力的佐剂。

如果将抗原与佐剂(通常作为0.005％至0.5％的磷酸盐缓冲盐水溶液使用)共给予，则可以显著提高免疫原性。佐剂增强抗原的免疫原性，但其本身不一定具有免疫原性。佐剂可以通过将抗原局部保留在给药部位附近而发挥作用，以产生促进抗原缓慢、持续释放至免疫系统细胞的长效作用。佐剂还可以将免疫系统的细胞吸引至抗原贮库，并且刺激此类细胞引发免疫反应。通常，氢氧化铝和磷酸铝(通常统称为矾)可以用于配制由本发明博德特氏菌属培育方法制备的疫苗。

实施例

实施例1.强酸提高来自博德特氏菌属培养物的上清液中的PRN产量。

将工作种子(2.5mL)接种在2L摇瓶中，每个摇瓶含有500mL具有5mL100x生长因子溶液(表4)的肉汤(改良的Stainer-Scholte培养基，表3)。使培养物在培养箱振荡器中生长44小时，并且用于接种2L发酵罐/生物反应器(2L BIOSTAT B发酵罐(B.Braun BiotechInternational，德国柏林))，其中含有1150mL补充有生长因子溶液(表4)的肉汤(改良的Stainer-Scholte培养基，表3)。

在培育期过程中，将谷氨酸单钠的进料补充剂和生长因子、谷胱甘肽、硫酸亚铁、抗坏血酸、烟酸和半胱氨酸持续添加到生物反应器中以提高抗原产量。补充溶液的添加是由溶解氧(DO)水平的急剧增加和搅动的急剧减少触发的，这在分批培育阶段过程中消耗了最初的碳源后发生。生物反应器各自在就温度(36℃±2℃)、溶解氧(35％)、搅动(100-675rpm)和pH(7.2)水平而言相同的操作条件下工作，并且持续监测和控制。使用2.5M磷酸、3.5M硝酸或3.5M盐酸来维持每个生物反应器的pH。持续添加消泡剂以控制泡沫。培育时间约为48小时。

在培育期结束时，将肉汤离心以获得细胞级分和上清液级分。通过ELISA和免疫印迹测定每种级分的PRN。用于PRN、PT和FHA ELISA分析的上清液样品是通过用以下稀释因子稀释样品制备的：对于PRN，在1/100-1/200；对于FHA，在1/20-1/40；并且对于PT，在1/40之间。用于PRN ELISA的细胞沉淀裂解物样品是通过将细胞沉淀物重悬于裂解缓冲液中制备的，所述裂解缓冲液具有添加至终浓度为0.5％的Triton X-100和0.25mg/mL溶菌酶。将样品裂解物以1/100稀释用于ELISA测定。

表3.改良的Stainer-Scholte培养基

表4.生长因子

上清液级分中的PRN相对量示于表5(下文)和图1中。当将2.5M磷酸用另一种用于pH控制的溶液(如3.5M硝酸或3.5M盐酸)替代时，生物反应器收获物上清液中的PRN产量从约4-5mg/L提高到15-30mg/L。通过来自生物反应器收获物的样品的免疫印迹进行的与细胞级分相关并存在于上清液中的PRN的相对量的检查表明，百日咳博德特氏菌PRN的总体表达可能基本上没有响应于使用磷酸的酸替代物用于生物反应器pH控制而增加，但相反，上清液中PRN的增加和与收获的细胞相关的量的减少相对应(即更多地从细胞释放到上清液中)。表5：上清液级分中PRN的ELISA检测。

然而，表6显示，上清液中其他抗原的产量并未因使用2.5M磷酸的酸替代物而提高。例如，表6描绘了与使用2.5M磷酸时的产量(33.2mg/L，PT；194.1mg/L，FHA)相比，分别使用3.5M硝酸或3.5M盐酸用于生物反应器pH控制，培育后的PT(约19至24.5mg/L)和FHA(约120至124mg/L)的产量较低，如通过ELISA测量的。

表6：来自生物反应器收获物的上清液样品中的PT和FHA的ELISA检测。

实施例2.酸混合物提高来自博德特氏菌属培养物的上清液中的PRN和FIM2/3产量，同时缓解PT和FHA损失。

如上文针对实施例1所述制备培养物，除了不同比率的硝酸和磷酸的混合物用于生物反应器pH控制。分离出PRN、PT、FHA和FIM2/3抗原，以评估酸混合物对抗原生产的影响。在培育期结束时，将收获物离心以获得细胞级分和上清液级分。通过ELISA测定上清液级分的PRN、PT、FHA和FIM2/3抗原。将细胞沉淀物重悬于注射用水(WFI)中，并且用8M尿素处理以裂解细胞并且释放FIM2/3，用于通过ELISA进行分析。

图2A-2D示出了对于多个生物反应器运行，生物反应器收获物中每种抗原的产量，如通过ELISA测量的。图2A确认了，当使用包含100％3.5M硝酸的溶液代替包含2.5M磷酸的溶液用于pH控制时，生物反应器收获物上清液中的PRN产量提高(4mg/L至12-20mg/L)。图2D还证明了，当使用100％3.5M硝酸代替100％2.5M磷酸时，上清液中的FIM2/3产量从大约4mg/L显著提高到12mg/L。

然而，图2D还显示，当使用包含100％3.5M硝酸的溶液代替包含100％2.5M磷酸的溶液用于pH控制时，观察到细胞级分中FIM2/3减少(约50％减少)。另外，2b-c还显示，使用100％3.5M硝酸，生物反应器收获物上清液中的PT和FHA产量也显著降低，即分别地21mg/L至15mg/L和190mg/L至80-120mg/L。

然而，随着用于生物反应器pH控制的混合物中硝酸的比率降低，上清液级分中PT和FHA以及细胞级分中FIM2/3的产量降低得到缓解。参见图2B-D。此外，与当仅包含100％2.5M磷酸的溶液用于pH控制时的产量相比，在30％-50％3.5M硝酸和70％-50％2.5M磷酸下，仍观察到生物反应器收获物上清液级分中的PRN和FIM2/3产量提高(图2A和2D，分别为7-10mg/L和5-9mg/L)。

实施例3.酸混合物和化学成分确定的培养基进一步提高来自博德特氏菌属培养物的上清液中的PRN和FIM2/3产量，同时缓解PT和FHA损失。

也如上文针对实施例1所述制备培养物，除了使用化学成分确定的培养基代替复合培养基。如实施例2中所述，不同比率的硝酸和磷酸的混合物用于生物反应器pH控制。如上文针对实施例2所述分离PRN、PT、FHA和FIM2/3抗原。

图3示出了对于多个生物反应器运行，生物反应器收获物中每种抗原的产量，如通过ELISA测量的。图3A-D也确认了，当100％3.5M硝酸代替100％2.5M磷酸用于pH控制时，生物反应器收获物上清液级分中的PRN产量提高(5-7mg/L至14-22mg/L)。另外，图3也确认了，当包含100％3.5M硝酸的溶液代替包含100％2.5M磷酸的溶液用于pH控制时，上清液级分中的FIM2/3产量从大约4mg/L显著提高到16mg/L。

另外，图3确认了当100％3.5M硝酸溶液对比100％2.5M磷酸用于pH控制时，与细胞级分相关的FIM2/3减少(从10-14mg/L到3-6mg/L)。如实施例2中类似地显示，使用100％3.5M硝酸，生物反应器收获物上清液级分中的PT和FHA产量也分别从大约24-27mg/L显著降低至12-15mg/L以及从约145-280mg/L显著降低至85-190mg/L。

然而，随着用于生物反应器pH控制的混合物中硝酸的比率降低，上清液级分中PT和FHA以及细胞级分中FIM2/3的收获物产量降低得到缓解。参见图3B-D。此外，与当仅包含100％2.5M磷酸的溶液用于pH控制时的产量相比，在30％-50％3.5M硝酸和70％-50％2.5M磷酸下，仍观察到生物反应器收获物上清液级分中的PRN和FIM2/3产量提高(图3A和3D，分别地10-15mg/L和8-12mg/L)。

实施例4.在更大规模下，酸混合物提高来自博德特氏菌属培养物的上清液中的PRN和FIM2/3产量。

为了确保硝酸和磷酸的混合物的影响不是小规模培育的假象，在20L和200L两个生物反应器规模下都进行了实验。在20L规模下，在500mL摇瓶中开始种子繁殖，并且培育44小时，所述摇瓶含有100mL补充有100x生长因子溶液(表4)的改良的Stainer-Scholte培养基(表3)。此第一烧瓶用于接种4个2L烧瓶，并且培育44小时，所述2L烧瓶含有500mL补充有100x生长因子溶液(表4)的改良的Stainer-Scholte培养基(表3)。这些第二烧瓶用于接种20L

所有培育参数都以与2L烧瓶相似的方式控制，并且使用相同的试剂，除了消泡剂是以较高浓度使用的。在20L生物反应器运行中，使用含有0、40％和100％(v/v)3.5M硝酸并且剩余部分为2.5M磷酸的溶液控制pH。

在200L规模下，在250mL摇瓶中开始种子繁殖，所述摇瓶使用100mL补充有100x生长因子溶液(表4)的改良的Stainer-Scholte培养基(表3)。此第一烧瓶用于接种4L烧瓶，之后在20L和200L生物反应器中传代，所述4L烧瓶含有1L补充有100x生长因子溶液(表4)的改良的Stainer-Scholte培养基(表3)。200L生物反应器的工作体积为160L。所有培育参数都以与2L烧瓶相似的方式控制，并且使用相同的试剂，除了消泡剂是以较高浓度使用的。在200L生物反应器运行中，使用含有0和40％(v/v)7M硝酸并且剩余部分为5M磷酸的溶液控制pH。

图4A显示，收获物上清液中的PRN产量在20L和200L两个规模下随着用于pH控制的硝酸的比率的增加以类似于在2L规模下产生的结果的方式增加。在20L和200L规模下的这些实验中，当100％2.5M和5M磷酸用于pH控制时，PRN产量是5-7mg/L；当40％(v/v)3.5M和7M硝酸分别与剩余部分为2.5M和5M磷酸混合并且用于pH控制时，增加至11-13mg/L；并且当100％3.5M硝酸在20L规模下用于pH控制时，增加至16mg/L。

另外，图4B确认了当40％(v/v)7M硝酸并且剩余部分为5M磷酸对比100％2.5M磷酸用于pH控制时，200L收获物的上清液中的FIM2/3增加(9.9mg/L对比5.0mg/L)。

还使用从2000L制造过程按比例缩小的生物反应器、初步回收和纯化过程在20L和200L两个规模下从收获的上清液中纯化PRN并且使用不同的分析方法表征。表6中的20L材料汇总显示，当与来自相同规模下的对照运行(100％2.5M磷酸)的PRN或使用2000L制造过程(其也使用100％2.5M磷酸用于pH控制)产生的PRN两者相比时，当使用酸混合物(40％硝酸/60％磷酸)时，纯化的PRN的质量(当使用多种不同的分析方法表征时)没有实质不同。

表6：与来自2,000L制造过程(IO批次)的纯化的材料相比，使用100％2.5M磷酸(对照)和酸混合物(40％硝酸/60％磷酸)用于生物反应器pH控制的20L生物反应器过程的纯化的PRN的表征。

尽管已经在说明书中描述了一个或多个示例性实施方案，但是本领域普通技术人员将理解，在不背离如由所附权利要求所定义的发明构思的精神和范围的情况下，可以在其中进行各种形式和细节的变化。