一种基因靶向治疗的纳米马达-水凝胶体系制备方法

摘要

本发明是一种基因靶向治疗的可注射高细胞摄取纳米马达‑水凝胶体系的制备方法。将铂纳米粒子溶液滴在基底上，烘干；将基底浸泡在聚乙烯亚胺溶液中,将基底取出,使用超纯水清洗多次,将基底浸泡在聚苯乙烯磺酸钠溶液中,将基底取出,超纯水清洗多次；反复多次重复上述步骤，在铂纳米粒子表面组装聚乙烯亚胺和聚苯乙烯磺酸钠，在最外层组装叶酸修饰的聚乙烯亚胺；利用超声将纳米载体分散在无霉无菌水中，通过静电作用将小分子干扰RNA连接在纳米载体上，得到纳米马达；将壳聚糖溶液和含有纳米马达的双醛淀粉溶液混合完成制备。本发明提高了细胞摄取性能与细胞留存时间，达到更好的基因靶向治疗效果。本发明方法简单有效，操作简便，且所需时间较短。

说明书

技术领域

本发明涉及基因靶向治疗技术领域，具体涉及一种基因靶向治疗的可注射高细胞摄取纳米马达-水凝胶体系的制备方法。

背景技术

根据国际癌症研究机构的调查，癌症有可能成为21世纪全球死亡的主要原因。如今，癌症的主要治疗方法包括手术治疗、放射疗法和化学疗法。但是这些疗法具有局限性，例如术后肿瘤细胞残留和耐药性。而基因疗法是解决这些问题的一种方法。小分子干扰RNA是基因疗法中常用的一种治疗剂。它可以降低基因表达从而导致细胞凋亡。但是裸露的小分子干扰RNA由于其亲水性和电负性难以进入细胞。因此开发了各种纳米载体用于运输小分子干扰RNA。

作为一种特别的纳米载体，纳米马达备受关注。纳米马达是一种可以将其他形式的能量转化成动能，从而实现自我驱动的纳米材料。目前已开发出多种驱动的纳米马达，例如光驱动、化学驱动、场驱动等。纳米马达的自驱动可以增加其与细胞的接触几率，减少接触所需时间。因此将纳米马达用于小分子干扰RNA的运输可以增加其细胞摄取效率。

本发明利用水凝胶的可注射性使得纳米马达可以直接到达肿瘤部位，减少了小分子干扰RNA被分解的可能性。同时水凝胶的响应性释放增加了纳米马达的留存时间。其次纳米马达的自驱动性能使其可以更快更多的进入细胞，达到更好的细胞摄取效果。因此通过该方法制备的纳米马达-水凝胶体系在可注射和高细胞摄取的条件下可以实现更好的基因靶向治疗效果。

发明内容

技术问题：本发明的目的是提供一种基因靶向治疗的可注射高细胞摄取纳米马达-水凝胶体系的制备方法，该方法结合水凝胶的可注射性、响应性释放和纳米马达的自驱动等提高了小分子干扰RNA的细胞摄取性能与细胞留存时间，可以达到更好的基因靶向治疗效果。

技术方案：本发明公开了一种基因靶向治疗的可注射高细胞摄取纳米马达-水凝胶体系的制备方法。水凝胶的可注射性使得纳米马达可以直接到达肿瘤部位，减少了小分子干扰RNA被分解的可能性。同时水凝胶的响应性释放增加了纳米马达的留存时间。其次纳米马达的自驱动性能使其可以更快更多的进入细胞，达到更好的细胞摄取效果。因此通过该方法制备的纳米马达-水凝胶体系在可注射和高细胞摄取的条件下可以实现更好的基因靶向治疗。

本发明的一种基因靶向治疗的可注射高细胞摄取纳米马达-水凝胶体系的制备方法包括如下步骤：

步骤一. 首先将铂纳米粒子溶液滴在基底上，烘干；

步骤二. 再将基底浸泡在聚乙烯亚胺溶液中，将基底取出,使用超纯水清洗若干次，之后将基底浸泡在聚苯乙烯磺酸钠溶液中，将基底取出，使用超纯水清洗若干次；

步骤三. 若干次重复上述步骤二，在铂纳米粒子表面组装聚乙烯亚胺和聚苯乙烯磺酸钠，并在最外层组装叶酸修饰的聚乙烯亚胺，得到纳米载体；

步骤四.利用超声将纳米载体分散在无霉无菌水中，通过静电作用将小分子干扰RNA连接在纳米载体上，得到纳米马达；

步骤五.将壳聚糖溶液和含有纳米马达的双醛淀粉溶液混合，制备得到一种基因靶向治疗的可注射高细胞摄取纳米马达-水凝胶体系。

步骤二中浸泡时间为2-10 min。

所述铂纳米粒子溶液的浓度为：0.1 mg/mL- 20 mg/mL，聚乙烯亚胺溶液和聚苯乙烯磺酸钠溶液的浓度为：1 mg/mL- 5 mg/mL。

步骤三中重复次数为3-20个周期。

步骤四中连接反应1-4小时。

步骤五中所述壳聚糖溶液的浓度为：30 mg/mL- 80 mg/mL，双醛淀粉溶液的浓度为：15 mg/mL- 35 mg/mL，纳米马达的浓度为1 mg/mL- 5 mg/mL。

有益效果：

1. 水凝胶的可注射性使得纳米马达可以直接到达肿瘤部位，减少了小分子干扰RNA被分解的可能性。同时水凝胶的响应性释放增加了纳米马达的留存时间。

2. 纳米马达的自驱动性能使其可以更快更多的进入细胞，达到更好的细胞摄取效果。

3. 纳米马达-水凝胶体系在可注射和高细胞摄取的条件下可以达到更好的基因靶向治疗效果。

4. 选用的材料都是生物相容性较好的材料，制备出的纳米马达-水凝胶体系具有较低的细胞毒性和一定的生物可降解性能。

附图说明

图1是实施例1制备出的纳米马达-水凝胶体系的扫描电子显微镜图。

图2是实施例1制备出的纳米马达-水凝胶体系的抗癌活性结果图。

具体实施方式

下面对本发明做更进一步地解释。下列实施例仅用于说明本发明，但并不用来限定本发明的实施范围。

本发明的一种基因靶向治疗的可注射高细胞摄取纳米马达-水凝胶体系的制备方法，包括如下步骤：

步骤一. 首先将铂纳米粒子溶液滴在基底上，烘干；

步骤二. 再将基底浸泡在聚乙烯亚胺溶液中，将基底取出，使用超纯水清洗多次，之后将基底浸泡在聚苯乙烯磺酸钠溶液中，将基底取出，使用超纯水清洗多次；

步骤三. 反复多次重复步骤二，在铂纳米粒子表面组装聚乙烯亚胺和聚苯乙烯磺酸钠，并在最外层组装叶酸修饰的聚乙烯亚胺，得到纳米载体；

步骤四.利用超声将纳米载体分散在无霉无菌水中，通过静电作用将小分子干扰RNA连接在纳米载体上，得到纳米马达；

步骤五.将壳聚糖溶液和含有纳米马达的双醛淀粉溶液混合制备得到一种基因靶向治疗的可注射高细胞摄取纳米马达-水凝胶体系。

步骤六. 检测纳米马达-水凝胶体系的细胞摄取效率和抗癌活性。

实施例1：

将3 mg/mL的铂纳米粒子溶液滴在基底上，烘干；再将基底浸泡在3 mg/mL聚乙烯亚胺溶液中5 min，将基底取出，使用超纯水清洗3次，之后将基底浸泡在3 mg/mL聚苯乙烯磺酸钠溶液中5 min，将基底取出，使用超纯水清洗3次；重复步骤15次，在铂纳米粒子表面组装聚乙烯亚胺和聚苯乙烯磺酸钠，并在最外层组装叶酸修饰的聚乙烯亚胺，得到纳米载体；利用超声将纳米载体分散在无霉无菌水中（浓度3 mg/mL），并与5 mM小分子干扰RNA在冰浴中反应1小时，得到纳米马达；将40 mg/mL壳聚糖溶液和17 mg/mL双醛淀粉溶液（含有3mg/mL纳米马达）混合制备得到一种基因靶向治疗的可注射高细胞摄取纳米马达-水凝胶体系。检测纳米马达-水凝胶体系的细胞摄取效率和抗癌活性。

图1为本实施例制备出的制备出的纳米马达-水凝胶体系的扫描电子显微镜图。从图中可以观察到纳米马达尺寸约为70 nm，且被负载到了水凝胶中，成功制备了纳米马达-水凝胶体系。

图 2为本实施例制备出的制备出的纳米马达-水凝胶体系的抗癌活性图。从图中可以发现对比单纯的水凝胶和直接负载小分子干扰RNA的水凝胶，纳米马达-水凝胶体系具有最高的抗癌活性。在与癌细胞共培育72 h后，仅有25.2%的癌细胞存活。

实施例2：

将1 mg/mL的铂纳米粒子溶液滴在基底上，烘干；再将基底浸泡在2 mg/mL聚乙烯亚胺溶液中5 min，将基底取出，使用超纯水清洗3次，之后将基底浸泡在2 mg/mL聚苯乙烯磺酸钠溶液中5 min，将基底取出，使用超纯水清洗3次；重复步骤10次，在铂纳米粒子表面组装聚乙烯亚胺和聚苯乙烯磺酸钠，并在最外层组装叶酸修饰的聚乙烯亚胺，得到纳米载体；利用超声将纳米载体分散在无霉无菌水中（浓度3 mg/mL），并与5 mM小分子干扰RNA在冰浴中反应1小时，得到纳米马达；将40 mg/mL壳聚糖溶液和20 mg/mL双醛淀粉溶液（含有3mg/mL纳米马达）混合制备得到一种基因靶向治疗的可注射高细胞摄取纳米马达-水凝胶体系。检测纳米马达-水凝胶体系的细胞摄取效率和抗癌活性。

实施例3：

将5 mg/mL的铂纳米粒子溶液滴在基底上，烘干；再将基底浸泡在4 mg/mL聚乙烯亚胺溶液中10 min，将基底取出，使用超纯水清洗3次，之后将基底浸泡在4 mg/mL聚苯乙烯磺酸钠溶液中10 min，将基底取出，使用超纯水清洗3次；重复步骤8次，在铂纳米粒子表面组装聚乙烯亚胺和聚苯乙烯磺酸钠，并在最外层组装叶酸修饰的聚乙烯亚胺，得到纳米载体；利用超声将纳米载体分散在无霉无菌水中（浓度5 mg/mL），并与10 mM小分子干扰RNA在冰浴中反应2小时，得到纳米马达；将30 mg/mL壳聚糖溶液和17 mg/mL双醛淀粉溶液（含有5mg/mL纳米马达）混合制备得到一种基因靶向治疗的可注射高细胞摄取纳米马达-水凝胶体系。检测纳米马达-水凝胶体系的细胞摄取效率和抗癌活性。