烟台黑猪SLA-2基因真核表达细胞系的构建及表达

摘要

烟台黑猪SLA‑2基因真核表达细胞系的构建及表达，属于基因领域。本发明选择烟台黑猪为研究对象，在实验室前期已经成功构建烟台黑猪SLA‑2‑YT/pMD18‑T全基因克隆表达载体的工作基础上，构建烟台黑猪SLA‑2‑YT编码区基因的真核表达载体，并使其在sT2细胞系中高度表达，为探究烟台黑猪SLA‑2‑YT基因的遗传特性、蛋白功能活性及表位递呈规律等奠定基础。

说明书

技术领域

本发明属于基因领域，具体涉及烟台黑猪SLA-2基因真核表达细胞系的构建及表达。

背景技术

主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)是染色体上由高度多态、紧密连锁的基因座位组成的一个遗传区域，上世纪40年代，Snell等人在对近交系小鼠进行免疫试验时首先发现了MHC基因，自此，与MHC相关的研究引起了科技工作者的兴趣

参考文献：

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发明内容

针对上述不足本发明选择烟台黑猪为研究对象，在实验室前期已经成功构建烟台黑猪SLA-2-YT/pMD18-T全基因克隆表达载体的工作基础上，构建烟台黑猪SLA-2-YT编码区基因的真核表达载体，并使其在sT2细胞系中高度表达，为探究烟台黑猪SLA-2-YT基因的遗传特性、蛋白功能活性及表位递呈规律等奠定基础。

本发明烟台黑猪SLA-2基因真核表达细胞系的构建及表达步骤如下：

(1)引物的设计与合成；

(2)目的基因PCR扩增与DNA片段回收；

(3)烟台黑猪SLA-2编码区基因TA克隆载体的构建；

(4)烟台黑猪SLA-2编码区基因真核表达载体的构建；

(5)嘌呤霉素终浓度测定；

(6)慢病毒包装；

(7)慢病毒感染sT2细胞及抗性筛选；

(8)Western Blotting检测外源基因的表达；

(9)统计学处理。

有益效果：本发明成功构建了SLA-2-YT/pCDH重组真核表达载体，并成功转染至sT2细胞，使其在sT2细胞中高度表达，为研究外源SLA-2-YT在sT2细胞中的抗原递呈规律及CTL多肽表位筛选奠定了基础。

附图说明

图1为SLA-2-YT/pCDH重组表达质粒示意图。

图2为烟台黑猪SLA-2-YT基因CDS区PCR扩增与加尾。

图3为重组质粒SLA-2-YT/pMD19-T Simple双酶切鉴定。其中M:DNA Marker 2000；1-7:重组质粒SLA-2-YT/pMD19-T Simple双酶切产物。

图4为VectorNTI 11.5分析SLA-2-YT/pMD19-T Simple真核表达载体序列。

图5为pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro载体回收图。其中M:DNA Marker 10000；1：pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro载体经Xba I和Not I双酶切后的回收产物

图6为重组质粒SLA-2-YT/pCDH双酶切鉴定。其中M:DNA Marker 10000；1～3:重组质粒SLA-2-YT/pCDH双酶切产物

图7为嘌呤霉素作用于sT2细胞的致死浓度曲线。X轴为嘌呤霉素作用的浓度，Y轴不同浓度对应孔板中活细胞的数量

图8为光学显微镜下实验所用细胞及慢病毒感染后的细胞。其中A为PK15细胞，B为sT2细胞，C为转染空载体pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro的sT2细胞，D为转染SLA-2-YT/pCDH的sT2细胞。

图9为Western Blotting检测SLA-2-YT/pCDH在sT2细胞中的表达图。A为WesternBlotting检测结果；B为相对IOD值统计分析结果。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明，主要材料、试剂与仪器如下：

(1)菌株、载体和细胞

烟台黑猪SLA-2-YT/pMD18-T菌种、psPAX2菌种、pMD2.G菌种由本实验室保存；pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro真核表达载体菌种购自中国上海思享生物科技有限公司；pMD19-TSimple Vector和Escherichia coli.Top10菌种购自宝生物工程(大连)有限公司；Stbl 3感受态细胞购自北京全式金生物科技有限公司；人胚胎肾上皮细胞(HEK-293T)由大连医科大学李文哲教授课题组惠赠；猪肾上皮细胞(PK15)购自中国兽医监测所微生物菌种保藏管理中心并由本实验室保存；sT2细胞由本实验室在前期工作中利用CRISPR/Cas9技术将PK15细胞的Tap转运蛋白基因(Tap1、Tap2)敲除后获得并保存。

(2)主要试剂

胰蛋白胨、氯化钠、酵母提取物、琼脂粉、琼脂糖、牛血清白蛋白V、SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒、SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒购自上海生工生物工程有限公司；

(3)主要仪器

不同规格的移液器购自Eppendorf公司；梯度PCR仪购自基因有限公司；DYY-2C型电泳仪、DYCP-31DN型琼脂糖水平电泳仪、WD-9403C型紫外分析仪、DYCZ-24DN型迷你双垂直电泳仪、DYCZ-40D型迷你转印电泳仪购自北京市六一仪器厂；高速离心机购自ThermoFisher SIENTIFIC；

实施例1

(1)引物的设计与合成

根据GeneBank数据库中烟台黑猪SLA-2-YT编码区(coding sequence,CDS)基因序列(GeneBank序列号:AB672508.1)，遵守引物设计原则，使用Vector NTI 11.5和Oligo 7软件，设计1对扩增烟台黑猪SLA-2基因编码区序列的特异性正、反向寡核苷酸引物(上下游引物)，根据pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro载体的序列和结构特点，选择的限制性内切酶为：Xba I和Not I，在上下游引物的5’端分别添加酶切位点和保护性碱基，引物信息见表1，引物由上海生工生物工程有限公司合成。

表1 PCR引物信息

下划线：内切酶酶切位点；阴影：保护性碱基

(2)目的基因PCR扩增与DNA片段回收

以SLA-2-YT/pMD18-T质粒为模板，以pSLA-2-YT-F/pSLA-2-YT-R作引物，用

(3)烟台黑猪SLA-2编码区基因TA克隆载体的构建

将回收的目的条带与pMD19-T Simple Vector连接，反应体系为：pMD 19-TSimple Vector，0.5μL；加PolyA尾回收产物，9.5μL；Solution I,10μL；条件为：16℃低温水浴2小时。将连接产物转化至Escherichia coli.Top10感受态细胞，涂平板，37℃过夜培养，挑取生长良好的重组单克隆菌落扩大培养后进行质粒提取，将提取的重组质粒用Not I/Xba I进行双酶切验证，选择初步鉴定正确的阳性克隆菌送至上海生工生物工程有限公司测序。通过双向DNA测序确认插入序列的完整性后，将测序正确的阳性克隆菌株命名为SLA-2-YT/pMD 19-T Simple，并保存菌种供后期实验使用。

(4)烟台黑猪SLA-2编码区基因真核表达载体的构建

从超低温冰箱取出SLA-2-YT/pMD19-T Simple和pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro菌种，经平板划线、挑取单菌落培养过后，用DNA质粒小提中量试剂盒提取质粒，并用琼脂糖凝胶电泳检测。对SLA-2-YT/pMD19-T Simple质粒进行Not I/Xba I双酶切处理，回收目的条带；对真核表达载体pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro质粒(环状)同样进行Not I/Xba I双酶切处理，使载体线性化，并回收载体条带。将目的条带与载体条带用T4 DNA连接酶连接，反应体系为：目的条带，15μL(μg)；载体条带，0.5μL(μg)；超纯水，1.5μL；条件为：45℃水浴5min,立即冰浴2min.然后向反应液中加入10×T4 DNA Ligase Buffer,2μL；T4 DNALigase，1μL；混匀后在16℃低温水浴中过夜放置。连接产物转化至Stbl 3感受态细胞中，涂布在含有氨苄青霉素(AMP

(5)嘌呤霉素终浓度测定

复苏的sT2细胞传代两次待细胞状态稳定后，以每孔4×10

(6)慢病毒包装

将冻存的HEK-293T细胞复苏，传代两次待细胞状态稳定后进行慢病毒包装前的细胞铺板，每个60mm培养皿接种1.5×10

(7)慢病毒感染sT2细胞及抗性筛选

根据文献及最佳感染复数(multiple ofinfection,MOI)值计算公式：MOI值＝病毒滴度(TU/mL)×病毒体积(mL)/细胞个数，设定MOI值梯度为2.5、5、10、20、40、60，分别进行病毒感染预实验，确定感染sT2细胞的最佳MOI值范围。将冻存的sT2细胞复苏，传代2次后进行慢病毒感染前的细胞铺板，状态良好的细胞以每孔1.5×10

(8)Western Blotting检测外源基因的表达

复苏PK15、sT2两个细胞株，传代两次待细胞状态稳定，使用RIPA细胞裂解液分别提取PK15、sT2和1.2.7中筛选得到的pCDH/sT2、SLA-2-YT-pCDH/sT2细胞总蛋白，采用BCA法测定蛋白浓度，然后将蛋白原液、超纯水和5×蛋白上样缓冲液按比例混匀后煮沸5～10min,制成终浓度为30μg/μL的蛋白溶液样品，分别取10μL样品进行SDS-PAGE电泳，电泳结束后参考预染Marker进行切胶并将蛋白转印到PVDF膜上，转膜结束后，使用1×丽春红染液染色，确认转膜成功后参考预染Marker切割目的条带和内参GAPDH条带，用5％BSA溶液在室温下封闭1h，除去封闭液后，含目的条带的膜中加入稀释(视抗体推荐倍数稀释)的小鼠抗SLA-1-HB01单克隆抗体，含GAPDH条带的膜加入稀释的小鼠抗GAPDH单克隆抗体，室温孵育1h,再4℃孵育过夜，去除抗体溶液，用1×TBST溶液洗膜4次，每次5min,彻底洗去未与蛋白结合的一抗，分别加入稀释的HRP标记的山羊抗小鼠IgG，室温孵育1h，然后用1×TBST洗膜4次，每次5min,最后采用超敏ECL化学发光试剂盒进行显色，通过GEAI600多功能超灵敏成像仪进行显影成像，以检测sT2细胞中pCDH及SLA-2-YT-pCDH的表达量。

(9)统计学处理

采用Image J软件分析Western Blotting杂交条带的累积光密度值(IOD)，计算目的蛋白的相对光密度值(目的条带的IOD值与内参GAPDH的IOD值之比)，然后采用GraphPadPrism 8.0.1软件对数据进行单因素方差分析。

结果：

(1)烟台黑猪SLA-2-YT CDS区基因PCR扩增及加尾

利用引物pSLA-2-YT-F/pSLA-2-YT-R对烟台黑猪SLA-2-YT基因编码区进行PCR扩增，PCR产物用1.0％琼脂糖凝胶进行电泳并回收，回收产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，经凝胶成像仪成像，结果(图2A)显示扩增的目的基因条带大小约为1100bp，与理论设计值1104bp相符，表明目的基因被成功扩增。PCR回收产物加PolyA尾并回收，经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，结果(图2B)显示回收产物大小约1100bp，表明加PloyA尾产物也回收成功。

A为烟台黑猪SLA-2-YT基因CDS区PCR扩增产物的检测图，M：DNA Marker 2000；1：SLA-2-YT基因CDS区的PCR扩增产物，参照Marker可知目的条带大小约1100bp(理论设计值为1104bp)；B为PCR扩增产物加PolyA尾后的回收产物检测图，M：DNA Marker 2000；1：PCR扩增产物经加尾后的回收产物，参照Marker可知目的条带大小约为1100bp(理论设计值为1104bp)

(2)SLA-2-YT/pMD19-T Simple克隆表达载体鉴定

重组质粒SLA-2-YT/pMD19-T Simple限制性双酶切鉴定

利用Xba I、Not I限制性内切酶对SLA-2-YT/pMD19-T Simple质粒进行双酶切鉴定，1％琼脂糖凝胶电泳检测，根据结果(图3)可以看出：每个样品的泳道上均有两个条带，靠近点样孔端的条带为载体带，大小约为2692bp，离点样孔较远的条带为目的条带，大小约为1100bp，1～7号样品的载体条带大小正确，即1～7号样品可能为成功构建的克隆质粒，将对应的三个菌株送去生物公司测序，测序结果经分析后显示1、2号菌株的序列正确，即1、2号为成功构建的重组克隆表达菌株。

序列分析

SLA-2-YT/pMD19-T Simple经核酸序列测序后，用Vector NTI 11.5进行序列比对，结果(图4)显示SLA-2-YT/pMD19-T Simple重组克隆表达载体中插入的SLA-2-YT编码区基因序列与原序列100％同源,没有出现核苷酸突变。

(3)SLA-2-YT/pCDH真核表达载体鉴定

重组质粒SLA-2-YT/pCDH限制性双酶切鉴定

真核表达载体pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro质粒首先经限制性内切酶Xba I、Not I双酶切后进行胶回收，0.8％琼脂糖凝胶电泳结果(图5)显示回收的条带大小约为7300bp，与理论值7384bp相符，表明载体回收成功。SLA-2-YT/Pmd 19-T Simple质粒经双酶切并回收目的基因后，与真核表达载体在T4 DNA Ligase的作用下连接，导入Stbl 3感受态细胞经转化、挑取单菌落扩大培养后，再次进行双酶切鉴定，经0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，结果(图6)显示：每个样品的泳道上均有两个条带，靠近点样孔端的条带为载体带，大小约为7384bp，离点样孔较远的条带为目的条带，大小约为1100bp，1～3号样品的载体条带和目的条带的大小正确。为进一步确定目的基因与真核表达载体连接成功与否，将对应的3个菌株送去生物公司测序，测序结果经分析后显示2、3号菌株的序列正确，表明基因插入成功，即2、3号为成功构建的重组真核表达菌株。

序列分析

SLA-2-YT/pCDH进行核酸序列测定后，经VectorNTI 11.5进行序列比对，证实SLA-2-YT/pCDH重组真核表达载体中插入的SLA-2-YT编码区基因序列与原序列的同源性仍为100％，没有出现核苷酸突变，能够正确编码对应的蛋白。

(4)嘌呤霉素最佳浓度筛选

通过不同浓度的嘌呤霉素作用于转染的sT2细胞，168h后对存活细胞使用血球计数板计数。结果(图7)显示：不加嘌呤霉素的孔板内的细胞正常增殖，由于孔板底面积有限，细胞增殖数目受到限制；而添加了嘌呤霉素的孔板中的细胞增殖在不同程度上被抑制。各孔板中的细胞由于嘌呤霉素的浓度不断增大，出现了不同程度的死亡现象，直至500μg/mL对应孔板中细胞无存活。

(5)HEK-293T细胞慢病毒包装及感染sT2细胞

将携带SLA-2-YT的质粒和两种包装质粒共同转染HEK-293T细胞后，成功包装出慢病毒质粒。通过不同浓度的病毒液感染HEK-293T细胞，测得病毒滴度约为1×10

(6)Western Blotting检测SLA-2-YT/pCDH表达

以PK15细胞系为阳性对照，转染空载体pCDH的sT2细胞为阴性对照，未转染SLA-2-YT/pCDH质粒的sT2细胞系为空白对照，通过Western Blotting实验检测SLA-2-YT/pCDH的表达情况。结果(图9)表明，筛选出的4株细胞，与sT2、pCDH/sT2相比较，3号细胞株的SLA-2-YT基因得到了高丰度表达，大小约为45kDa，与理论值相符。用Image J软件分析累积光密度值后计算目的蛋白的相对表达量，用GraphPad Prism 8.0.1作图并通过计算得出PK15细胞、sT2细胞、pCDH/sT2细胞、SLA-2-YT-pCDH/sT23号细胞株的相对表达量之间差异显著(P<0.01)。表明插入载体的SLA-2-YT已在sT2细胞中成功表达，且表达量较高。

本研究使用的pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro载体是慢病毒载体系统，载体序列上有多个限制性内切酶位点，可在PCR引物上添加酶切位点利于目的基因与真核表达载体连接，它还具有氨苄青霉素抗性，筛选标记为嘌呤霉素，便于前期单克隆菌株的扩大培养和质粒转染后的细胞筛选；选择Stbl 3菌株作为真核表达载体的宿主菌，它是慢病毒载体系统优良的宿主菌株，其基因组中含有重组酶recA13突变，可有效抑制长片段末端重复区的重组，降低错误重组的概率。MHC I类分子在体内负责将抗原多肽递呈到细胞表面进而激活T淋巴细胞。经典的抗原递呈理论认为外源性抗原被MHC II类分子递呈到细胞表面激活CD4

上述实施例只是用于对本发明的举例和说明，而非意在将本发明限制于所描述的实施例范围内。此外本领域技术人员可以理解的是，本发明不局限于上述实施例，根据本发明的教导还可以做出更多种的变型和修改，这些变型和修改均落在本发明所要求保护的范围内。